大鼠严重烫伤后心功能及心肌Gs α mRNA表达的变化
作者：张海港 李晓辉 宋裕南
单位：张海港 李晓辉 宋裕南 第三军医大学药理教研室，四川 重庆 400038
关键词：烧伤；心功能；G蛋白；信号转导；信使RNA
中国急救医学990701 摘要：目的 研究烧伤早期心肌Gs α mRNA表达水平的变化，探讨其在烧伤后心肌舒缩功能下降中的作用。方法 采用30%体表面积Ⅲ度烫伤大鼠模型，测定伤前及伤后左心室收缩压(LVSP)、左心室压力最大上升与下降速率(LV±dp/dtmax)，用dot blotting杂交技术测定心肌Gs α mRNA表达水平的变化。结果 与对照组相比，烫伤组LVSP、±dp/dtmax明显降低(P<0.01)，伤后3、6、9小时心肌Gs α mRNA表达水平明显减少(P<0.01)，且与LVSP、±dp/dt max变化呈显著正相关(r值分别为0.85、0.82、0.81，P<0.01)。结论 烫伤后早期心肌Gs α mRNA表达减少，是烧伤后心肌收缩功能降低的重要因素之一。
, 百拇医药
Early changes in cardiac function and myocardial Gs α mRNA expression after severe scalds in rats
ZHANG Hai-gang, LI Xiao-hui, SONG Yu-nan.
Department of Pharmacology, Third Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract Objective To investigate the early changes of myocardial Gs α mRNA expression and its role in the cardiac contractile dysfunction after severe scalds. Methods Contraction relaxation properties of the left ventricle(LV) were studied in rat undergoing a full thickness scalded burn of the skin of 30% total body surface area. Myocardial Gs α mRNA level were measured by dot blotting hybridization technique. Results The left ventricular systolic pressure(LVSP) and the maximal rates of LV pressure elevation(+dp/dtmax) and depression (-dp/dt max)in scald group were significantly lower than that in control group(P<0.01). At 3, 6, 9th hour after the scalds, the myocardial Gs α mRNA were significantly decreased compared with control group(P<0.01). The changes were correlated markedly with LVSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax (r=0.85, 0.82, 0.81 respectively, P<0.01). Conclusion The depression of Gs α mRNA is one of the important mechanismsfor cardiac contractile dysfunction after severe scald.
, http://www.100md.com
Key words Burn Cardiac function G protein Signal transduction Message RNA
严重体表烧伤后常有明显的心功能障碍，其发生与烧伤造成的心脏前负荷下降和心脏舒缩功能降低有关[1，2]。本室发现大鼠严重体表烫伤后心肌苷酸环化酶(adenylyl cyclase, AC)活性降低，cAMP生成减少[3]，心肌Gs α亚单位含量减少并与心功能降低有良好相关性[4]。为进一步探讨烧伤后心功能减退、心肌Gs α减少的机制，本文通过30%体表面积(total body surface area, TBSA)皮肤Ⅲ度烫伤大鼠模型，观察严重体表烫伤后心脏Gs α mRNA表达水平的变化与心功能降低的关系。
1 资料与方法
1.1 资料
, http://www.100md.com
1.1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠，本校实验动物中心提供，体重180～220 g。随机分为正常对照组、烫伤后3、6、9、12、24、48小时组，每组8只。
1.1.2 试剂与材料 地高辛(DIG)3′端加尾试剂盒和DIG标记与检测试剂盒、Tripure RNA抽提试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。大鼠Gs α寡核苷酸探针(5′-TCC AGA GGT CAG GAC GCG GCA GCG AAG CAG GTC CTG GTC-3′)由中国科学院上海细胞研究所合成，经FPLC反相柱纯化。DEPC购自Sigma公司。
1.1.3 主要仪器 RM-6200型四道生理记录仪(成都仪器厂)；UVP凝胶成像分析系统(美国UVP公司)。
1.2 方法
, http://www.100md.com 1.2.1 烫伤模型制作 于致伤前一天，用8%硫化钠脱去背部占30%体表面积(TBSA)的毛，以温水冲洗后擦干，24小时后用乙醚麻醉动物，置95℃水浴中烫9秒钟，造成30%体表面积皮肤Ⅲ度烫伤(病理检查证实)。致伤后腹腔内注射生理盐水约5 ml，分笼喂养，自由进食。
1.2.2 左心室功能测定 腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg体重)麻醉动物，由颈总动脉行左心室插管，用四道生理记录仪测定并记录左心室收缩压(LVSP)及左心室压力最大上升与下降速度(LV±dp/dtmax)。测定完毕后，迅速打开胸腔，取出心脏置液氮中保存。
1.2.3 Gs α mRNA表达量的测定 按说明书提取心肌总RNA，紫外分光光度法定量，琼脂糖电泳确定其完整性。将各时间点总RNA样品用DEPC水稀释到5.0 μg/μl，按说明书及文献[5]进行dot blotting杂交，结果照片，用凝胶成像分析系统扫描各点，测定各时间点杂交信号的积分光密度值。
, http://www.100md.com
1.2.4 数据处理 以对照组斑点光密度值为100%，求出各时间点杂交信号的相对百分率，用Excel 97进行组间t检验。对心功能指标和Gs α mRNA进行相关分析。
2 结果
2.1 左心室功能变化
大鼠烫伤后，LVSP急剧下降，伤后6小时下降最多，此后一直到48小时维持于低水平(P<0.01)。LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax有同样规律的变化(见表1)。
表1 大鼠严重体表烫伤后心功能的变化(n=8,
±s) 检测指标
对照组
, http://www.100md.com
烫伤后时间(h)
3
6
9
12
24
48
LVSP(kPa)
17.4±1.6
2.6±1.5▲
11.7±1.6▲
11.9±2.0▲
, 百拇医药
12.1±1.3▲
12.4±2.1▲
13.1±1.9▲
LV+dp/dtmax(kPa/s)
697±50
551±72▲
514±33▲
520±71▲
506±60▲
513±82▲
, 百拇医药
518±79▲
LV-dp/dtmax(kPa/s)
660±46
507±67▲
460±24▲
470±30▲
496±43▲
516±19▲
490±83▲
与对照组相比：▲P<0.01
, 百拇医药
2.2 心肌Gs α mRNA表达水平的变化
烫伤后心肌Gs a mRNA水平明显减少，伤后3、6、9小时明显少于对照组(P<0.01)，以3小时最低，从伤后12小时起逐渐恢复(见表2)。
表2 大鼠严重烫伤后心肌Gs α mRNA表达水平的变化
对照组
烫伤后时间(h)
3
6
9
12
24
, 百拇医药
48
n
8
8
8
8
8
8
8
相对光密度值
100
60.9±14.7▲
71.5±16.0▲
, 百拇医药
78.0±21.1▲
97.3±20.2▲
101.4±29.6▲
91.0±27.0▲
与对照组相比：▲P<0.01
Gs α mRNA表达水平与LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax呈显著正相关(r分别为0.85、0.82、0.81，P<0.01)。
3 讨论
烧伤不仅造成局部损伤，而且引起全身性的系统反应。当深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤面积达到25%以上时，心血管功能紊乱即可成为主要的系统反应[5]，表现为心功能的明显减退，可引起休克的发生，增加烧伤早期的死亡率。已有许多研究证明心肌损伤、心肌舒缩功能障碍是其重要因素之一[1，2]。心肌兴奋-收缩偶联过程中的诸多环节均可影响心肌舒缩性。本实验结果表明烧伤早期左心室内压±dp/dtmax显著降低，伤后6小时降至最低水平。提示烧伤早期心肌收缩及舒张功能明显降低。
, 百拇医药
心肌细胞膜上存在着β-肾上腺素受体-AC系统，配体或激动剂与β受体结合后，触发Gs α亚基上的GDP磷酸化，激活AC，催化ATP反应生成cAMP，cAMP作为第二信使启动级联反应，放大心脏舒缩指数，从而增加心室舒缩功能。烧伤后β受体的变化尚存在不同的看法，有报道大鼠烫伤后直至48小时心肌β受体密度(Bmax)明显降低，表现解离常数(kD)无变化[3]，而Wang[7]则发现烫伤后24 h至14 d β受体Bmax无变化。因此在烧伤后心功能减退发生的机理中受体后环节起着重要的作用，即β受体-AC的脱偶联。本室研究发现严重体表烫伤大鼠心肌Gs α亚基伤后6小时开始降低，12小时降至最低水平，48小时后有所恢复。但Gs α蛋白水平的降低机制尚不清楚，也未见相应报道。本实验结果表明大鼠严重体表烫伤后心肌Gs α mRNA表达水平降低，伤后3、6、9小时Gs α mRNA水平均显著低于对照组，以3小时为最低，从12小时起逐步恢复。由于翻译、翻译后加工修饰、组装、定位需一定的时间，故心功能仍维持于低水平。
, http://www.100md.com
Gs α mRNA表达水平减少的原因可能有以下几方面：①烧伤后血管通透性增高，蛋白丢失使转录系统酶减少；②心肌抑制因子、肿瘤坏死因子等细胞因子、炎症介质抑制转录酶的活性[6，8]；③转录后加工阶段功能障碍。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39370791)
参考文献
1 Adams HR, Baxter CR, Izenberg SD, et al. Decreased contractility and compilance of the left ventricle as complications of thermal trauma. Am Heart J, 1984, 108: 1477-1487.
2 Horton JW, Carcia NM, White DJ, et al. Postburn cardiac contractile function and biochemical markers of postburn cardiac injury. J Am Coll Surg, 1995, 181: 289-298.
, http://www.100md.com
3 何华美，宋裕南，孙继武，等.大鼠严重体表烫伤后心脏β-肾上腺素能受体腺苷酸环化酶系统的变化.中国病理生理杂志，1996，12(4)：355-358.
4 李晓辉，何保斌，李淑惠，等.G蛋白功能在严重体表烫伤大鼠心肌组织的变化及意义研究.中国病理生理杂志，1998，14(7)：846-847.
5 杨清峰，陈彪，杨宏，等.大鼠脊髓组织CNTER α mRNA的表达及其坐骨神经损伤后表达的变化.军事医学科学院院刊，1998，22：84-87.
6 Carleton SC. Cardiac problems associated with burns. Cardiol Clin, 1995, 13(2): 257-262.
7 Wang C, Martyn TA. Burn injury alters beta-adrenergic receptor and second messenger function in rat ventricular muscle. Crit Care Med, 1996, 24(1): 118-124.
8 Arturson G. Pathophysiology of the burn wound and pharmacological treatment. The rudi hermans lecture, 1995. burns, 1996, 22(4):255-274.
收稿：1999-06-02, http://www.100md.com
单位：张海港 李晓辉 宋裕南 第三军医大学药理教研室，四川 重庆 400038
关键词：烧伤；心功能；G蛋白；信号转导；信使RNA
中国急救医学990701 摘要：目的 研究烧伤早期心肌Gs α mRNA表达水平的变化，探讨其在烧伤后心肌舒缩功能下降中的作用。方法 采用30%体表面积Ⅲ度烫伤大鼠模型，测定伤前及伤后左心室收缩压(LVSP)、左心室压力最大上升与下降速率(LV±dp/dtmax)，用dot blotting杂交技术测定心肌Gs α mRNA表达水平的变化。结果 与对照组相比，烫伤组LVSP、±dp/dtmax明显降低(P<0.01)，伤后3、6、9小时心肌Gs α mRNA表达水平明显减少(P<0.01)，且与LVSP、±dp/dt max变化呈显著正相关(r值分别为0.85、0.82、0.81，P<0.01)。结论 烫伤后早期心肌Gs α mRNA表达减少，是烧伤后心肌收缩功能降低的重要因素之一。
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Early changes in cardiac function and myocardial Gs α mRNA expression after severe scalds in rats
ZHANG Hai-gang, LI Xiao-hui, SONG Yu-nan.
Department of Pharmacology, Third Military Medical University, Chongqing 400038
Abstract Objective To investigate the early changes of myocardial Gs α mRNA expression and its role in the cardiac contractile dysfunction after severe scalds. Methods Contraction relaxation properties of the left ventricle(LV) were studied in rat undergoing a full thickness scalded burn of the skin of 30% total body surface area. Myocardial Gs α mRNA level were measured by dot blotting hybridization technique. Results The left ventricular systolic pressure(LVSP) and the maximal rates of LV pressure elevation(+dp/dtmax) and depression (-dp/dt max)in scald group were significantly lower than that in control group(P<0.01). At 3, 6, 9th hour after the scalds, the myocardial Gs α mRNA were significantly decreased compared with control group(P<0.01). The changes were correlated markedly with LVSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax (r=0.85, 0.82, 0.81 respectively, P<0.01). Conclusion The depression of Gs α mRNA is one of the important mechanismsfor cardiac contractile dysfunction after severe scald.
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Key words Burn Cardiac function G protein Signal transduction Message RNA
严重体表烧伤后常有明显的心功能障碍，其发生与烧伤造成的心脏前负荷下降和心脏舒缩功能降低有关[1，2]。本室发现大鼠严重体表烫伤后心肌苷酸环化酶(adenylyl cyclase, AC)活性降低，cAMP生成减少[3]，心肌Gs α亚单位含量减少并与心功能降低有良好相关性[4]。为进一步探讨烧伤后心功能减退、心肌Gs α减少的机制，本文通过30%体表面积(total body surface area, TBSA)皮肤Ⅲ度烫伤大鼠模型，观察严重体表烫伤后心脏Gs α mRNA表达水平的变化与心功能降低的关系。
1 资料与方法
1.1 资料
, http://www.100md.com
1.1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠，本校实验动物中心提供，体重180～220 g。随机分为正常对照组、烫伤后3、6、9、12、24、48小时组，每组8只。
1.1.2 试剂与材料 地高辛(DIG)3′端加尾试剂盒和DIG标记与检测试剂盒、Tripure RNA抽提试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。大鼠Gs α寡核苷酸探针(5′-TCC AGA GGT CAG GAC GCG GCA GCG AAG CAG GTC CTG GTC-3′)由中国科学院上海细胞研究所合成，经FPLC反相柱纯化。DEPC购自Sigma公司。
1.1.3 主要仪器 RM-6200型四道生理记录仪(成都仪器厂)；UVP凝胶成像分析系统(美国UVP公司)。
1.2 方法
, http://www.100md.com 1.2.1 烫伤模型制作 于致伤前一天，用8%硫化钠脱去背部占30%体表面积(TBSA)的毛，以温水冲洗后擦干，24小时后用乙醚麻醉动物，置95℃水浴中烫9秒钟，造成30%体表面积皮肤Ⅲ度烫伤(病理检查证实)。致伤后腹腔内注射生理盐水约5 ml，分笼喂养，自由进食。
1.2.2 左心室功能测定 腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg体重)麻醉动物，由颈总动脉行左心室插管，用四道生理记录仪测定并记录左心室收缩压(LVSP)及左心室压力最大上升与下降速度(LV±dp/dtmax)。测定完毕后，迅速打开胸腔，取出心脏置液氮中保存。
1.2.3 Gs α mRNA表达量的测定 按说明书提取心肌总RNA，紫外分光光度法定量，琼脂糖电泳确定其完整性。将各时间点总RNA样品用DEPC水稀释到5.0 μg/μl，按说明书及文献[5]进行dot blotting杂交，结果照片，用凝胶成像分析系统扫描各点，测定各时间点杂交信号的积分光密度值。
, http://www.100md.com
1.2.4 数据处理 以对照组斑点光密度值为100%，求出各时间点杂交信号的相对百分率，用Excel 97进行组间t检验。对心功能指标和Gs α mRNA进行相关分析。
2 结果
2.1 左心室功能变化
大鼠烫伤后，LVSP急剧下降，伤后6小时下降最多，此后一直到48小时维持于低水平(P<0.01)。LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax有同样规律的变化(见表1)。
表1 大鼠严重体表烫伤后心功能的变化(n=8,
±s) 检测指标对照组
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烫伤后时间(h)
3
6
9
12
24
48
LVSP(kPa)
17.4±1.6
2.6±1.5▲
11.7±1.6▲
11.9±2.0▲
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12.1±1.3▲
12.4±2.1▲
13.1±1.9▲
LV+dp/dtmax(kPa/s)
697±50
551±72▲
514±33▲
520±71▲
506±60▲
513±82▲
, 百拇医药
518±79▲
LV-dp/dtmax(kPa/s)
660±46
507±67▲
460±24▲
470±30▲
496±43▲
516±19▲
490±83▲
与对照组相比：▲P<0.01
, 百拇医药
2.2 心肌Gs α mRNA表达水平的变化
烫伤后心肌Gs a mRNA水平明显减少，伤后3、6、9小时明显少于对照组(P<0.01)，以3小时最低，从伤后12小时起逐渐恢复(见表2)。
表2 大鼠严重烫伤后心肌Gs α mRNA表达水平的变化
对照组
烫伤后时间(h)
3
6
9
12
24
, 百拇医药
48
n
8
8
8
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相对光密度值
100
60.9±14.7▲
71.5±16.0▲
, 百拇医药
78.0±21.1▲
97.3±20.2▲
101.4±29.6▲
91.0±27.0▲
与对照组相比：▲P<0.01
Gs α mRNA表达水平与LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax呈显著正相关(r分别为0.85、0.82、0.81，P<0.01)。
3 讨论
烧伤不仅造成局部损伤，而且引起全身性的系统反应。当深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤面积达到25%以上时，心血管功能紊乱即可成为主要的系统反应[5]，表现为心功能的明显减退，可引起休克的发生，增加烧伤早期的死亡率。已有许多研究证明心肌损伤、心肌舒缩功能障碍是其重要因素之一[1，2]。心肌兴奋-收缩偶联过程中的诸多环节均可影响心肌舒缩性。本实验结果表明烧伤早期左心室内压±dp/dtmax显著降低，伤后6小时降至最低水平。提示烧伤早期心肌收缩及舒张功能明显降低。
, 百拇医药
心肌细胞膜上存在着β-肾上腺素受体-AC系统，配体或激动剂与β受体结合后，触发Gs α亚基上的GDP磷酸化，激活AC，催化ATP反应生成cAMP，cAMP作为第二信使启动级联反应，放大心脏舒缩指数，从而增加心室舒缩功能。烧伤后β受体的变化尚存在不同的看法，有报道大鼠烫伤后直至48小时心肌β受体密度(Bmax)明显降低，表现解离常数(kD)无变化[3]，而Wang[7]则发现烫伤后24 h至14 d β受体Bmax无变化。因此在烧伤后心功能减退发生的机理中受体后环节起着重要的作用，即β受体-AC的脱偶联。本室研究发现严重体表烫伤大鼠心肌Gs α亚基伤后6小时开始降低，12小时降至最低水平，48小时后有所恢复。但Gs α蛋白水平的降低机制尚不清楚，也未见相应报道。本实验结果表明大鼠严重体表烫伤后心肌Gs α mRNA表达水平降低，伤后3、6、9小时Gs α mRNA水平均显著低于对照组，以3小时为最低，从12小时起逐步恢复。由于翻译、翻译后加工修饰、组装、定位需一定的时间，故心功能仍维持于低水平。
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Gs α mRNA表达水平减少的原因可能有以下几方面：①烧伤后血管通透性增高，蛋白丢失使转录系统酶减少；②心肌抑制因子、肿瘤坏死因子等细胞因子、炎症介质抑制转录酶的活性[6，8]；③转录后加工阶段功能障碍。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39370791)
参考文献
1 Adams HR, Baxter CR, Izenberg SD, et al. Decreased contractility and compilance of the left ventricle as complications of thermal trauma. Am Heart J, 1984, 108: 1477-1487.
2 Horton JW, Carcia NM, White DJ, et al. Postburn cardiac contractile function and biochemical markers of postburn cardiac injury. J Am Coll Surg, 1995, 181: 289-298.
, http://www.100md.com
3 何华美，宋裕南，孙继武，等.大鼠严重体表烫伤后心脏β-肾上腺素能受体腺苷酸环化酶系统的变化.中国病理生理杂志，1996，12(4)：355-358.
4 李晓辉，何保斌，李淑惠，等.G蛋白功能在严重体表烫伤大鼠心肌组织的变化及意义研究.中国病理生理杂志，1998，14(7)：846-847.
5 杨清峰，陈彪，杨宏，等.大鼠脊髓组织CNTER α mRNA的表达及其坐骨神经损伤后表达的变化.军事医学科学院院刊，1998，22：84-87.
6 Carleton SC. Cardiac problems associated with burns. Cardiol Clin, 1995, 13(2): 257-262.
7 Wang C, Martyn TA. Burn injury alters beta-adrenergic receptor and second messenger function in rat ventricular muscle. Crit Care Med, 1996, 24(1): 118-124.
8 Arturson G. Pathophysiology of the burn wound and pharmacological treatment. The rudi hermans lecture, 1995. burns, 1996, 22(4):255-274.
收稿：1999-06-02, http://www.100md.com