短时超高温处理肿瘤细胞对MMC和5-FU的反应
作者：汪训实 王润邦 张兆林 曹庭嘉 金炜东
单位：广州军区武汉总医院普通外科 湖北省武汉市 430070
关键词：高温；化疗；肿瘤；细胞培养
世界华人消化杂志990709
摘 要
目的 探讨经47℃ 20min短时超高温处理后，胃癌细胞和结肠癌细胞在体外的生长情况，并观察5-FU，MMC对肿瘤细胞的细胞毒效应.
方法 将人胃癌细胞株(Hs746T)、结肠癌细胞株(SW480)和新鲜肿瘤组织细胞，分别经43℃ 120min或47℃ 20min热处理后，进行体外细胞毒培养，培养中加入5-FU 100mg/L，MMC 100mg/L，按MTT法检测瘤细胞的生长抑制率，并与未经热处理的肿瘤细胞培养结果相比较.
, 百拇医药
结果 热处理可以明显抑制肿瘤细胞的生长，使肿瘤细胞对5-FU和MMC的敏感性增加；肿瘤细胞经47℃ 20min的短时超高温处理后，与43℃ 120min较长时间热处理后的培养结果相近似；热化疗对新鲜肿瘤组织细胞的生长抑制率与对肿瘤细胞株的生长抑制率相近似.
结论 47℃ 20min能达到时间长达120min，温度在43℃的杀伤肿瘤细胞的目的.
中国图书馆分类号 R735.2
Effect of short time heating with MMC and 5-FU on cancer cells
WANG Xun-Shi1, WANG Run-Bang2, ZHANG Zhao-Lin1, CAO Ting-Jia1 and JIN Wei-Dong1
, 百拇医药
Department of General Surgery, Chinese PLA Wuhan General Hospital, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Subject headings thermotherapy; tumor cell; cultured; MTT assay; fluorouracil
Abstract
AIM To study the effect of short time heating with MMC and 5-FU on cancer cells.
METHODS Ts746T, SW480 cells and fresh gastric cancer cells and fresh colon cancer cells were cultured with MMC and 5-FU after 43℃ treatment for 120 minutes or 47℃for 20 minutes. Their growth rates were measured with MTT assay.
, 百拇医药
RESULTS Heating treatment decreased the growth rates of the cancer cells and increased their sensitivity to MMC or 5-FU. The effect on cancer cells treated at 47℃ for 20 minutes was similar as at 43℃ for 120 minutes. The effect of heating on fresh cancer cells was also similar to that of Ts746T and SW480.
CONCLUSION Thermotherapy at 47℃ for 20 minutes might be used to kill the remained cancer cells during the operation for cancer, instead of 43℃ for 120 minutes.
, http://www.100md.com
0 引言
近年研究认为，高温治疗肿瘤是继手术、化疗、放疗之后的又一有效的方法[1]. 42℃～45℃持续120min，可以有效的杀伤肿瘤细胞[2]. 但是，若高于此温度界限，短于此作用时间的报道甚少. 因此，我们在证明47℃ 20min对正常细胞无明显影响后[3]，进一步观察，经47℃ 20min短时超高温处理后，肿瘤细胞株和新鲜肿瘤细胞在体外的细胞毒效应，为临床应用提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞株(Hs746T)和人结肠癌细胞株(SW480)由美国ATCC公司提供，培养基为RPMI 1640液及100mL/L小牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸和青霉素，在细胞复苏培养1wk后，备用. 新鲜肿瘤组织细胞：手术中分别取进展期胃癌10例、结肠癌10例，其中乳头状腺癌6例，管状腺癌4例， 粘液腺癌5例， 印戒细胞癌4例，淋巴肉瘤1例；包括未分化癌3例，低分化癌10例，中分化癌4例. 按我们即往的方法，将新鲜癌组织，在无菌操作下用Hanks液清洗，机械法制成细胞悬液，除去血细胞、纤维细胞及结缔组织. 用1g/L台盼蓝检查细胞活性数在70%以上者(瘤细胞数为109/L)，加入青霉素后作为培养标本[4]. 采用临床常用抗癌药MMC和5-FU，按每日常规剂量配制成试验浓度，并按有关公式计算出药物浓度：MMC 100mg/L，5-FU 100mg/L. 将上述细胞悬液分别加入三块无菌96孔培养平板中，即分为3组：①无热处理组，按常规细胞培养，不做热处理；②43℃ 120min处理组，将培养板置于43℃恒温水浴箱，水浴120min；③47℃ 20min组，将培养板置于47℃水浴箱，水浴20min.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 MTT试验 按我们以往的方法[4]，将5-FU，MMC按上述药物浓度配制后，加入含细胞悬液的孔培养板中，以无细胞培养液孔作为空白对照(调仪器零点)，以有肿瘤细胞无药物孔作为阴性对照孔，每个条件均设3个复孔. 在37℃ 50mL/L CO2下培养72h，加入MTT磷酸缓冲液(MTT为Sigma公司产品)后，继续培养4h，以酸化异丙醇中止反应，用酶联免疫检测仪测各孔A(OD550).
1.2.2 细胞抑制率 取3个复孔光密度的平均值，作为细胞在此处理组中的光密度值. 以各孔光密度平均值与有细胞无药阴性对照孔光密度的百分比，作为细胞抑制率，即：
统计学处理 各组细胞生长率做方差分析，当P<0.05时，认为有显著性差异.
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞株的培养
2.1.1 无热处理组 MMC和5-FU对未经高温处理的胃癌细胞株(Hs746T)的抑制率分别是32.0%±1.3%和28.6%±2.7%(表1)；对结肠癌细胞株(SW480)的抑制率分别是31.0%±2.0%和32.4%±6.3%，无药对照孔的抑制率为0(表2).
表1 热处理对两种胃癌细胞的抑制率 (
±s,%) 分 组
药物 p/mg.L-1
0
MMC
, 百拇医药
5-FU
无热处理组
细胞株
0
32.0±1.3
28.6±2.7
新鲜细胞
43℃120min处理组
0
12.1±2.0
32.0±1.3
细胞株
32.2±1.4a
, 百拇医药
55.8±4.2
54.7±2.6a
新鲜细胞
47℃20min处理组
25.2±2.0a
38.0±6.0a
34.1±3.4
细胞株
32.6±3.7a
53.1±3.1
52.5±3.4a
, 百拇医药
新鲜细胞
30.6±1.3a
40.1±3.7a
44.8±1.8
aP<0.05，F检验，vs无热处理.
表2 热处理对结肠癌细胞的抑制 (±s,%) 分 组
药物 p/mg.L-1
0
MMC
, 百拇医药
5-FU
无热处理组
细胞株
0
31.0±2.0
32.4±6.3
结肠癌
43℃120min处理组
0
24.5±2.2
30.4±3.7
细胞株
23.6±4.2a
, http://www.100md.com
49.8±3.4a
54.2±4.6a
结肠癌
47℃20min处理组
19.3±5.5a
38.4±5.5
33.2±7.4
细胞株
25.2±3.0a
46.7±2.8a
47.8±5.2a
, http://www.100md.com
结肠癌
21.7±4.1a
41.0±3.3a
40.9±5.2
aP<0.05，F检验，vs无热处理.
2.1.2 43℃ 120min处理组 ①对胃癌细胞株(Hs746T)经43℃ 120min处理后，胃癌细胞株(Hs746T)无药物阴性对照孔的抑制率为29.4%±2.0%，与无热处理胃癌细胞株相比具有显著性(P<0.05)；经热处理后，MMC和5-FU对胃癌细胞株的抑制率分别为55.8%±4.2%和54.7%±2.6%，与无热处理组比较均有显著性(P<0.05，表1). ②结肠癌细胞株(SW480)的生长抑制率为23.6%±4.2%，明显高于无热处理组(P<0.05)；MMC和5-FU对结肠癌细胞株的抑制率均有不同程度增加，分别是49.8%±3.4%和54.2%±4.6%，与无热处理组相比P<0.05(表2).
, 百拇医药
2.1.3 47℃ 20min处理组 ①经47℃ 20min处理后，胃癌细胞株(Hs746T)无药阴性对照孔的抑制率32.6%±3.7%，明显高于无热处理组(P<0.05)，同时也略高于43℃ 120min组，但无统计学意义. 经此短时超高温处理后，MMC，5-FU对胃癌细胞株(Hs746T)的抑制率分别是53.1%±3.1%和52.5%±3.4%，与43℃ 120min热浴组培养结果相近似(P>0.05，表1). ②结肠癌细胞株(SW480)的生长抑制率为25.2%±3.0%，明显高于无热处理组(P<0.05)；MMC和5-FU的抑制率分别是46.7%±2.8%和47.8%±5.2%，与无热处理组相比P<0.05(表2)；但与43℃ 120min处理组相比无统计学意义(P>0.05).
2.2 新鲜肿瘤细胞的培养
2.2.1 未经高温处理组 MMC，5-FU对新鲜胃癌细胞的抑制率分别为12.1%±2.0%和32.0%±1.3%(表1)，对未经高温处理的新鲜结肠癌细胞的抑制率分别是24.5%±2.2%和30.4%±3.7%(表2). 两种细胞的无药对照孔的抑制率为0.
, 百拇医药
2.2.2 43℃ 120min处理组 经43℃热浴120min处理后培养，新鲜胃癌组织细胞无药物阴性对照孔的抑制率为25.2%±2.0%，与无热处理胃癌组织细胞相比具有显著性(P<0.05)；同时，MMC对胃癌细胞的细胞毒性增加，其抑制率为38.0%±6.0%，与无热处理组相比有显著性(P<0.05)；而5-FU的细胞毒性作用无明显变化(表1). 经43℃ 120min处理后，新鲜结肠癌组织细胞的生长抑制率为19.3%±5.5%，明显高于无热处理组(P<0.05). MMC和5-FU对新鲜结肠癌组织细胞的抑制率均有不同程度增加，分别是38.4%±5.5%和33.2%±7.4%，与无热处理组相比P<0.05(表2).
2.2.3 47℃ 20min处理组 经47℃热浴20min处理后培养，新鲜胃癌组织细胞无药对照孔的抑制率为30.6%±1.3%，明显高于无热处理组(P<0.05)；也略高于43℃ 120min组，但无统计学意义. 同时MMC，5-FU对胃癌的细胞毒作用与43℃ 120min热浴组培养结果相近似，新鲜胃癌组织细胞的生长抑制率分别为40.1%±3.7%和44.8%±1.8%. 与43℃ 120min组的培养结果比较，无统计学意义(P>0.05，表1). 经47℃ 20min处理后，新鲜结肠癌细胞的生长抑制率为21.7%±4.1%，明显高于无热处理组(P<0.05)；MMC和5-FU对新鲜结肠癌细胞的抑制率分别是41.0%±3.3%和40.9%±5.2%，与无热处理组相比P<0.05；但与43℃ 120min处理组相比无统计学意义(表2).
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3 讨论
我们选用胃癌细胞株(Hs746T)、结肠癌细胞株(SW480)和新鲜胃癌、结肠癌组织细胞，作为体外细胞毒培养的肿瘤细胞. 用细胞株可以避免来源于临床肿瘤组织中混杂的血细胞、结缔组织、及其他无关细胞，使试验结果稳定、可靠；而用新鲜肿瘤组织制成的细胞悬液，则更符合临床要求[4，5]. MTT是溴化二甲塞噻唑二苯四氮唑(3-4，5-dimethylthiazol-2-yl-2，5-diphentl tetrazolium bromide)的简写. MTT可被活细胞利用还原成蓝黑色甲瓒化合物，其产物可通过分光光度计测得. Carmichael证明[6]，MTT法与克隆形成法具有极好的相关性，并且在用于短期试验时，MTT法对某些药物更为敏感. Sargent et al[7]也证明，肿瘤细胞数与甲瓒的形成量呈线性关系. 因此MTT法作为细胞生长及存活的测定方法与其他方法相比，具有简便、快速、经济、安全等优点[4-7].
, 百拇医药
3.1 热处理的生物学效应 近年的研究表明，42℃～45℃持续120min，可明显杀伤肿瘤细胞[2]. 但是高于此温度界限，少于此作用时间范围，对肿瘤细胞的影响如何却少有研究. 因此我们选择临床热疗的常用温度和时间(43℃ 120min)以及有争议的温度和时间(47℃ 20min)作为试验条件[6，7]. 由于47℃明显高于正常体温，同时也高于临床常用的43℃；而作用时间仅20min，大大短于临床常用时间，故我们将此条件称为“短时超高温热处理”. 经热处理后再进行细胞毒培养，结果显示，无论是癌细胞株还是新鲜肿瘤组织细胞的生长抑制率均比未经热处理的癌细胞的生长抑制率明显增加，表明在无化疗药作用下，热处理可以明显抑制胃癌细胞和结肠癌细胞的生长(P<0.05). 另外热处理对癌细胞株的影响稍高于新鲜肿瘤组织细胞，但二者无显著性差异(P>0.05). 该试验还显示，肿瘤细胞经43℃ 120min处理后的培养结果，与47℃ 20min处理后的培养结果相近似，二者无统计学意义(P>0.05). 在加入MMC或5-FU培养后显示，这两种化疗药在常温下能明显抑制肿瘤细胞的生长. 而肿瘤细胞经43℃ 120min或47℃ 20min的热处理后，这两种抗癌药物对肿瘤细胞的细胞毒效应均有不同程度的增加，不论在哪一种温度和哪一段时间范围内，这两种化疗药物对癌细胞株的抑制率均在50%以上；对新鲜肿瘤细胞的抑制率也均在30%以上. 这是由于肿瘤细胞内含水量高、pH值低等不耐热的生物学特性所决定[8-10]. 然而尽管47℃超高温处理，但是由于作用时间较短(仅20min)，因而对肿瘤细胞的影响与43℃ 120min的热处理结果相近似.
, 百拇医药
3.2 肿瘤细胞株与新鲜肿瘤细胞的关系 该试验分别采用细胞株(Ts746T、SW480)和新鲜肿瘤组织细胞，作为MTT法体外细胞毒试验的研究对象，其结果显示，无论是这两种细胞常规培养的结果；还是经不同温度、不同时间的热处理后的培养结果均相近似，二者相比无显著性差异(P>0.05). 但是无论在哪一个条件下，瘤细胞株的生长抑制率均稍高于新鲜肿瘤组织细胞. 这可能是因为，瘤细胞株是一组去除一切无关细胞的纯肿瘤细胞，在做细胞培养时，只剩下对化疗药有敏感性的肿瘤细胞，这样就保证了试验结果的准确性、可靠性和稳定性；而新鲜肿瘤组织细胞由于没有完全纯化，尽管经过一系列处理，但是或多或少也含有一些正常的其他细胞. 因此在细胞培养时，这些残留的正常细胞对化疗药物不敏感，并不断生长，从而使新鲜肿瘤组织细胞的生长抑制率比瘤细胞株的结果偏低. 但是二者结果并无显著性差异，不影响对该试验结果的判断. 因此不少作者主张，在按MTT法做体外细胞毒试验时，采用新鲜肿瘤组织细胞作为研究对象，认为这样的结果更接近于临床[3-7].
, http://www.100md.com 作者简介：汪训实，男，1957-12-21生，湖北省武汉市人，汉族. 1982年重庆医科大学医疗系毕业，学士，1987年重庆医科大学获外科硕士. 现任广州军区武汉总医院普通外科副主任医师兼行政副主任，主要从事腹腔内肿瘤(包括肝脏肿瘤，胰腺肿瘤以及胃肠道肿瘤)的临床诊治研究，发表论文40篇，其中国际杂志4篇.
通讯作者 汪训实，430070，湖北省武汉市武珞路299号，广州军区武汉总医院普通外科.
Correspondence to:Prof. Wang Xun-Shi, Department of General Surgery, Chinese PLA Wuhan General Hospital, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Tel. +86.27.87879797 Ext.7636
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Chen JQ. Problems in improving the therapy of careinoma of the stomach and large intestine. Zhonghua Yixue Zazhi, 1995;5:453-454
2 Stewart JR, Gibbs FA: Hyperthermia in the treatment of cancer. Cancer, 1984;64:2823-2830
3 Wang XS, Wang RB, Zhang ZL, Zhou HR, Jing WD, Cao TJ. The research of cytotoxic effect of some antineoplastic drugs on gastric cancer cells after hyperthermia for short time. Zhonghua Liliao Zazhi, 1999;22:26-28
, 百拇医药
4 Xin HW, Wang RB. Study of the MTT colorimetric assay as arapid test of chemosensitivity in solid carcinoma cells. Zhongliu Fangzhi Yanjiu, 1993;20:254-255
5 Li ZX, Wei LH, Wang Y, Jing HY, Wang L. Prediction of the clinical response of ovarian cancer to chemotherapy by in vitro anticancer drug sensitivity test. Zhonghua Fucanke Zazhi, 1988;23:287-288
6 Carmichael J. Evaluation of a tetrazoliumbased semiautomated colorimetric assy: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res, 1987;47:936-940
, http://www.100md.com
7 Sargent JM, Taylor CG. Apprasisl of the MTT assay a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia. Br J Cancer, 1989;60:206-211
8 Chen LS. The clinical research on thermotherapy and chemotherapy in abdominal during operation for colon cancer. Aizheng, 1995;14:226-228
9 Li DJ, Hu ZX. Thermotherapy on tumor. Di yi ban: Changsha, Hunan Kexue Jishu Chubanshe, 1987:17
10 Yang YQ, Yang HC. The biological base about thermotherapy on tunor. Zhongliu, 1992;12:141
收稿日期 1999-03-05 修回日期 1999-06-02, 百拇医药
单位：广州军区武汉总医院普通外科 湖北省武汉市 430070
关键词：高温；化疗；肿瘤；细胞培养
世界华人消化杂志990709
摘 要
目的 探讨经47℃ 20min短时超高温处理后，胃癌细胞和结肠癌细胞在体外的生长情况，并观察5-FU，MMC对肿瘤细胞的细胞毒效应.
方法 将人胃癌细胞株(Hs746T)、结肠癌细胞株(SW480)和新鲜肿瘤组织细胞，分别经43℃ 120min或47℃ 20min热处理后，进行体外细胞毒培养，培养中加入5-FU 100mg/L，MMC 100mg/L，按MTT法检测瘤细胞的生长抑制率，并与未经热处理的肿瘤细胞培养结果相比较.
, 百拇医药
结果 热处理可以明显抑制肿瘤细胞的生长，使肿瘤细胞对5-FU和MMC的敏感性增加；肿瘤细胞经47℃ 20min的短时超高温处理后，与43℃ 120min较长时间热处理后的培养结果相近似；热化疗对新鲜肿瘤组织细胞的生长抑制率与对肿瘤细胞株的生长抑制率相近似.
结论 47℃ 20min能达到时间长达120min，温度在43℃的杀伤肿瘤细胞的目的.
中国图书馆分类号 R735.2
Effect of short time heating with MMC and 5-FU on cancer cells
WANG Xun-Shi1, WANG Run-Bang2, ZHANG Zhao-Lin1, CAO Ting-Jia1 and JIN Wei-Dong1
, 百拇医药
Department of General Surgery, Chinese PLA Wuhan General Hospital, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Subject headings thermotherapy; tumor cell; cultured; MTT assay; fluorouracil
Abstract
AIM To study the effect of short time heating with MMC and 5-FU on cancer cells.
METHODS Ts746T, SW480 cells and fresh gastric cancer cells and fresh colon cancer cells were cultured with MMC and 5-FU after 43℃ treatment for 120 minutes or 47℃for 20 minutes. Their growth rates were measured with MTT assay.
, 百拇医药
RESULTS Heating treatment decreased the growth rates of the cancer cells and increased their sensitivity to MMC or 5-FU. The effect on cancer cells treated at 47℃ for 20 minutes was similar as at 43℃ for 120 minutes. The effect of heating on fresh cancer cells was also similar to that of Ts746T and SW480.
CONCLUSION Thermotherapy at 47℃ for 20 minutes might be used to kill the remained cancer cells during the operation for cancer, instead of 43℃ for 120 minutes.
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0 引言
近年研究认为，高温治疗肿瘤是继手术、化疗、放疗之后的又一有效的方法[1]. 42℃～45℃持续120min，可以有效的杀伤肿瘤细胞[2]. 但是，若高于此温度界限，短于此作用时间的报道甚少. 因此，我们在证明47℃ 20min对正常细胞无明显影响后[3]，进一步观察，经47℃ 20min短时超高温处理后，肿瘤细胞株和新鲜肿瘤细胞在体外的细胞毒效应，为临床应用提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞株(Hs746T)和人结肠癌细胞株(SW480)由美国ATCC公司提供，培养基为RPMI 1640液及100mL/L小牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸和青霉素，在细胞复苏培养1wk后，备用. 新鲜肿瘤组织细胞：手术中分别取进展期胃癌10例、结肠癌10例，其中乳头状腺癌6例，管状腺癌4例， 粘液腺癌5例， 印戒细胞癌4例，淋巴肉瘤1例；包括未分化癌3例，低分化癌10例，中分化癌4例. 按我们即往的方法，将新鲜癌组织，在无菌操作下用Hanks液清洗，机械法制成细胞悬液，除去血细胞、纤维细胞及结缔组织. 用1g/L台盼蓝检查细胞活性数在70%以上者(瘤细胞数为109/L)，加入青霉素后作为培养标本[4]. 采用临床常用抗癌药MMC和5-FU，按每日常规剂量配制成试验浓度，并按有关公式计算出药物浓度：MMC 100mg/L，5-FU 100mg/L. 将上述细胞悬液分别加入三块无菌96孔培养平板中，即分为3组：①无热处理组，按常规细胞培养，不做热处理；②43℃ 120min处理组，将培养板置于43℃恒温水浴箱，水浴120min；③47℃ 20min组，将培养板置于47℃水浴箱，水浴20min.
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1.2 方法
1.2.1 MTT试验 按我们以往的方法[4]，将5-FU，MMC按上述药物浓度配制后，加入含细胞悬液的孔培养板中，以无细胞培养液孔作为空白对照(调仪器零点)，以有肿瘤细胞无药物孔作为阴性对照孔，每个条件均设3个复孔. 在37℃ 50mL/L CO2下培养72h，加入MTT磷酸缓冲液(MTT为Sigma公司产品)后，继续培养4h，以酸化异丙醇中止反应，用酶联免疫检测仪测各孔A(OD550).
1.2.2 细胞抑制率 取3个复孔光密度的平均值，作为细胞在此处理组中的光密度值. 以各孔光密度平均值与有细胞无药阴性对照孔光密度的百分比，作为细胞抑制率，即：
统计学处理 各组细胞生长率做方差分析，当P<0.05时，认为有显著性差异.
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2 结果
2.1 细胞株的培养
2.1.1 无热处理组 MMC和5-FU对未经高温处理的胃癌细胞株(Hs746T)的抑制率分别是32.0%±1.3%和28.6%±2.7%(表1)；对结肠癌细胞株(SW480)的抑制率分别是31.0%±2.0%和32.4%±6.3%，无药对照孔的抑制率为0(表2).
表1 热处理对两种胃癌细胞的抑制率 (
±s,%) 分 组药物 p/mg.L-1
0
MMC
, 百拇医药
5-FU
无热处理组
细胞株
0
32.0±1.3
28.6±2.7
新鲜细胞
43℃120min处理组
0
12.1±2.0
32.0±1.3
细胞株
32.2±1.4a
, 百拇医药
55.8±4.2
54.7±2.6a
新鲜细胞
47℃20min处理组
25.2±2.0a
38.0±6.0a
34.1±3.4
细胞株
32.6±3.7a
53.1±3.1
52.5±3.4a
, 百拇医药
新鲜细胞
30.6±1.3a
40.1±3.7a
44.8±1.8
aP<0.05，F检验，vs无热处理.
表2 热处理对结肠癌细胞的抑制 (
±s,%) 分 组药物 p/mg.L-1
0
MMC
, 百拇医药
5-FU
无热处理组
细胞株
0
31.0±2.0
32.4±6.3
结肠癌
43℃120min处理组
0
24.5±2.2
30.4±3.7
细胞株
23.6±4.2a
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49.8±3.4a
54.2±4.6a
结肠癌
47℃20min处理组
19.3±5.5a
38.4±5.5
33.2±7.4
细胞株
25.2±3.0a
46.7±2.8a
47.8±5.2a
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结肠癌
21.7±4.1a
41.0±3.3a
40.9±5.2
aP<0.05，F检验，vs无热处理.
2.1.2 43℃ 120min处理组 ①对胃癌细胞株(Hs746T)经43℃ 120min处理后，胃癌细胞株(Hs746T)无药物阴性对照孔的抑制率为29.4%±2.0%，与无热处理胃癌细胞株相比具有显著性(P<0.05)；经热处理后，MMC和5-FU对胃癌细胞株的抑制率分别为55.8%±4.2%和54.7%±2.6%，与无热处理组比较均有显著性(P<0.05，表1). ②结肠癌细胞株(SW480)的生长抑制率为23.6%±4.2%，明显高于无热处理组(P<0.05)；MMC和5-FU对结肠癌细胞株的抑制率均有不同程度增加，分别是49.8%±3.4%和54.2%±4.6%，与无热处理组相比P<0.05(表2).
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2.1.3 47℃ 20min处理组 ①经47℃ 20min处理后，胃癌细胞株(Hs746T)无药阴性对照孔的抑制率32.6%±3.7%，明显高于无热处理组(P<0.05)，同时也略高于43℃ 120min组，但无统计学意义. 经此短时超高温处理后，MMC，5-FU对胃癌细胞株(Hs746T)的抑制率分别是53.1%±3.1%和52.5%±3.4%，与43℃ 120min热浴组培养结果相近似(P>0.05，表1). ②结肠癌细胞株(SW480)的生长抑制率为25.2%±3.0%，明显高于无热处理组(P<0.05)；MMC和5-FU的抑制率分别是46.7%±2.8%和47.8%±5.2%，与无热处理组相比P<0.05(表2)；但与43℃ 120min处理组相比无统计学意义(P>0.05).
2.2 新鲜肿瘤细胞的培养
2.2.1 未经高温处理组 MMC，5-FU对新鲜胃癌细胞的抑制率分别为12.1%±2.0%和32.0%±1.3%(表1)，对未经高温处理的新鲜结肠癌细胞的抑制率分别是24.5%±2.2%和30.4%±3.7%(表2). 两种细胞的无药对照孔的抑制率为0.
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2.2.2 43℃ 120min处理组 经43℃热浴120min处理后培养，新鲜胃癌组织细胞无药物阴性对照孔的抑制率为25.2%±2.0%，与无热处理胃癌组织细胞相比具有显著性(P<0.05)；同时，MMC对胃癌细胞的细胞毒性增加，其抑制率为38.0%±6.0%，与无热处理组相比有显著性(P<0.05)；而5-FU的细胞毒性作用无明显变化(表1). 经43℃ 120min处理后，新鲜结肠癌组织细胞的生长抑制率为19.3%±5.5%，明显高于无热处理组(P<0.05). MMC和5-FU对新鲜结肠癌组织细胞的抑制率均有不同程度增加，分别是38.4%±5.5%和33.2%±7.4%，与无热处理组相比P<0.05(表2).
2.2.3 47℃ 20min处理组 经47℃热浴20min处理后培养，新鲜胃癌组织细胞无药对照孔的抑制率为30.6%±1.3%，明显高于无热处理组(P<0.05)；也略高于43℃ 120min组，但无统计学意义. 同时MMC，5-FU对胃癌的细胞毒作用与43℃ 120min热浴组培养结果相近似，新鲜胃癌组织细胞的生长抑制率分别为40.1%±3.7%和44.8%±1.8%. 与43℃ 120min组的培养结果比较，无统计学意义(P>0.05，表1). 经47℃ 20min处理后，新鲜结肠癌细胞的生长抑制率为21.7%±4.1%，明显高于无热处理组(P<0.05)；MMC和5-FU对新鲜结肠癌细胞的抑制率分别是41.0%±3.3%和40.9%±5.2%，与无热处理组相比P<0.05；但与43℃ 120min处理组相比无统计学意义(表2).
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3 讨论
我们选用胃癌细胞株(Hs746T)、结肠癌细胞株(SW480)和新鲜胃癌、结肠癌组织细胞，作为体外细胞毒培养的肿瘤细胞. 用细胞株可以避免来源于临床肿瘤组织中混杂的血细胞、结缔组织、及其他无关细胞，使试验结果稳定、可靠；而用新鲜肿瘤组织制成的细胞悬液，则更符合临床要求[4，5]. MTT是溴化二甲塞噻唑二苯四氮唑(3-4，5-dimethylthiazol-2-yl-2，5-diphentl tetrazolium bromide)的简写. MTT可被活细胞利用还原成蓝黑色甲瓒化合物，其产物可通过分光光度计测得. Carmichael证明[6]，MTT法与克隆形成法具有极好的相关性，并且在用于短期试验时，MTT法对某些药物更为敏感. Sargent et al[7]也证明，肿瘤细胞数与甲瓒的形成量呈线性关系. 因此MTT法作为细胞生长及存活的测定方法与其他方法相比，具有简便、快速、经济、安全等优点[4-7].
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3.1 热处理的生物学效应 近年的研究表明，42℃～45℃持续120min，可明显杀伤肿瘤细胞[2]. 但是高于此温度界限，少于此作用时间范围，对肿瘤细胞的影响如何却少有研究. 因此我们选择临床热疗的常用温度和时间(43℃ 120min)以及有争议的温度和时间(47℃ 20min)作为试验条件[6，7]. 由于47℃明显高于正常体温，同时也高于临床常用的43℃；而作用时间仅20min，大大短于临床常用时间，故我们将此条件称为“短时超高温热处理”. 经热处理后再进行细胞毒培养，结果显示，无论是癌细胞株还是新鲜肿瘤组织细胞的生长抑制率均比未经热处理的癌细胞的生长抑制率明显增加，表明在无化疗药作用下，热处理可以明显抑制胃癌细胞和结肠癌细胞的生长(P<0.05). 另外热处理对癌细胞株的影响稍高于新鲜肿瘤组织细胞，但二者无显著性差异(P>0.05). 该试验还显示，肿瘤细胞经43℃ 120min处理后的培养结果，与47℃ 20min处理后的培养结果相近似，二者无统计学意义(P>0.05). 在加入MMC或5-FU培养后显示，这两种化疗药在常温下能明显抑制肿瘤细胞的生长. 而肿瘤细胞经43℃ 120min或47℃ 20min的热处理后，这两种抗癌药物对肿瘤细胞的细胞毒效应均有不同程度的增加，不论在哪一种温度和哪一段时间范围内，这两种化疗药物对癌细胞株的抑制率均在50%以上；对新鲜肿瘤细胞的抑制率也均在30%以上. 这是由于肿瘤细胞内含水量高、pH值低等不耐热的生物学特性所决定[8-10]. 然而尽管47℃超高温处理，但是由于作用时间较短(仅20min)，因而对肿瘤细胞的影响与43℃ 120min的热处理结果相近似.
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3.2 肿瘤细胞株与新鲜肿瘤细胞的关系 该试验分别采用细胞株(Ts746T、SW480)和新鲜肿瘤组织细胞，作为MTT法体外细胞毒试验的研究对象，其结果显示，无论是这两种细胞常规培养的结果；还是经不同温度、不同时间的热处理后的培养结果均相近似，二者相比无显著性差异(P>0.05). 但是无论在哪一个条件下，瘤细胞株的生长抑制率均稍高于新鲜肿瘤组织细胞. 这可能是因为，瘤细胞株是一组去除一切无关细胞的纯肿瘤细胞，在做细胞培养时，只剩下对化疗药有敏感性的肿瘤细胞，这样就保证了试验结果的准确性、可靠性和稳定性；而新鲜肿瘤组织细胞由于没有完全纯化，尽管经过一系列处理，但是或多或少也含有一些正常的其他细胞. 因此在细胞培养时，这些残留的正常细胞对化疗药物不敏感，并不断生长，从而使新鲜肿瘤组织细胞的生长抑制率比瘤细胞株的结果偏低. 但是二者结果并无显著性差异，不影响对该试验结果的判断. 因此不少作者主张，在按MTT法做体外细胞毒试验时，采用新鲜肿瘤组织细胞作为研究对象，认为这样的结果更接近于临床[3-7].
, http://www.100md.com 作者简介：汪训实，男，1957-12-21生，湖北省武汉市人，汉族. 1982年重庆医科大学医疗系毕业，学士，1987年重庆医科大学获外科硕士. 现任广州军区武汉总医院普通外科副主任医师兼行政副主任，主要从事腹腔内肿瘤(包括肝脏肿瘤，胰腺肿瘤以及胃肠道肿瘤)的临床诊治研究，发表论文40篇，其中国际杂志4篇.
通讯作者 汪训实，430070，湖北省武汉市武珞路299号，广州军区武汉总医院普通外科.
Correspondence to:Prof. Wang Xun-Shi, Department of General Surgery, Chinese PLA Wuhan General Hospital, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Tel. +86.27.87879797 Ext.7636
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4 参考文献
1 Chen JQ. Problems in improving the therapy of careinoma of the stomach and large intestine. Zhonghua Yixue Zazhi, 1995;5:453-454
2 Stewart JR, Gibbs FA: Hyperthermia in the treatment of cancer. Cancer, 1984;64:2823-2830
3 Wang XS, Wang RB, Zhang ZL, Zhou HR, Jing WD, Cao TJ. The research of cytotoxic effect of some antineoplastic drugs on gastric cancer cells after hyperthermia for short time. Zhonghua Liliao Zazhi, 1999;22:26-28
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4 Xin HW, Wang RB. Study of the MTT colorimetric assay as arapid test of chemosensitivity in solid carcinoma cells. Zhongliu Fangzhi Yanjiu, 1993;20:254-255
5 Li ZX, Wei LH, Wang Y, Jing HY, Wang L. Prediction of the clinical response of ovarian cancer to chemotherapy by in vitro anticancer drug sensitivity test. Zhonghua Fucanke Zazhi, 1988;23:287-288
6 Carmichael J. Evaluation of a tetrazoliumbased semiautomated colorimetric assy: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res, 1987;47:936-940
, http://www.100md.com
7 Sargent JM, Taylor CG. Apprasisl of the MTT assay a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukaemia. Br J Cancer, 1989;60:206-211
8 Chen LS. The clinical research on thermotherapy and chemotherapy in abdominal during operation for colon cancer. Aizheng, 1995;14:226-228
9 Li DJ, Hu ZX. Thermotherapy on tumor. Di yi ban: Changsha, Hunan Kexue Jishu Chubanshe, 1987:17
10 Yang YQ, Yang HC. The biological base about thermotherapy on tunor. Zhongliu, 1992;12:141
收稿日期 1999-03-05 修回日期 1999-06-02, 百拇医药