HBV DNA在肝癌细胞中的整合模式
作者：张利宁 孙汶生 曹英林 马春红 宋 静
单位：山东医科大学微生物与免疫学教研室 山东省济南市 250012
关键词：乙型肝炎病毒；肝肿瘤；DNA，病毒；整合模式
世界华人消化杂志990724
中国图书馆分类号 R735.7
Subject headings liver neoplasms; hepatitis B virus; DNA, viral; integration model
1 材料和方法
1.1 材料 66例HCC标本来自山东省省立医院、山东医科大学附属医院及济南市千佛山医院，手术后经病理证实均为原发性肝细胞癌. 标本置-20℃冰冻保存，用于抽提DNA.
, http://www.100md.com
1.2 方法 探针的制备按地高辛甙元标记试剂盒(Boehringer Manhein公司，德国)要求，用随机引物法制备地高辛标记的HBV全基因探针和HBVx, s, pre-s,c四个基因片段探针，探针感度高于1pg[1，2]. Southern杂交从组织中抽提的细胞DNA用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ，HindⅢ消化，在0.7%琼脂糖凝胶上电泳，然后用Southern印迹的方法将DNA转移到硝酸纤维素膜上，用HBV全基因探针进行杂交[3]. 纯整合型HCC中HBV四个基因片段的检测为将32例纯整合型的细胞DNA分别点在硝酸纤维素膜上，按常规分别以HBVx, s, pre-s和c基因片段探针进行斑点杂交.
2 结果
2.1 HBV在HCC中的存在状态 66例HCC标本中HBV的检出率为76%(50/66)，其中64%(32/50)仅有HBV DNA整合(为纯整合型)，36%(18/50)既有整合的HBV DNA又伴有游离的HBV DNA(即混合型)，无单纯游离型.
, 百拇医药
2.2 纯整合型HCC中HBV四个基因 杂交结果显示HBVx, s, pre-s, c基因的整合率分别为87%(28/32)，62%(20/32)，62%(20/32)和25%(8/32)，其中HBV X基因的整合率明显高于s基因(P<0.05)、pre-s基因(P<0.05)和c基因(P<0.01).
3 讨论
近几年来的研究发现HBV在染色体上的整合是随机的. 整合于染色体上的HBV DNA是不完整的，病毒基因组多有一定程度的缺失[4]. Hino et al[5]发现整合于染色体上的HBV DNA片段的一端多位于病毒直接重复序列DR1和DR2附近，另一端则视整合片段的大小不同而位于HBV DNA的不同位置. 进而提出HBV整合的四种可能模式，即以DR1为始点，顺时针和逆时针方向的Ⅰ，Ⅱ模式和以DR2为始点，顺、逆时针方向整合的Ⅲ，Ⅳ模式. 我们发现HBV x基因整合率最高，HBV s基因片段整合率次之，HBV c基因的整合率最低，该结果提示山东地区原发性肝细胞癌中HBV DNA的整合是DR1为始点逆时针方向整合的Ⅱ型模式为主.
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通讯作者 张利宁
4 参考文献
1 曹岩娜，孙汶生，宋静. 地高辛甙元标记HBV-DNA探针的制备. 山东医科大学学报，1993；31：279
2 孙汶生，高丰光，曹英林. HBV DNA及HBx DNA亚片段在肝癌细胞内的整合及作用. 中华传染 病学杂志，1997；15：68
3 孙汶生，张利宁，曹英林. HBV DNA基因型与肝细胞肝癌的预测性相关研究. 山东医科大学学报，1995；33：181
4 Sommer G, Sterneck M, Otto S, Will H. A new class of defective hepatitis B virus genomes with an internal poly(dA)sequence. Virology, 1997;239:402-412
5 Hino O, Ohtake K, Rogler CE. Feature of two hepatitis B virus(HBV) DNA integrations suggest mechanisms of HBV integration. J Virol, 1989;63:2638
收稿日期 1999-02-05 收回日期 1999-04-03, 百拇医药
单位：山东医科大学微生物与免疫学教研室 山东省济南市 250012
关键词：乙型肝炎病毒；肝肿瘤；DNA，病毒；整合模式
世界华人消化杂志990724
中国图书馆分类号 R735.7
Subject headings liver neoplasms; hepatitis B virus; DNA, viral; integration model
1 材料和方法
1.1 材料 66例HCC标本来自山东省省立医院、山东医科大学附属医院及济南市千佛山医院，手术后经病理证实均为原发性肝细胞癌. 标本置-20℃冰冻保存，用于抽提DNA.
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1.2 方法 探针的制备按地高辛甙元标记试剂盒(Boehringer Manhein公司，德国)要求，用随机引物法制备地高辛标记的HBV全基因探针和HBVx, s, pre-s,c四个基因片段探针，探针感度高于1pg[1，2]. Southern杂交从组织中抽提的细胞DNA用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ，HindⅢ消化，在0.7%琼脂糖凝胶上电泳，然后用Southern印迹的方法将DNA转移到硝酸纤维素膜上，用HBV全基因探针进行杂交[3]. 纯整合型HCC中HBV四个基因片段的检测为将32例纯整合型的细胞DNA分别点在硝酸纤维素膜上，按常规分别以HBVx, s, pre-s和c基因片段探针进行斑点杂交.
2 结果
2.1 HBV在HCC中的存在状态 66例HCC标本中HBV的检出率为76%(50/66)，其中64%(32/50)仅有HBV DNA整合(为纯整合型)，36%(18/50)既有整合的HBV DNA又伴有游离的HBV DNA(即混合型)，无单纯游离型.
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2.2 纯整合型HCC中HBV四个基因 杂交结果显示HBVx, s, pre-s, c基因的整合率分别为87%(28/32)，62%(20/32)，62%(20/32)和25%(8/32)，其中HBV X基因的整合率明显高于s基因(P<0.05)、pre-s基因(P<0.05)和c基因(P<0.01).
3 讨论
近几年来的研究发现HBV在染色体上的整合是随机的. 整合于染色体上的HBV DNA是不完整的，病毒基因组多有一定程度的缺失[4]. Hino et al[5]发现整合于染色体上的HBV DNA片段的一端多位于病毒直接重复序列DR1和DR2附近，另一端则视整合片段的大小不同而位于HBV DNA的不同位置. 进而提出HBV整合的四种可能模式，即以DR1为始点，顺时针和逆时针方向的Ⅰ，Ⅱ模式和以DR2为始点，顺、逆时针方向整合的Ⅲ，Ⅳ模式. 我们发现HBV x基因整合率最高，HBV s基因片段整合率次之，HBV c基因的整合率最低，该结果提示山东地区原发性肝细胞癌中HBV DNA的整合是DR1为始点逆时针方向整合的Ⅱ型模式为主.
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通讯作者 张利宁
4 参考文献
1 曹岩娜，孙汶生，宋静. 地高辛甙元标记HBV-DNA探针的制备. 山东医科大学学报，1993；31：279
2 孙汶生，高丰光，曹英林. HBV DNA及HBx DNA亚片段在肝癌细胞内的整合及作用. 中华传染 病学杂志，1997；15：68
3 孙汶生，张利宁，曹英林. HBV DNA基因型与肝细胞肝癌的预测性相关研究. 山东医科大学学报，1995；33：181
4 Sommer G, Sterneck M, Otto S, Will H. A new class of defective hepatitis B virus genomes with an internal poly(dA)sequence. Virology, 1997;239:402-412
5 Hino O, Ohtake K, Rogler CE. Feature of two hepatitis B virus(HBV) DNA integrations suggest mechanisms of HBV integration. J Virol, 1989;63:2638
收稿日期 1999-02-05 收回日期 1999-04-03, 百拇医药