不同肠系膜上动脉灌注液对小肠功能影响的实验研究
作者：倪绍忠 陈国玉
单位：南京医科大学第一附属医院普外科(210029)
关键词：
江苏医药990816 肠系膜上动脉 (SMA)阻断和重建在胸腹主动脉瘤术中较为常见。我们采用异搏定和能量合剂经SMA灌注，以观察两种药物于完全阻断60分种和再灌注30分钟两时相对小肠组织ATP酶活性和ATP含量的影响，以期增加小肠对缺血/再灌注损伤(I/R)的耐受性，现报告如下。
材料和方法
一、动物模型制作方法及标本取材：正常青紫兰灰兔15只，雌雄不限，体查1.8～2.3kg，由南京医科大学动物实验中心提供。将15只灰兔随机分为3组，分别经SMA灌注异搏定(0.15mg/kg)、能量合剂和生理盐水。实验前12小时禁食，正常饮水。麻醉满意后，常规固定，消毒，铺巾；下腹部正中切口，进腹后暴露出腹主动脉、下腔静脉；沿腹主动脉鞘内，左肾动脉上方寻找到SMA，充分游离该动脉，以无损伤动脉夹钳夹SMA根部，立即以5号半针头插入SMA灌注上述三种药物，分别于缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟三个时刻，于屈氏韧带下50cm处取小肠各三段，待测细胞膜Na+-k+ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性及肠组织ATP含量。
, 百拇医药
二、试剂：ATP酶检测试剂盒、组织蛋白定量试剂盒由南京市建成医药公司提供；标准ATP-Na2由上海医药公司提供。
三、实验仪器(1)Waters高效液相色谱仪(美国)；(2)721分光光度检测仪(上海第三分析仪器厂)。
四、观察及检测指标：1.ATP酶活性检测：取0.5g左右组织块用冰冷(4°c)的生理盐水经低温匀浆、离心(3500转/min)15分钟，弃去沉淀，取100μl上清液(含细胞膜成分)按南京建成公司提供试剂盒加入所需试剂，经离心孵育后，于660nm处测各种ATP酶的吸光度值。同时绘制Pi标准曲线，并进行组织蛋白定量。2.高效液相法(HPLC)测肠组织ATP含量：取300mg 左右组织块，精确到0.001g，加2ml浓度为0.56mol/L高氯酸，低温匀浆。将匀浆液低温离心(3660r/min)10分钟，取上清，加等当量10mol/L氢氧化钾中和，使pH值达7.0，出现沉淀，再次离心10分钟，取20μl上清液测肠组织ATP含量。同时绘制ATP-Na2标准曲线。
, http://www.100md.com
五、数据处理：本文表格中数据均采用平均数±标准差(
±s)表示，采用方差齐性F检验和校正t′检验进行统计学分析。
结 果
一、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后的Na+-k+ATP酶活性变化 各组缺血即刻Na+-k+ATP酶活性无差异，完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后生理盐水灌注组Na+-K+ATP酶活性明显下降(P<0.01);VER灌注组，能量合剂灌注组Na+-k+ATP酶活性同一时刻于对照组比较有显著性改善(P<0.01,表1)。
, 百拇医药
表1 各组缺血、再灌注前后Na+-k+ATP酶活性比较 单位(μMPi.mg-1.h-1) 分 组
缺血即刻
完全阻断60分钟
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
12.022±1.475
6.240±1.458**
1.067±0.350**
VER灌注组
, 百拇医药
10.501±1.404
12.445±3.219△△
10.775±3.227△△
能量合剂灌注组
10.825±2.026
9.285±2.502
8.444±2.128△△
注：**缺血前后于再灌注前后比较(P<0.01)
△△分别与对照组比较(P<0.01)△(P<0.05)
, 百拇医药 两样本比较校正t’检验
二、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟的Mg2+-ATP酶活性比较各组缺血即刻Mg2+-ATP酶活性无差异；完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后生理盐水灌注组Mg2+-ATP酶活性明显下降(P<0.01),VER灌注组Mg2+-ATP酶活性，用一时刻于对照组比较有显著性改善(P<0.01);能量合剂灌注组Mg2+-ATP酶活性仅于再灌注30分钟前后优于对照组(P<0.01);VER灌注组再灌注30分钟前后优于能量合剂灌注组(P<0.05,表2)。
表2 各组缺血、再灌注前后mg2+-ATP酶活性比较单位：(μMPi.mg-1.h-1) 分 组
, 百拇医药 缺血即刻
完全阻断60分钟
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
12.577±1.640
7.739±0.871**
0.870±0.340**
VER灌注组
11.567±1.452
13.354±2.905△△
11.333±2.624△△□
, 百拇医药
能量合剂灌注组
10.961±2.071
9.744±2.337
7.425±1.659△△
注：**缺血前后与再灌注前后比较(P<0.01)
△△各灌注组与生理盐水灌注组比较(P<0.01)
□VER灌注组与能量合剂灌注组比较(P<0.05)
□ 两样本比较校正t'检验
三、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟的Ca2+-ATP酶活性比较各组缺血即刻Ca2+-ATP酶活性无差异；完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后生理盐水灌注组Ca2+-ATP酶活性明显下降(P<0.01)；VER灌注组，能量合剂灌注组Ca2+-ATP酶活同一时刻于对照组比较有显著性意义(P<0.01，表3)。
, 百拇医药
表3 各组缺血、再灌注前后Ca2+-ATP酶活性比较单位：(μMPi.mg-1.h-1) 分 组
缺血即刻
完全阻断60分钟
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
13.704±2.370
5.752±1.074**
0.873±0.357**
VER灌注组
, 百拇医药
10.617±1.634
10.973±3.033△△
10.118±3.425△△
能量合剂灌注组
11.676±2.410
10.376±2.844△△
7.634±1.404△△
注：**缺血前后与再灌注前后比较(P<0.01)
△△各灌注组与生理盐水灌注组比较(P<0.01)
, http://www.100md.com 两样本比较校正t'检验
四、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟的肠组织ATP含量较生理盐水灌注组在缺血和再灌注前后ATP含量有显著下降(P<0.01);与缺血即刻相比，ATP保存率分别为36.06%和20.12%(P<0.01)；VER灌注组ATP含量先下降后上升，与缺血即刻相比，ATP保存率分别为56.18%和80.28%；与相应时刻对照组相比也存在显著性差异(P<0.01)。能量合剂灌注组ATP含量同样是先下降后上升，与缺血即刻相比 ，ATP保存率分别为61.30%和77.30%；相应时刻ATP含量也明显优于对照组(P<0.01(表4)。
表4 各组缺血、再灌注前后肠组织内ATP含量比较 单位：(μmol.g-1) 分 组
缺血即刻
全完阻断60分钟
, 百拇医药
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
1.004±0.167
0.362±0.080**
0.202±0.066**
能量合剂灌注组
0.969±0.284
0.594±0.090△△
0.749±0.280△△
VER灌注组
, 百拇医药
1.004±0.114
0.564±0.097*△△
0.806±0.184△△
注：**安全阻断再灌注前后比较(P<0.01),*(P<0.05)
△△与生理盐水对照组比较(P<0.01)
两样本比较校正t'检验讨 论
ATP酶主要包括Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶，对于维持细胞内外离子平衡有重要保护作用。
异搏定(verapamil)作为临床上常见的钙离子拮抗剂最早用于心律失常的治疗，现已广泛地运用于胃、肾、脑、肝等组织器官的I/R损伤。
, 百拇医药
国内顾玉东等将能量合剂用于离断肢体保护，发现能量合剂对血管和骨骼肌超微结构及细胞膜Na+-k+ATP酶和Ca2+-ATP酶活性有明显保护作用。国外Chaudry等则发现ATP-MgCl2能保护肝脏I/R损伤。
我们用异搏定和能量合剂保护小肠I/R损伤时Na+-k+ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性，发现两种药物能明显保护小肠的三种ATP酶活性(P<0.01)。生理盐水灌注组缺血再灌注前后三种酶的活性均显著下降(P<0.01)。
ATP是体内细胞能够直接利用的唯一能量来源，它的变化可以反映缺血组织的损伤程度。
ATP测量方法很多，如酶法、荧光法、高效液相色谱法(HPLC)和磁共振光谱法(MRS)。目前多采用HPLC法则定ATP。我们观察到小肠缺血再灌注前后，肠组织内所含ATP含量下降，缺血前后和再灌注损伤前后有明显差异(P<0.01)。用异搏定和能量合剂治疗后，缺血再灌注损伤前后ATP含量虽有所下降。但ATP含量均较对照组明显改善(P<0.01)；说明了异搏定和能量合剂在I/R损伤中的保护作用。
综上所述，从本实验结果可以看出，小肠缺血前经SMA灌注异搏定和能量合剂对小肠的I/R损伤有明显的保护作用，提示可在临床得到试用。, 百拇医药
单位：南京医科大学第一附属医院普外科(210029)
关键词：
江苏医药990816 肠系膜上动脉 (SMA)阻断和重建在胸腹主动脉瘤术中较为常见。我们采用异搏定和能量合剂经SMA灌注，以观察两种药物于完全阻断60分种和再灌注30分钟两时相对小肠组织ATP酶活性和ATP含量的影响，以期增加小肠对缺血/再灌注损伤(I/R)的耐受性，现报告如下。
材料和方法
一、动物模型制作方法及标本取材：正常青紫兰灰兔15只，雌雄不限，体查1.8～2.3kg，由南京医科大学动物实验中心提供。将15只灰兔随机分为3组，分别经SMA灌注异搏定(0.15mg/kg)、能量合剂和生理盐水。实验前12小时禁食，正常饮水。麻醉满意后，常规固定，消毒，铺巾；下腹部正中切口，进腹后暴露出腹主动脉、下腔静脉；沿腹主动脉鞘内，左肾动脉上方寻找到SMA，充分游离该动脉，以无损伤动脉夹钳夹SMA根部，立即以5号半针头插入SMA灌注上述三种药物，分别于缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟三个时刻，于屈氏韧带下50cm处取小肠各三段，待测细胞膜Na+-k+ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性及肠组织ATP含量。
, 百拇医药
二、试剂：ATP酶检测试剂盒、组织蛋白定量试剂盒由南京市建成医药公司提供；标准ATP-Na2由上海医药公司提供。
三、实验仪器(1)Waters高效液相色谱仪(美国)；(2)721分光光度检测仪(上海第三分析仪器厂)。
四、观察及检测指标：1.ATP酶活性检测：取0.5g左右组织块用冰冷(4°c)的生理盐水经低温匀浆、离心(3500转/min)15分钟，弃去沉淀，取100μl上清液(含细胞膜成分)按南京建成公司提供试剂盒加入所需试剂，经离心孵育后，于660nm处测各种ATP酶的吸光度值。同时绘制Pi标准曲线，并进行组织蛋白定量。2.高效液相法(HPLC)测肠组织ATP含量：取300mg 左右组织块，精确到0.001g，加2ml浓度为0.56mol/L高氯酸，低温匀浆。将匀浆液低温离心(3660r/min)10分钟，取上清，加等当量10mol/L氢氧化钾中和，使pH值达7.0，出现沉淀，再次离心10分钟，取20μl上清液测肠组织ATP含量。同时绘制ATP-Na2标准曲线。
, http://www.100md.com
五、数据处理：本文表格中数据均采用平均数±标准差(
±s)表示，采用方差齐性F检验和校正t′检验进行统计学分析。结 果
一、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后的Na+-k+ATP酶活性变化 各组缺血即刻Na+-k+ATP酶活性无差异，完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后生理盐水灌注组Na+-K+ATP酶活性明显下降(P<0.01);VER灌注组，能量合剂灌注组Na+-k+ATP酶活性同一时刻于对照组比较有显著性改善(P<0.01,表1)。
, 百拇医药
表1 各组缺血、再灌注前后Na+-k+ATP酶活性比较 单位(μMPi.mg-1.h-1) 分 组
缺血即刻
完全阻断60分钟
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
12.022±1.475
6.240±1.458**
1.067±0.350**
VER灌注组
, 百拇医药
10.501±1.404
12.445±3.219△△
10.775±3.227△△
能量合剂灌注组
10.825±2.026
9.285±2.502
8.444±2.128△△
注：**缺血前后于再灌注前后比较(P<0.01)
△△分别与对照组比较(P<0.01)△(P<0.05)
, 百拇医药 两样本比较校正t’检验
二、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟的Mg2+-ATP酶活性比较各组缺血即刻Mg2+-ATP酶活性无差异；完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后生理盐水灌注组Mg2+-ATP酶活性明显下降(P<0.01),VER灌注组Mg2+-ATP酶活性，用一时刻于对照组比较有显著性改善(P<0.01);能量合剂灌注组Mg2+-ATP酶活性仅于再灌注30分钟前后优于对照组(P<0.01);VER灌注组再灌注30分钟前后优于能量合剂灌注组(P<0.05,表2)。
表2 各组缺血、再灌注前后mg2+-ATP酶活性比较单位：(μMPi.mg-1.h-1) 分 组
, 百拇医药 缺血即刻
完全阻断60分钟
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
12.577±1.640
7.739±0.871**
0.870±0.340**
VER灌注组
11.567±1.452
13.354±2.905△△
11.333±2.624△△□
, 百拇医药
能量合剂灌注组
10.961±2.071
9.744±2.337
7.425±1.659△△
注：**缺血前后与再灌注前后比较(P<0.01)
△△各灌注组与生理盐水灌注组比较(P<0.01)
□VER灌注组与能量合剂灌注组比较(P<0.05)
□ 两样本比较校正t'检验
三、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟的Ca2+-ATP酶活性比较各组缺血即刻Ca2+-ATP酶活性无差异；完全阻断60分钟，再灌注30分钟前后生理盐水灌注组Ca2+-ATP酶活性明显下降(P<0.01)；VER灌注组，能量合剂灌注组Ca2+-ATP酶活同一时刻于对照组比较有显著性意义(P<0.01，表3)。
, 百拇医药
表3 各组缺血、再灌注前后Ca2+-ATP酶活性比较单位：(μMPi.mg-1.h-1) 分 组
缺血即刻
完全阻断60分钟
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
13.704±2.370
5.752±1.074**
0.873±0.357**
VER灌注组
, 百拇医药
10.617±1.634
10.973±3.033△△
10.118±3.425△△
能量合剂灌注组
11.676±2.410
10.376±2.844△△
7.634±1.404△△
注：**缺血前后与再灌注前后比较(P<0.01)
△△各灌注组与生理盐水灌注组比较(P<0.01)
, http://www.100md.com 两样本比较校正t'检验
四、各组缺血即刻，完全阻断60分钟，再灌注30分钟的肠组织ATP含量较生理盐水灌注组在缺血和再灌注前后ATP含量有显著下降(P<0.01);与缺血即刻相比，ATP保存率分别为36.06%和20.12%(P<0.01)；VER灌注组ATP含量先下降后上升，与缺血即刻相比，ATP保存率分别为56.18%和80.28%；与相应时刻对照组相比也存在显著性差异(P<0.01)。能量合剂灌注组ATP含量同样是先下降后上升，与缺血即刻相比 ，ATP保存率分别为61.30%和77.30%；相应时刻ATP含量也明显优于对照组(P<0.01(表4)。
表4 各组缺血、再灌注前后肠组织内ATP含量比较 单位：(μmol.g-1) 分 组
缺血即刻
全完阻断60分钟
, 百拇医药
再灌注30分钟
生理盐水灌注组
1.004±0.167
0.362±0.080**
0.202±0.066**
能量合剂灌注组
0.969±0.284
0.594±0.090△△
0.749±0.280△△
VER灌注组
, 百拇医药
1.004±0.114
0.564±0.097*△△
0.806±0.184△△
注：**安全阻断再灌注前后比较(P<0.01),*(P<0.05)
△△与生理盐水对照组比较(P<0.01)
两样本比较校正t'检验讨 论
ATP酶主要包括Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶，对于维持细胞内外离子平衡有重要保护作用。
异搏定(verapamil)作为临床上常见的钙离子拮抗剂最早用于心律失常的治疗，现已广泛地运用于胃、肾、脑、肝等组织器官的I/R损伤。
, 百拇医药
国内顾玉东等将能量合剂用于离断肢体保护，发现能量合剂对血管和骨骼肌超微结构及细胞膜Na+-k+ATP酶和Ca2+-ATP酶活性有明显保护作用。国外Chaudry等则发现ATP-MgCl2能保护肝脏I/R损伤。
我们用异搏定和能量合剂保护小肠I/R损伤时Na+-k+ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性，发现两种药物能明显保护小肠的三种ATP酶活性(P<0.01)。生理盐水灌注组缺血再灌注前后三种酶的活性均显著下降(P<0.01)。
ATP是体内细胞能够直接利用的唯一能量来源，它的变化可以反映缺血组织的损伤程度。
ATP测量方法很多，如酶法、荧光法、高效液相色谱法(HPLC)和磁共振光谱法(MRS)。目前多采用HPLC法则定ATP。我们观察到小肠缺血再灌注前后，肠组织内所含ATP含量下降，缺血前后和再灌注损伤前后有明显差异(P<0.01)。用异搏定和能量合剂治疗后，缺血再灌注损伤前后ATP含量虽有所下降。但ATP含量均较对照组明显改善(P<0.01)；说明了异搏定和能量合剂在I/R损伤中的保护作用。
综上所述，从本实验结果可以看出，小肠缺血前经SMA灌注异搏定和能量合剂对小肠的I/R损伤有明显的保护作用，提示可在临床得到试用。, 百拇医药