睾酮和雌二醇对大鼠草酸钙肾结石的影响
作者：常连胜 冯陶 姜学军 郭应禄 窦长琪 黄有媛
单位：100034 北京医科大学第一医院泌尿外科研究所
关键词：
中华医学杂志990826 男性尿石症发病率高于女性，提示性激素可能影响尿石症的发生。我们检测了肾结石大鼠应用睾酮和雌二醇后尿大分子抑制物骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)mRNA表达及尿晶体成分的变化，旨在进一步探讨性激素与肾结石的关系。
一、材料与方法
1.动物: 实验动物由本校实验动物中心提供。健康成年雄性SD大鼠36只，体重200～250g，随机分成6组,每组6只。
2.方法: 适应实验环境7天后开始实验。诱石剂为含质量浓度0.01 kg/L乙二醇和体积分数质量浓度为0.01 kg/L氯化铵的自来水。A组(对照组)：普通饲料+自来水；B组(单纯成石组)：普通饲料+诱石剂；C组：普通饲料+自来水+雌二醇(皮下注射，每只大鼠0.2 mg/d，连续用药1周)；D组：普通饲料+诱石剂+雌二醇；E组：普通饲料+自来水+睾酮(皮下注射，每只大鼠1 mg/d，连续用药1周)；F组：普通饲料+诱石剂+睾酮；于实验第7天用代谢笼收集A、B、D和F组大鼠24小时尿，-20℃保存。然后断颈处死，取出肾脏立即置液氮中，用Northern Blot方法测定鼠肾OPN mRNA的表达，异硫氰酸胍法快速提取RNA,质量浓度为0.012 kg/L的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，每泳道上样45 μg，虹吸转膜24小时，80℃烤膜2小时，随机引物法32P标记的dCTP 合成cDNA探针，42℃杂交36小时，洗膜后在-70℃条件下放射自显影。
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3.测定指标： 用Molecular Analyst 软件对Northern Blot结果进行图像分析，测条带的灰度值。应用乙二胺四乙酸二钠滴定法测尿钙和尿镁，光电比色法(721分光光度计)测定尿磷、草酸、尿酸和柠檬酸。偏光显微镜观察鼠肾成石情况。
4.统计学处理: 所有资料均用均数±标准差表示，组间差异显著性检验采用Graph PAD软件进行t检验。
二、结果
1.Northern Blot结果：由图1可见，给大鼠应用诱石剂、睾酮及雌二醇后可使鼠肾OPN mRNA表达量升高6～7倍；诱石剂与睾酮或雌二醇合用对鼠肾OPN mRNA表达的刺激作用呈相加效应。
图1 睾酮，雌二醇及诱石剂对鼠肾OPN mRNA表达的影响
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2.尿晶体成分的变化：由表1可见，单纯成石(B)组尿钙和草酸高于对照(A)组(t值分别为6.24和6.52，P<0.05) ,尿镁和柠檬酸明显低于对照组(t值分别为4.36和4.16，P<0.05)。雌二醇+诱石剂(D)组尿钙和草酸明显低于单纯成石组(t值分别为6.96和4.38 ，P<0.05),尿柠檬酸高于单纯成石组(t值为7.57，P<0.05)。睾酮+诱石剂(F)组尿钙和草酸明显低于单纯成石组(t值分别为4.75和3.71，P<0.05)，尿镁明显高于单纯成石组(t值为2.29，P<0.05)。
表1 肾结石大鼠尿晶体成分的变化(
±s) 组别
鼠数
钙(mmol/L)
镁(mmol/L)
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磷(mmol/L)
草酸(μmol/L)
柠檬酸(mmol/L)
尿酸(mmol/L)
A组
6
2.5±0.5
2.89±1.26
33±8
0.90±0.21
12.9±5.9
1.33±0.41
, 百拇医药
B组
6
5.1±0.9*
0.51±0.45*
36±7
3.01±0.80*
2.9±0.8*
1.52±0.46
D组
6
2.0±0.6△
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0.70±0.44*
34±1
1.54±0.07△
6.7±0.9*△
3.16±0.14*△
F组
6
2.4±1.0△
1.64±1.12*△
32±4
1.59±0.49△
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3.6±1.7*
1.91±0.36*
注：与A组比较*t=6.24，6.52，P<0.05; 与B组比较△t=4.75，3.71，P<0.05
3.偏光显微镜观察：对照组鼠肾切面未见晶体沉积，单纯成石组鼠肾可见大量晶体，诱石剂与睾酮或雌二醇合用的大鼠肾脏仅有散在晶体分布。
三、讨论
尿液晶体成分经常处于过饱和状态，正常人之所以不产生肾结石，是因为尿中还存在着阻止晶体生长和聚集的抑制物，低分子的抑制物包括焦磷酸盐、镁和柠檬酸，大分子抑制物主要是葡胺聚糖、TH蛋白、肾钙素、尿凝血酶原片段-1、A-胰蛋白酶抑制物及OPN。OPN是一种具有多种功能的磷酸化糖蛋白，相对分子质量约51 500，富含门冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸，在体外可抑制草酸钙晶体的生长，尿OPN的浓度在一定程度上反映了尿的抗结石形成能力[1]。
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流行病学调查及临床观察显示，目前尿石症发病高峰在20～40岁，发病率男性为女性的2～4倍[2]。草酸钙结石以男性发病为主，磷酸盐主要发生于女性，此年龄组性激素水平较高；另有学者发现肾结石病人尿睾酮浓度明显低于正常对照组[3]，因此性激素与尿石症的关系值得探讨。我们对大鼠肾结石模型为期7天的研究结果显示，诱石剂可使大鼠尿钙和草酸排泄量明显升高; 雄激素和雌激素可降低大鼠尿草酸及尿钙，睾酮可提高尿镁浓度，雌二醇则促进尿柠檬酸的分泌；大鼠肾脏OPN mRNA的表达量明显增加，可使尿中OPN的分泌增加，提示性激素起着保持和提高机体处理高草酸负荷的能力。Lee等[4]长达4周的慢性实验结果显示雄激素可能促进肾结石形成，雌激素起抑制作用。我们推测长期应用大剂量外源性雄激素可使大鼠内分泌系统发生紊乱，激素与受体比例失衡，食欲改善，诱石剂摄入量增加，草酸负荷持续过高，机体总体抗成石机能失衡，逐渐形成肾结石。男女肾结石发病率的不同不应完全归因于性激素，还要考虑到其饮食生活习惯、劳动环境和强度等差别。
, 百拇医药
本研究结果表明，雄激素和雌激素的直接作用是降低尿草酸的分泌，促进尿骨桥蛋白，镁和柠檬酸等尿中抑制物的分泌，从而抑制肾结石形成。由于尿石症是多因素疾病，外源性给予性激素的生理效果可能有别于内源性激素，长期应用性激素对结石形成过程的影响可能有更复杂的机制，尚有待进一步研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39670722)
参考文献
1 姜学军，冯陶，常连胜，等.骨桥蛋白在人肾和鼠肾中的表达.中华医学杂志,1998,11:871-872.
2 Balaji KC，Menon M.Mechanism of stone formation.Urol Clin North Am,1997,24:1-11.
3 van Aswegen CH，Hurter P，van der Merwe CA，et al.The relationship between total urinary testosterone and renal calculi.Urol Res，1989,17:181-183.
4 Lee YH，Huang WC，Huang JK，et al.Testosterone enhances whereas estrogen inhibits calcium oxalate stone formation in ethylene glycol treated rats.J Urol，1996,156:502-505.
(收稿：1998-10-15 修回：1999-02-20), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院泌尿外科研究所
关键词：
中华医学杂志990826 男性尿石症发病率高于女性，提示性激素可能影响尿石症的发生。我们检测了肾结石大鼠应用睾酮和雌二醇后尿大分子抑制物骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)mRNA表达及尿晶体成分的变化，旨在进一步探讨性激素与肾结石的关系。
一、材料与方法
1.动物: 实验动物由本校实验动物中心提供。健康成年雄性SD大鼠36只，体重200～250g，随机分成6组,每组6只。
2.方法: 适应实验环境7天后开始实验。诱石剂为含质量浓度0.01 kg/L乙二醇和体积分数质量浓度为0.01 kg/L氯化铵的自来水。A组(对照组)：普通饲料+自来水；B组(单纯成石组)：普通饲料+诱石剂；C组：普通饲料+自来水+雌二醇(皮下注射，每只大鼠0.2 mg/d，连续用药1周)；D组：普通饲料+诱石剂+雌二醇；E组：普通饲料+自来水+睾酮(皮下注射，每只大鼠1 mg/d，连续用药1周)；F组：普通饲料+诱石剂+睾酮；于实验第7天用代谢笼收集A、B、D和F组大鼠24小时尿，-20℃保存。然后断颈处死，取出肾脏立即置液氮中，用Northern Blot方法测定鼠肾OPN mRNA的表达，异硫氰酸胍法快速提取RNA,质量浓度为0.012 kg/L的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，每泳道上样45 μg，虹吸转膜24小时，80℃烤膜2小时，随机引物法32P标记的dCTP 合成cDNA探针，42℃杂交36小时，洗膜后在-70℃条件下放射自显影。
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3.测定指标： 用Molecular Analyst 软件对Northern Blot结果进行图像分析，测条带的灰度值。应用乙二胺四乙酸二钠滴定法测尿钙和尿镁，光电比色法(721分光光度计)测定尿磷、草酸、尿酸和柠檬酸。偏光显微镜观察鼠肾成石情况。
4.统计学处理: 所有资料均用均数±标准差表示，组间差异显著性检验采用Graph PAD软件进行t检验。
二、结果
1.Northern Blot结果：由图1可见，给大鼠应用诱石剂、睾酮及雌二醇后可使鼠肾OPN mRNA表达量升高6～7倍；诱石剂与睾酮或雌二醇合用对鼠肾OPN mRNA表达的刺激作用呈相加效应。
图1 睾酮，雌二醇及诱石剂对鼠肾OPN mRNA表达的影响
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2.尿晶体成分的变化：由表1可见，单纯成石(B)组尿钙和草酸高于对照(A)组(t值分别为6.24和6.52，P<0.05) ,尿镁和柠檬酸明显低于对照组(t值分别为4.36和4.16，P<0.05)。雌二醇+诱石剂(D)组尿钙和草酸明显低于单纯成石组(t值分别为6.96和4.38 ，P<0.05),尿柠檬酸高于单纯成石组(t值为7.57，P<0.05)。睾酮+诱石剂(F)组尿钙和草酸明显低于单纯成石组(t值分别为4.75和3.71，P<0.05)，尿镁明显高于单纯成石组(t值为2.29，P<0.05)。
表1 肾结石大鼠尿晶体成分的变化(
±s) 组别鼠数
钙(mmol/L)
镁(mmol/L)
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磷(mmol/L)
草酸(μmol/L)
柠檬酸(mmol/L)
尿酸(mmol/L)
A组
6
2.5±0.5
2.89±1.26
33±8
0.90±0.21
12.9±5.9
1.33±0.41
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B组
6
5.1±0.9*
0.51±0.45*
36±7
3.01±0.80*
2.9±0.8*
1.52±0.46
D组
6
2.0±0.6△
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0.70±0.44*
34±1
1.54±0.07△
6.7±0.9*△
3.16±0.14*△
F组
6
2.4±1.0△
1.64±1.12*△
32±4
1.59±0.49△
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3.6±1.7*
1.91±0.36*
注：与A组比较*t=6.24，6.52，P<0.05; 与B组比较△t=4.75，3.71，P<0.05
3.偏光显微镜观察：对照组鼠肾切面未见晶体沉积，单纯成石组鼠肾可见大量晶体，诱石剂与睾酮或雌二醇合用的大鼠肾脏仅有散在晶体分布。
三、讨论
尿液晶体成分经常处于过饱和状态，正常人之所以不产生肾结石，是因为尿中还存在着阻止晶体生长和聚集的抑制物，低分子的抑制物包括焦磷酸盐、镁和柠檬酸，大分子抑制物主要是葡胺聚糖、TH蛋白、肾钙素、尿凝血酶原片段-1、A-胰蛋白酶抑制物及OPN。OPN是一种具有多种功能的磷酸化糖蛋白，相对分子质量约51 500，富含门冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸，在体外可抑制草酸钙晶体的生长，尿OPN的浓度在一定程度上反映了尿的抗结石形成能力[1]。
, 百拇医药
流行病学调查及临床观察显示，目前尿石症发病高峰在20～40岁，发病率男性为女性的2～4倍[2]。草酸钙结石以男性发病为主，磷酸盐主要发生于女性，此年龄组性激素水平较高；另有学者发现肾结石病人尿睾酮浓度明显低于正常对照组[3]，因此性激素与尿石症的关系值得探讨。我们对大鼠肾结石模型为期7天的研究结果显示，诱石剂可使大鼠尿钙和草酸排泄量明显升高; 雄激素和雌激素可降低大鼠尿草酸及尿钙，睾酮可提高尿镁浓度，雌二醇则促进尿柠檬酸的分泌；大鼠肾脏OPN mRNA的表达量明显增加，可使尿中OPN的分泌增加，提示性激素起着保持和提高机体处理高草酸负荷的能力。Lee等[4]长达4周的慢性实验结果显示雄激素可能促进肾结石形成，雌激素起抑制作用。我们推测长期应用大剂量外源性雄激素可使大鼠内分泌系统发生紊乱，激素与受体比例失衡，食欲改善，诱石剂摄入量增加，草酸负荷持续过高，机体总体抗成石机能失衡，逐渐形成肾结石。男女肾结石发病率的不同不应完全归因于性激素，还要考虑到其饮食生活习惯、劳动环境和强度等差别。
, 百拇医药
本研究结果表明，雄激素和雌激素的直接作用是降低尿草酸的分泌，促进尿骨桥蛋白，镁和柠檬酸等尿中抑制物的分泌，从而抑制肾结石形成。由于尿石症是多因素疾病，外源性给予性激素的生理效果可能有别于内源性激素，长期应用性激素对结石形成过程的影响可能有更复杂的机制，尚有待进一步研究。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39670722)
参考文献
1 姜学军，冯陶，常连胜，等.骨桥蛋白在人肾和鼠肾中的表达.中华医学杂志,1998,11:871-872.
2 Balaji KC，Menon M.Mechanism of stone formation.Urol Clin North Am,1997,24:1-11.
3 van Aswegen CH，Hurter P，van der Merwe CA，et al.The relationship between total urinary testosterone and renal calculi.Urol Res，1989,17:181-183.
4 Lee YH，Huang WC，Huang JK，et al.Testosterone enhances whereas estrogen inhibits calcium oxalate stone formation in ethylene glycol treated rats.J Urol，1996,156:502-505.
(收稿：1998-10-15 修回：1999-02-20), 百拇医药