锤头结构核酶在人肝癌细胞内对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用
作者：贾战生 周永兴 连建奇 冯志华 李谨革 焦成松 李光玉 张文彬
单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院传染病防治中心
关键词：
中华医学杂志990824 锤头结构核酶(hammerhead ribozyme，HhRz)分子较小、结构简单、易于设计合成，已广泛用于抗病毒和抗肿瘤的研究。丙型肝炎病毒(HCV)非编码区(5′NCR)和核心(C)区高度保守，具有重要的生物学功能，是基因治疗选择的理想靶序列。5′NCR有核糖体结合位点，以非帽依赖方式合成病毒蛋白，对病毒的复制、病毒蛋白的翻译和启动起重要的调节作用。我们以Alt等[1]构建的pCMVNCRluc载体为靶基因，应用计算机选择设计理想的锤头结构Rz，并通过脂质体介导的基因共转染方法，研究抗HCV 5′NCR Rz在细胞内对HCV基因表达的抑制作用。
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一、材料与方法
1.Rz的计算机辅助设计：采用中国科学院上海生物化学研究所陈农安编制的Rz设计软件[2]，以HCV-H株(GeneBank号为M67436)的cDNA为靶序列，根据Symons“锤头结构”模型[3]，确定Rz中心催化区碱基序列(22nt)，运用能量最低化原理，计算Rz自然切点(CUX和GUX)的能级参数(AEs′)，选择AEs′较低的位点作为Rz的预选位点，确定理论上最佳的Rz碱基序列。
2.Rz载体的构建：真核载体pcDNA3由本校生化教研室惠宏襄博士惠赠。体外合成抗HCV 5′NCR的Rz213和Rz 260的单链DNA，经变性退火，然后构建Rz载体并酶切鉴定[4]。
3.Rz基因与靶基因的细胞共转染与检测：用体积分数为10%小牛血清RPMI-1640常规培养人肝癌细胞株(human hepatic carcinoma cell，HHCC，由本校863研究室提供)，转染前16～20小时消化细胞接种于6孔培养板(1×105个细胞/孔)，待细胞生长至50%～70%融合时，转染经脂质体包裹的Rz和靶基因。转染方法按试剂盒说明操作(Lipofectamine和G418为Gibco产品)。继续培养，传代，不同时间收集细胞，裂解，收集上清。检测荧光素酶(luciferase，luc)活性，按试剂盒说明操作。用液体闪烁计数仪计cpm(次/分)值[5]。
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4.统计学分析：数据均以均值±标准差(
±s)表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
二、结果
1.计算机设计的Rz：(1)抗HCV Rz的切点和理论参数，在HCV-H株5′NCR和C区的915 nt中，有“锤头结构”Rz的自然切点124个。计算机辅助设计发现213，260，407和498个切点比较理想。Rz与底物RNA相互作用的能级参数比较低，表1。(2)锤头结构Rz的二级结构：计算机模拟显示，上述Rz切点及两翼靶RNA序列形成突出的环状结构，切点暴露，对应的Rz二级结构显示锤头状，Rz与靶RNA作用的二级结构模式，见图1。
图1 Rz与靶切点两翼RNA作用的二级结构模式
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表1 抗HCV Rz的四个理论切点的计算机分析 Rz
切割
位点
识别
密码
互补碱基对
能级参数
5′端
3′端
ΔEs′
ΔEr′
(ΔEr′)*
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ΔE
Rz1
213
CUC
7
7
4.2
6.0
2.8
-28.9
Rz2
260
GUA
, http://www.100md.com 7
7
5.5
1.3
-24.8
Rz3
407
GUC
8
7
4.1
12.2
5.5
-26.8
, 百拇医药
Rz4
498
CUU
8
7
2.1
10.9
6.7
-26.1
ΔEs′底物从稳定态转化为松弛态所需的能量；ΔEr′Rz从稳定态转化为松弛态所需的能量，*改变后的Rz，ΔE Rz与底物结合所需的能量
2.重组载体的鉴定：酶切结果表明，体外转录载体与真核表达载体的连接正确[4]。对Rz 213的测序结果表明，与设计合成的Rz序列完全一致。
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3.Rz在细胞内对HCV的抑制作用：(1)Rz基因在HHCC细胞中的表达应用标记的Rz单链DNA探针，通过Rz打点杂交方法检测表明，在转染后第3天和用G418筛选后的20天均可检出Rz RNA，说明转染的Rz真核表达载体在细胞内表达Rz分子RNA。(2)pCMVNCRluc在HHCC细胞内的表达：图2结果表明，转染后48小时luc的活性最高，cpm值可达2×106次/分以上，第4天开始下降，第10天下降至本底水平。(3)Rz213与pCMVNCRluc共转染对luc活性的抑制作用：图3表明Rz组和对照组(以空载体pcDNA3为对照)在转染后不同时间的cpm值，Rz对luc的表达有明显的抑制作用。以同一时间点对照组cpm值为100%，计算Rz组的抑制率[(对照组cpm-Rz组cpm/对照组cpm)×100]，第3、4、5天抑制率分别为37.8%、64.5%和87%。
图2 pCMVNCR luc在人肝癌细胞内的表达
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图3 Rz 213与pCMVNCR luc共转染对luc表达的抑制作用
三、讨论
计算机辅助设计是目前Rz研究中比较常用的方法，通过计算机设计可减少研究中的脿目性，避免一些不必要的浪费。本研究选择HCV-H株中高度保守的5′NCR和C为靶，根据锤头结构Rz的设计原理，应用计算机模拟显示底物和Rz可能形成的二级结构，并分析各能级参数，从HCV5′NCR和C区124个切点中选择了理论上最理想的4个切点，设计了4个锤头结构Rz。在设计过程中改变了Rz213，Rz407和Rz498锤头结构中的一个碱基，将C换成G，结果能级参数(ΔEr′)明显变小。载体介导的内源性Rz在细胞内能否彻底清除病毒与Rz表达的copy数有直接关系[6]。借鉴体外切割实验的数据，Rz在细胞内要达到完全清除病毒，其分子数必需是靶基因的100倍以上，并要求Rz能到达所有HCV感染的肝细胞和非肝细胞。本研究选择pcDNA3作为真核载体是由于该载体表达效率高，多克隆位点的多，构建容易。pCMVNCRluc含HCV5′NCR和C区66nt，其C区3′端与luc报告基因融合，检测luc的活性可间接反映Rz在细胞内的抑制效应。本研究结果证明，我们设计的HCV5′ NCR Rz可有效地抑制luc基因的表达，在不同时间其抑制率在35%～70%之间，与Sakamoto等[7]的报道一致。然而，在细胞内的抑制效率还取决于携带靶基因载体的表达效率，两者表达效率之比可能是影响Rz抑制率的关键因素之一。综上所述，抗HCV 5′NCR和C区Rz可在HHCC细胞内表达，并有效地抑制pCMVNCRluc基因的表达，为进一步抗HCV动物实验和体内实验奠定了基础。
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本课题为全军医药卫生科研基金资助项目(98D048)
参考文献
1 Alt M，Renz R，Hofchneider PH，et al.Specific inhibition of hepatitis c viral gene expression by antisense phosphorothioate oligodeoxynu-cleotides.Hepatology，1995,21：707-717.
2 陆长德，陈农安，祁国荣.Rz对靶RNA的体外切割反应的计算机分析.生物化学与生物物理学报，1996，28：279-285.
3 Symons RH.Small catalytic RNAs.Ann Biochem，1992,61：64-71.
, 百拇医药
4 贾战生，周永兴，连建奇，等.抗丙型肝炎病毒5′非编码区Rz自剪切真核表达载体的构建.第四军医大学学报，1998，19：216.
5 李勇年，王勤环，斯崇文，等.丙型肝炎病毒基因调控细胞模型的建立及其意义.中华医学杂志，1997，77：609-611.
6 Lieber A，He C-Y，Polyak SJ，et al.Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human heptocyte by adenovirus-mediated expression of ribozymes.J Virol，1996,70：8782-8791.
7 Sakamoto N，Wu C-H and Wu G-Y.Intracellular cleavage of hepatitis C virus RNA and inhibition of viral protein translation by hammerhead ribozymes.J Clin Invest，1996,89：2720-2728.
(收稿：1998-08-24 修回：1999-01-10), http://www.100md.com
单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院传染病防治中心
关键词：
中华医学杂志990824 锤头结构核酶(hammerhead ribozyme，HhRz)分子较小、结构简单、易于设计合成，已广泛用于抗病毒和抗肿瘤的研究。丙型肝炎病毒(HCV)非编码区(5′NCR)和核心(C)区高度保守，具有重要的生物学功能，是基因治疗选择的理想靶序列。5′NCR有核糖体结合位点，以非帽依赖方式合成病毒蛋白，对病毒的复制、病毒蛋白的翻译和启动起重要的调节作用。我们以Alt等[1]构建的pCMVNCRluc载体为靶基因，应用计算机选择设计理想的锤头结构Rz，并通过脂质体介导的基因共转染方法，研究抗HCV 5′NCR Rz在细胞内对HCV基因表达的抑制作用。
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一、材料与方法
1.Rz的计算机辅助设计：采用中国科学院上海生物化学研究所陈农安编制的Rz设计软件[2]，以HCV-H株(GeneBank号为M67436)的cDNA为靶序列，根据Symons“锤头结构”模型[3]，确定Rz中心催化区碱基序列(22nt)，运用能量最低化原理，计算Rz自然切点(CUX和GUX)的能级参数(AEs′)，选择AEs′较低的位点作为Rz的预选位点，确定理论上最佳的Rz碱基序列。
2.Rz载体的构建：真核载体pcDNA3由本校生化教研室惠宏襄博士惠赠。体外合成抗HCV 5′NCR的Rz213和Rz 260的单链DNA，经变性退火，然后构建Rz载体并酶切鉴定[4]。
3.Rz基因与靶基因的细胞共转染与检测：用体积分数为10%小牛血清RPMI-1640常规培养人肝癌细胞株(human hepatic carcinoma cell，HHCC，由本校863研究室提供)，转染前16～20小时消化细胞接种于6孔培养板(1×105个细胞/孔)，待细胞生长至50%～70%融合时，转染经脂质体包裹的Rz和靶基因。转染方法按试剂盒说明操作(Lipofectamine和G418为Gibco产品)。继续培养，传代，不同时间收集细胞，裂解，收集上清。检测荧光素酶(luciferase，luc)活性，按试剂盒说明操作。用液体闪烁计数仪计cpm(次/分)值[5]。
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4.统计学分析：数据均以均值±标准差(
±s)表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。二、结果
1.计算机设计的Rz：(1)抗HCV Rz的切点和理论参数，在HCV-H株5′NCR和C区的915 nt中，有“锤头结构”Rz的自然切点124个。计算机辅助设计发现213，260，407和498个切点比较理想。Rz与底物RNA相互作用的能级参数比较低，表1。(2)锤头结构Rz的二级结构：计算机模拟显示，上述Rz切点及两翼靶RNA序列形成突出的环状结构，切点暴露，对应的Rz二级结构显示锤头状，Rz与靶RNA作用的二级结构模式，见图1。
图1 Rz与靶切点两翼RNA作用的二级结构模式
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表1 抗HCV Rz的四个理论切点的计算机分析 Rz
切割
位点
识别
密码
互补碱基对
能级参数
5′端
3′端
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ΔE
Rz1
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5.5
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-24.8
Rz3
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Rz4
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CUU
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2.1
10.9
6.7
-26.1
ΔEs′底物从稳定态转化为松弛态所需的能量；ΔEr′Rz从稳定态转化为松弛态所需的能量，*改变后的Rz，ΔE Rz与底物结合所需的能量
2.重组载体的鉴定：酶切结果表明，体外转录载体与真核表达载体的连接正确[4]。对Rz 213的测序结果表明，与设计合成的Rz序列完全一致。
, http://www.100md.com
3.Rz在细胞内对HCV的抑制作用：(1)Rz基因在HHCC细胞中的表达应用标记的Rz单链DNA探针，通过Rz打点杂交方法检测表明，在转染后第3天和用G418筛选后的20天均可检出Rz RNA，说明转染的Rz真核表达载体在细胞内表达Rz分子RNA。(2)pCMVNCRluc在HHCC细胞内的表达：图2结果表明，转染后48小时luc的活性最高，cpm值可达2×106次/分以上，第4天开始下降，第10天下降至本底水平。(3)Rz213与pCMVNCRluc共转染对luc活性的抑制作用：图3表明Rz组和对照组(以空载体pcDNA3为对照)在转染后不同时间的cpm值，Rz对luc的表达有明显的抑制作用。以同一时间点对照组cpm值为100%，计算Rz组的抑制率[(对照组cpm-Rz组cpm/对照组cpm)×100]，第3、4、5天抑制率分别为37.8%、64.5%和87%。
图2 pCMVNCR luc在人肝癌细胞内的表达
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图3 Rz 213与pCMVNCR luc共转染对luc表达的抑制作用
三、讨论
计算机辅助设计是目前Rz研究中比较常用的方法，通过计算机设计可减少研究中的脿目性，避免一些不必要的浪费。本研究选择HCV-H株中高度保守的5′NCR和C为靶，根据锤头结构Rz的设计原理，应用计算机模拟显示底物和Rz可能形成的二级结构，并分析各能级参数，从HCV5′NCR和C区124个切点中选择了理论上最理想的4个切点，设计了4个锤头结构Rz。在设计过程中改变了Rz213，Rz407和Rz498锤头结构中的一个碱基，将C换成G，结果能级参数(ΔEr′)明显变小。载体介导的内源性Rz在细胞内能否彻底清除病毒与Rz表达的copy数有直接关系[6]。借鉴体外切割实验的数据，Rz在细胞内要达到完全清除病毒，其分子数必需是靶基因的100倍以上，并要求Rz能到达所有HCV感染的肝细胞和非肝细胞。本研究选择pcDNA3作为真核载体是由于该载体表达效率高，多克隆位点的多，构建容易。pCMVNCRluc含HCV5′NCR和C区66nt，其C区3′端与luc报告基因融合，检测luc的活性可间接反映Rz在细胞内的抑制效应。本研究结果证明，我们设计的HCV5′ NCR Rz可有效地抑制luc基因的表达，在不同时间其抑制率在35%～70%之间，与Sakamoto等[7]的报道一致。然而，在细胞内的抑制效率还取决于携带靶基因载体的表达效率，两者表达效率之比可能是影响Rz抑制率的关键因素之一。综上所述，抗HCV 5′NCR和C区Rz可在HHCC细胞内表达，并有效地抑制pCMVNCRluc基因的表达，为进一步抗HCV动物实验和体内实验奠定了基础。
, http://www.100md.com
本课题为全军医药卫生科研基金资助项目(98D048)
参考文献
1 Alt M，Renz R，Hofchneider PH，et al.Specific inhibition of hepatitis c viral gene expression by antisense phosphorothioate oligodeoxynu-cleotides.Hepatology，1995,21：707-717.
2 陆长德，陈农安，祁国荣.Rz对靶RNA的体外切割反应的计算机分析.生物化学与生物物理学报，1996，28：279-285.
3 Symons RH.Small catalytic RNAs.Ann Biochem，1992,61：64-71.
, 百拇医药
4 贾战生，周永兴，连建奇，等.抗丙型肝炎病毒5′非编码区Rz自剪切真核表达载体的构建.第四军医大学学报，1998，19：216.
5 李勇年，王勤环，斯崇文，等.丙型肝炎病毒基因调控细胞模型的建立及其意义.中华医学杂志，1997，77：609-611.
6 Lieber A，He C-Y，Polyak SJ，et al.Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human heptocyte by adenovirus-mediated expression of ribozymes.J Virol，1996,70：8782-8791.
7 Sakamoto N，Wu C-H and Wu G-Y.Intracellular cleavage of hepatitis C virus RNA and inhibition of viral protein translation by hammerhead ribozymes.J Clin Invest，1996,89：2720-2728.
(收稿：1998-08-24 修回：1999-01-10), http://www.100md.com