血清GPDA同工酶改良测定及其对原发性肝癌的诊断价值△
作者：肖明兵 张 弘 黄介飞 魏 群 倪润洲 江 枫 孟宪镛
单位：南通医学院附属医院消化科 邮政编码：226001
关键词：电泳 GPDA 同工酶 原发性肝癌
江苏医药990801 摘要 目的：为了改进甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶同工酶的分离效果，提高肝癌特异性GPDA(GPDA-Ⅱ)对原发性肝癌的诊断价值。方法：在原阶段梯度胶电泳分离同工酶方法的基础上，将四层浓度胶(46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、154.0g/L)改为五层(46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、102.7g/L、154.0g/L)。结果：使血清PGDA-Ⅱ在PHC病人中的阳性率由原来的42.2%提高到67.6%，其阳性率与AFP、肿瘤大小无相关性。结论：进一步表明GPDA-Ⅱ为肝癌又一新的诊断指标，对PHC有特异性诊断价值。
, 百拇医药 Diagnostic Value of Serum PHC-Specific GPDA Isoenzyme
with a Modified Separation Method
Xiao Mingbing et al
Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital,Nantong Medical College, Nantong 226001
Abstract To improve the separative effect of glycylproline dipeptidyl aminopeptidase(GPDA)isoenzyme and raise the diagnostic value of the specific GPDA(GPDA-Ⅱ) for primary hepatic carcinoma (PHC), we modified the previously reported stage polyacryamide gel electrophoresis, four series concentraton gels (46.2g/L,77.0g/L,92.4g/L,154.0g/L)were changed to five (46.2g/L,77.0g/L,92.4g/L,102.7g/L,154.0g/L). The positive rates of serum GPDA-Ⅱ in the patients with PHC were raised from 42.2% to 67.6% by this method. There was no correlation between the positive rate of GPDA-Ⅱand AFP levels or the size of the tumors. It is suggested that GPDA-Ⅱ is a new diagnostic mark for PHC.
, 百拇医药
Key words Electrophoresis GPDA Isoenzyme PHC
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycylproline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA,EC.3.4,14.1)由Hopsu-Havu等发现，广泛分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺中[1]。关于此酶及其同工酶对原发性肝癌(PHC)的诊断价值已有报道[2，3]。我们曾报道其同工酶分离方法，从阳极至阴极共分九条区带，其中近阳极端的GPDA -Ⅱ在PHC病人中阳性率达41.8%，与急、慢性肝炎，肝硬化病人有显著差异[3]，已引起临床重视。GPDA -Ⅱ带与Ⅰ带距离较近，加之区带间的弥散，有时影响结果判断。为此，本文对原法进行了改良并探讨了血清GPDA同工酶区带在PHC中的诊断价值。
对象与方法
一、对象 PHC71例，男56例，女15例，年龄30～76岁，平均53岁。癌瘤大小按B超或CT上显示的最大径线计，小于5cm者列为小肝癌。继发性肝癌10例，急性肝炎26例，慢性肝炎35例，肝炎后肝硬化24例，以上病例均为本院住院病例，诊断符合通用诊断标准。健康对照23名，为南通血站正常献血员。
, 百拇医药
二、方法 按原法配制电泳试剂及缓冲液，并同法制胶，五层凝胶的浓度由上至下分别为46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、102.7g/L、154.0g/L，各层胶配制如表1；加入待测样品40μ1(血清20μ1、蔗糖溴酚兰液20μ1)，稳压60V电泳约5小时后，加大电压至100V，16小时后结束电泳；取两张9.5cm×10.5cm醋纤膜，用底物液[GPA15mg、200g/L Tween 80 0.5ml、50.0g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.1ml、Tris -双甘肽4.8ml(含1g/L N-萘乙烯二胺盐酸盐)、100g/L NaNO2 0.1ml]浸湿，将凝胶包夹于两醋纤膜之间，置湿盒37℃孵育30分钟后，将薄膜置三氯醋酸甘油溶液中呈色，取出观察结果。
表1 各层胶配制方法(单位：ml) 试 剂
第一层
第二层
, 百拇医药
第三层
第四层
第五层
30.8%丙烯酰胺液
0.6
1.0
1.2
1.0
1.5
浓缩胶缓冲液
1.0
分离胶缓冲液
1.0
, http://www.100md.com
1.3
1.0
0.75
0.14%过硫酸铵
2.4
2.0
1.5
1.0
0.75
三、统计学分析 阳性率比较用四格表卡方检验。结 果
一、同工酶分离结果 呈色后醋纤膜上GPDA同工酶仍分为9条同工酶区带，从阳极至阴极依次命名为GPDA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……Ⅸ(如附图)。GPDA-Ⅰ大致相当于蛋白电泳像的α2-球蛋白区；Ⅱ带居后约0.5cm，较原法有所增宽，个别标本会出现Ⅱ′带；Ⅷ在分离胶原位；Ⅸ在加样原位，各区带间弥散度较原法小。
, 百拇医药
1.为正常人；2.为急性肝炎；7.为肝硬化；
3、4、5、6、8、9为PHC病人
附图：GPDA同工酶分离图谱(改良法)
二、各组受检者血清GPDA同工酶结果
用原法及改良法同时检测受检者血清GPDA同工酶，各类人群均可见较强Ⅰ带；Ⅱ带在健康人及继发性肝癌未检出，在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化患者中偶见；PHC患者Ⅱ带阳性率改良法(67.7%)明显高于原法(42.2%)(P<0.05)，但两者较其它组均显著升高(P<0.01)(见表2)；Ⅲ-Ⅸ带在不同血清组中皆不等出现，无明显差异。
表2 各组受检者血清GPDAⅡ阳性率 分 组
总例数
, 百拇医药
(原法)/(阳性例数(%))
(改良法)/(阳性例数(%))
PHC
71
30(42.2)*#
48(67.6)*
继发性肝癌
10
0(0)
0(0)
急性肝炎
26
, 百拇医药
2(7.7)
2(7.7)
肝炎后肝硬化
24
4(16.7)
3(12.5)
慢性肝炎
35
4(11.4)
3(8.6)
健康人
23
0(0)
, http://www.100md.com
0(0)
*与其它各组比P<0.01；#与改良法比P<0.05
三、PHC病人血清AFP与GPDA-Ⅱ的关系 由表3可见，PHC病人AFP阳性及阴性两组之间，GPDA-Ⅱ阳性率无显著性差异(P>0.05)。
表3 PHC患者血清AFP与GPDA-Ⅱ的关系 AFP(ng/ml)
例数
阳性例数
阳性率(%)
≤50
20
12
, http://www.100md.com
60.6
>50
51
34
66.7
四、小肝癌及中晚期肝癌患者血清GPDA -Ⅱ比较 血清GPDA-Ⅱ在小肝癌组的阳性率与中晚期肝癌组相比差异无显著性(P>0.05)，如表4。表4 小肝癌及中晚期肝癌血清中GPDA-Ⅱ结果 组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
小肝癌
28
, 百拇医药
16
57.1
中晚期肝癌
43
30
69.8
讨 论
GPDA是一种能分解肽链N - 端甘氨酰脯氨酸的二肽萘酰胺酶。由上皮细胞或间充质分化而产生的癌组织常含有胶原酶，能分解癌组织周围的胶原，因而可能与癌的浸润和扩散有关[4]，GPDA作为胶原分解过程中的一种二肽氨基肽酶，可能也起重要作用。其血清总活力在肝胆疾病时升高，肝癌时尤为明显，被公认为PHC有价值的肿瘤标记，但其同工酶的研究鲜见报道。本文对原同工酶分离法进行了改良并探讨了血清GPDA同工酶区带在PHC中的诊断价值。
, 百拇医药
GPDA同工酶的存在首先由Hino提出[5]，1986年松田佑太郎等在肝病患者血清中从阳极到阴极依次分出5条同工酶区带，其中Ⅱ带位于α1球蛋白和α2球蛋白区之间，在阻塞性黄疸与肝癌时升高。但未出现肝癌特异性区带[6]。我们曾在国内首次报道以聚丙烯酰胺阶段梯度胶分离血清GPDA同工酶，从阳极至阴极共分出九条区带，并发现PHC患者血清中GPDA-Ⅱ阳性率为41.8%，但其与Ⅰ带的距离较近，不易分辨，且各区带间有一定的弥散，对结果判断有一定影响。GPDA在人唾液腺中分子量为225000，在50～100g/L的浓度胶中能得到较好分离[3]，本文将原法四层胶改为五层(46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、102.7g/L、154.0g/L)，增加电泳分离过程中分子筛的作用，使Ⅰ带与Ⅱ带间距离增宽，减少了弥散，且GPDA-Ⅱ的阳性率提高为67.6%，进一步说明了GPDA-Ⅱ对PHC的诊断价值。
用原法及改良法同时对不同受检组中血清进行检测，判断GPDA-Ⅱ阳性结果，减少了抽样误差，使同一批标本中GPDA-Ⅱ在两法中测出不同的阳性率结果，充分说明改良法优于原法。AFP是公认的PHC血清学诊断指标，其对PHC的诊断率约在60～70%，但与肿瘤大小相关，在小肝癌中的阳性率较低。本研究中GPDA-Ⅱ阳性率在AFP阳性及阴性、小肝癌及中晚期肝癌各自两组患者之间，无统计学差异，提示GPDA-Ⅱ与AFP间无相关性。故对AFP阴性的PHC病人，GPDA-Ⅱ具有互补诊断的价值；对影像较难发现的小肝癌也有定性诊断价值。
, 百拇医药
本文结果显示，GPDA-Ⅱ对PHC诊断有特异性。我们对鼠及人肝癌血清和肝组织作GPDA同工酶检测，其中GPDA-Ⅱ仅出现于鼠癌前病变和癌变的肝组织和血清中，在对照组及细胞变性组中均为阴性；对人肝癌，GPDA-Ⅱ仅存在于肿瘤细胞无变性坏死的肝癌组织中，手术前后血清中其阳性率有显著性差异(另文发表)，进一步提示GPDA-Ⅱ为肝癌特异性同工酶区带，由癌变肝组织合成；其在继发性肝癌中表现为阴性，可能与肿瘤的组织来源有一定关系。GPDA-Ⅱ的检测，对PHC诊断、PHC与继发性肝癌的鉴别诊断及手术疗效的评价等均具有一定的临床价值 。
△ 本课题受省卫生厅资助
参考文献
[1] Hopsu Javu VK,et al.Histochemic 1996;7:197
[2] 叶胜龙，等.中华医学杂志1987；67(3)：134
[3] 肖明兵，等.临床检验杂志1996；14(4)：174
[4] 上海第一医学院主编.医用生物化学(下册).北京：人民卫生出版社，1979；57.
[5] Hino M,et al.Clin Chem 1976;22:1256.
[6] 松田佑太郎，等.临床病理(日)1986；8：981.
(1999年1月5日收稿 同年3月4日修回), 百拇医药
单位：南通医学院附属医院消化科 邮政编码：226001
关键词：电泳 GPDA 同工酶 原发性肝癌
江苏医药990801 摘要 目的：为了改进甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶同工酶的分离效果，提高肝癌特异性GPDA(GPDA-Ⅱ)对原发性肝癌的诊断价值。方法：在原阶段梯度胶电泳分离同工酶方法的基础上，将四层浓度胶(46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、154.0g/L)改为五层(46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、102.7g/L、154.0g/L)。结果：使血清PGDA-Ⅱ在PHC病人中的阳性率由原来的42.2%提高到67.6%，其阳性率与AFP、肿瘤大小无相关性。结论：进一步表明GPDA-Ⅱ为肝癌又一新的诊断指标，对PHC有特异性诊断价值。
, 百拇医药 Diagnostic Value of Serum PHC-Specific GPDA Isoenzyme
with a Modified Separation Method
Xiao Mingbing et al
Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital,Nantong Medical College, Nantong 226001
Abstract To improve the separative effect of glycylproline dipeptidyl aminopeptidase(GPDA)isoenzyme and raise the diagnostic value of the specific GPDA(GPDA-Ⅱ) for primary hepatic carcinoma (PHC), we modified the previously reported stage polyacryamide gel electrophoresis, four series concentraton gels (46.2g/L,77.0g/L,92.4g/L,154.0g/L)were changed to five (46.2g/L,77.0g/L,92.4g/L,102.7g/L,154.0g/L). The positive rates of serum GPDA-Ⅱ in the patients with PHC were raised from 42.2% to 67.6% by this method. There was no correlation between the positive rate of GPDA-Ⅱand AFP levels or the size of the tumors. It is suggested that GPDA-Ⅱ is a new diagnostic mark for PHC.
, 百拇医药
Key words Electrophoresis GPDA Isoenzyme PHC
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycylproline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA,EC.3.4,14.1)由Hopsu-Havu等发现，广泛分布于肝、肾、结缔组织、唾液腺中[1]。关于此酶及其同工酶对原发性肝癌(PHC)的诊断价值已有报道[2，3]。我们曾报道其同工酶分离方法，从阳极至阴极共分九条区带，其中近阳极端的GPDA -Ⅱ在PHC病人中阳性率达41.8%，与急、慢性肝炎，肝硬化病人有显著差异[3]，已引起临床重视。GPDA -Ⅱ带与Ⅰ带距离较近，加之区带间的弥散，有时影响结果判断。为此，本文对原法进行了改良并探讨了血清GPDA同工酶区带在PHC中的诊断价值。
对象与方法
一、对象 PHC71例，男56例，女15例，年龄30～76岁，平均53岁。癌瘤大小按B超或CT上显示的最大径线计，小于5cm者列为小肝癌。继发性肝癌10例，急性肝炎26例，慢性肝炎35例，肝炎后肝硬化24例，以上病例均为本院住院病例，诊断符合通用诊断标准。健康对照23名，为南通血站正常献血员。
, 百拇医药
二、方法 按原法配制电泳试剂及缓冲液，并同法制胶，五层凝胶的浓度由上至下分别为46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、102.7g/L、154.0g/L，各层胶配制如表1；加入待测样品40μ1(血清20μ1、蔗糖溴酚兰液20μ1)，稳压60V电泳约5小时后，加大电压至100V，16小时后结束电泳；取两张9.5cm×10.5cm醋纤膜，用底物液[GPA15mg、200g/L Tween 80 0.5ml、50.0g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.1ml、Tris -双甘肽4.8ml(含1g/L N-萘乙烯二胺盐酸盐)、100g/L NaNO2 0.1ml]浸湿，将凝胶包夹于两醋纤膜之间，置湿盒37℃孵育30分钟后，将薄膜置三氯醋酸甘油溶液中呈色，取出观察结果。
表1 各层胶配制方法(单位：ml) 试 剂
第一层
第二层
, 百拇医药
第三层
第四层
第五层
30.8%丙烯酰胺液
0.6
1.0
1.2
1.0
1.5
浓缩胶缓冲液
1.0
分离胶缓冲液
1.0
, http://www.100md.com
1.3
1.0
0.75
0.14%过硫酸铵
2.4
2.0
1.5
1.0
0.75
三、统计学分析 阳性率比较用四格表卡方检验。结 果
一、同工酶分离结果 呈色后醋纤膜上GPDA同工酶仍分为9条同工酶区带，从阳极至阴极依次命名为GPDA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……Ⅸ(如附图)。GPDA-Ⅰ大致相当于蛋白电泳像的α2-球蛋白区；Ⅱ带居后约0.5cm，较原法有所增宽，个别标本会出现Ⅱ′带；Ⅷ在分离胶原位；Ⅸ在加样原位，各区带间弥散度较原法小。
, 百拇医药
1.为正常人；2.为急性肝炎；7.为肝硬化；
3、4、5、6、8、9为PHC病人
附图：GPDA同工酶分离图谱(改良法)
二、各组受检者血清GPDA同工酶结果
用原法及改良法同时检测受检者血清GPDA同工酶，各类人群均可见较强Ⅰ带；Ⅱ带在健康人及继发性肝癌未检出，在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化患者中偶见；PHC患者Ⅱ带阳性率改良法(67.7%)明显高于原法(42.2%)(P<0.05)，但两者较其它组均显著升高(P<0.01)(见表2)；Ⅲ-Ⅸ带在不同血清组中皆不等出现，无明显差异。
表2 各组受检者血清GPDAⅡ阳性率 分 组
总例数
, 百拇医药
(原法)/(阳性例数(%))
(改良法)/(阳性例数(%))
PHC
71
30(42.2)*#
48(67.6)*
继发性肝癌
10
0(0)
0(0)
急性肝炎
26
, 百拇医药
2(7.7)
2(7.7)
肝炎后肝硬化
24
4(16.7)
3(12.5)
慢性肝炎
35
4(11.4)
3(8.6)
健康人
23
0(0)
, http://www.100md.com
0(0)
*与其它各组比P<0.01；#与改良法比P<0.05
三、PHC病人血清AFP与GPDA-Ⅱ的关系 由表3可见，PHC病人AFP阳性及阴性两组之间，GPDA-Ⅱ阳性率无显著性差异(P>0.05)。
表3 PHC患者血清AFP与GPDA-Ⅱ的关系 AFP(ng/ml)
例数
阳性例数
阳性率(%)
≤50
20
12
, http://www.100md.com
60.6
>50
51
34
66.7
四、小肝癌及中晚期肝癌患者血清GPDA -Ⅱ比较 血清GPDA-Ⅱ在小肝癌组的阳性率与中晚期肝癌组相比差异无显著性(P>0.05)，如表4。表4 小肝癌及中晚期肝癌血清中GPDA-Ⅱ结果 组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
小肝癌
28
, 百拇医药
16
57.1
中晚期肝癌
43
30
69.8
讨 论
GPDA是一种能分解肽链N - 端甘氨酰脯氨酸的二肽萘酰胺酶。由上皮细胞或间充质分化而产生的癌组织常含有胶原酶，能分解癌组织周围的胶原，因而可能与癌的浸润和扩散有关[4]，GPDA作为胶原分解过程中的一种二肽氨基肽酶，可能也起重要作用。其血清总活力在肝胆疾病时升高，肝癌时尤为明显，被公认为PHC有价值的肿瘤标记，但其同工酶的研究鲜见报道。本文对原同工酶分离法进行了改良并探讨了血清GPDA同工酶区带在PHC中的诊断价值。
, 百拇医药
GPDA同工酶的存在首先由Hino提出[5]，1986年松田佑太郎等在肝病患者血清中从阳极到阴极依次分出5条同工酶区带，其中Ⅱ带位于α1球蛋白和α2球蛋白区之间，在阻塞性黄疸与肝癌时升高。但未出现肝癌特异性区带[6]。我们曾在国内首次报道以聚丙烯酰胺阶段梯度胶分离血清GPDA同工酶，从阳极至阴极共分出九条区带，并发现PHC患者血清中GPDA-Ⅱ阳性率为41.8%，但其与Ⅰ带的距离较近，不易分辨，且各区带间有一定的弥散，对结果判断有一定影响。GPDA在人唾液腺中分子量为225000，在50～100g/L的浓度胶中能得到较好分离[3]，本文将原法四层胶改为五层(46.2g/L、77.0g/L、92.4g/L、102.7g/L、154.0g/L)，增加电泳分离过程中分子筛的作用，使Ⅰ带与Ⅱ带间距离增宽，减少了弥散，且GPDA-Ⅱ的阳性率提高为67.6%，进一步说明了GPDA-Ⅱ对PHC的诊断价值。
用原法及改良法同时对不同受检组中血清进行检测，判断GPDA-Ⅱ阳性结果，减少了抽样误差，使同一批标本中GPDA-Ⅱ在两法中测出不同的阳性率结果，充分说明改良法优于原法。AFP是公认的PHC血清学诊断指标，其对PHC的诊断率约在60～70%，但与肿瘤大小相关，在小肝癌中的阳性率较低。本研究中GPDA-Ⅱ阳性率在AFP阳性及阴性、小肝癌及中晚期肝癌各自两组患者之间，无统计学差异，提示GPDA-Ⅱ与AFP间无相关性。故对AFP阴性的PHC病人，GPDA-Ⅱ具有互补诊断的价值；对影像较难发现的小肝癌也有定性诊断价值。
, 百拇医药
本文结果显示，GPDA-Ⅱ对PHC诊断有特异性。我们对鼠及人肝癌血清和肝组织作GPDA同工酶检测，其中GPDA-Ⅱ仅出现于鼠癌前病变和癌变的肝组织和血清中，在对照组及细胞变性组中均为阴性；对人肝癌，GPDA-Ⅱ仅存在于肿瘤细胞无变性坏死的肝癌组织中，手术前后血清中其阳性率有显著性差异(另文发表)，进一步提示GPDA-Ⅱ为肝癌特异性同工酶区带，由癌变肝组织合成；其在继发性肝癌中表现为阴性，可能与肿瘤的组织来源有一定关系。GPDA-Ⅱ的检测，对PHC诊断、PHC与继发性肝癌的鉴别诊断及手术疗效的评价等均具有一定的临床价值 。
△ 本课题受省卫生厅资助
参考文献
[1] Hopsu Javu VK,et al.Histochemic 1996;7:197
[2] 叶胜龙，等.中华医学杂志1987；67(3)：134
[3] 肖明兵，等.临床检验杂志1996；14(4)：174
[4] 上海第一医学院主编.医用生物化学(下册).北京：人民卫生出版社，1979；57.
[5] Hino M,et al.Clin Chem 1976;22:1256.
[6] 松田佑太郎，等.临床病理(日)1986；8：981.
(1999年1月5日收稿 同年3月4日修回), 百拇医药