树突状细胞对不同诱导时间LPAK抗肝癌作用的影响
作者：张锦堃 陈海滨 孙劲旅 周燕琼
单位：汕头大学医学院肿瘤病理研究室 广东省汕头市 515031
关键词：树突细胞；LPAK细胞；肝肿瘤
世界华人消化杂志990811 中国图书馆分类号 R735.7
摘 要
目的 比较DC对诱导4d(L-4)和诱导7d(L-7)的LPAK细胞体外杀伤人肝癌细胞株BEL-7402(B)的杀伤力和杀伤模式的影响.
方法 L4组为B+L-4，LD4组为L4组+DC；L7组为B+L-7，LD7组为L7组+DC. L-4和L-7与B的效靶比均为5∶1和10∶1两种. 采用杀伤细胞检测技术及电镜技术，比较各组的杀伤效应和杀伤模式.
, 百拇医药
结果 各组的细胞毒活性为LD4>L4(P<0.01)，LD7>L7(P<0.01). L4组和LD4组的BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死，L7组和LD7组的BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变.
结论 DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式.
0 引言
IL-2加PHA诱导的LPAK(lymphokine and PHA activated killer)过继免疫疗法较单用IL-2活化的LAK细胞在增殖能力和细胞毒活性方面有所增强，临床应用也取得一定疗效，但尚未有突破性的进展. 而应用树突状细胞(dendritic cell, DC)进行抗肿瘤免疫的研究，特别是在提呈肿瘤抗原和激发CTL活性方面的研究，已取得了长足的进展[1]. 我们比较了诱导4d和诱导7d的LPAK细胞，在DC的辅助下对人肝癌细胞株BEL-7402体外杀伤力及杀伤模式如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株BEL-7402引自中山医科大学实验动物中心. 人外周血单个核细胞由健康青年志愿者捐赠. Percoll分离液为Pharmarcia公司产品. rhIL-2由南京军区军事医学研究所惠赠，PHA为广州工业研究所产品，人IgG和Ficoll分离液购自上海华美公司. 人外周血DC的分离按本室常规[2]，将人外周血单个核细胞悬液经不连续Percoll密度梯度分离并收集35%～50%界面层细胞，37℃培养36h后，置于IgG包被的培养皿中用panning法纯化. 收集的非粘附细胞即为高度富集的DC. LPAK细胞的诱导：调整人血单个核细胞浓度为2×109/L，加入IL-2 1000kU/L和PHA20mg/L，分别于37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下孵育4d和7d. 其中7d者孵育期间半保留换液扩增1次.
1.2 方法 ①抗肿瘤实验：实验按诱导4d的LPAK细胞(L-4)和诱导7d的LPAK细胞(L-7)分为两大组，每一大组又分成4个实验组. L-4大组：L4组为BEL-7402(B)+L-4，其中B的浓度8×107/L，L-4与B的效靶比为5∶1和10∶1两种；LD4组为相应的L4组+DC，DC的浓度为8×106/L. L-7大组：各分组中除将L4改为L7外，其余均与L-4大组相同，即分为两种效靶比的L7组和相应的LD7组. 另设未经任何处理的B组(BEL-7402对照组)和培养液空白对照组. 每组均设3个复孔，置含100mL/L新生牛血清的RPMI-1640培养液内，于96孔平底培养板中37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下培养48h后进行效应细胞的细胞毒活性检测. 实验重复4次. ②中性红摄入比色法检测LPAK的细胞毒活性：在上述培养细胞内加入中性红溶液并温育1h，再加入盐酸—乙醇溶液，于BIO-RAD3550-UV型全自动酶联检测仪上以570nm波长测各孔的吸光度A，用GB-STAT统计软件对实验数据进行方差分析. ③电镜样品的制备：取各组离心沉淀细胞，常规固定、脱水、包埋，超薄切片，电子染色，日立H300型透射电镜观察、摄片.
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2 结果
2.1 DC对诱导LPAK细胞的细胞毒活性 中性红摄入比色法检测和统计结果表明，L4，LD4和L7，LD7组各自的细胞毒活性均随效靶比的增高而增强(P<0.01). 而在同一效靶比条件下，各组的细胞毒活性为LD7>L7，LD4>L4(P<0.01，图1).
2.2 DC对诱导LPAK细胞的杀伤模式 对照组B组的BEL-7402细胞微绒毛丰富，细胞核大而圆，染色质分散，细胞质电子密度较低(图2). 实验组L-4和L-7大组中，不仅在DC与LPAK，LPAK与BEL-7402细胞之间，而且在DC与BEL-7402细胞之间都存在着细胞突起与微绒毛、或微绒毛与微绒毛的犬牙状交错接触(图3，4). 在L4组和LD4组中，BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死. 细胞膜破裂，细胞轮廓不清，细胞肿胀；细胞核形态不一，有的核肿胀，有的核固缩；细胞质内细胞器明显破坏，内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解消失，并可见髓鞘样小体(图5). L4组和LD4组的坏死细胞在形态上无明显差别. 在L7组和LD7组中，BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变. 凋亡细胞的形态多样，有典型的改变，如细胞膜微绒毛消失；细胞核移位，染色质或凝聚、浓缩成新月形、弧形边集于核膜下，或固缩成团块状，或碎裂成小块、碎块被内质网包裹形成自噬体；细胞质浓缩，线粒体皱缩变小；浓缩的细胞碎片还向细胞外出芽隆起形成凋亡小体等. 也有不典型的改变，如细胞核核膜虽于核孔处断裂，但核染色质浓缩边集形成“菜花状”；细胞质内肿胀的线粒体中，有的内含致密体，有的嵴紊乱、断裂、甚至空泡化，但遗留嵴的痕迹；内质网或增生肥大，或出现不同程度的退行性变，甚至肿胀空泡化；而细胞器界膜和细胞膜一般保持完好(图6，7). L7组和LD7组的凋亡细胞在形态上无明显差别.
, 百拇医药
图1 DC对诱导LPAK杀伤活性的影响.
图2 对照组BEL-7402细胞微绒毛丰富，核大而圆，染色质分散，核仁清晰可见，细胞质电子密度低，细胞器完好. ×5000
图3 LD4组DC的突起与BEL-7402细胞膜紧密接触. ×10000
图4 LD7组DC的突起与BEL-7402细胞的微绒毛呈犬牙状交错接触. ×5000
图5 LD4组BEL-7402细胞呈明显的坏死改变. ×7000
, 百拇医药
图6 L7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×5000
图7 LD7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×10000
3 讨论
本实验表明DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式. 我们认为，DC之所以能增强LPAK细胞的杀伤效应，固然与其表面有大量树枝状突起，使之有利于直接接触肿瘤抗原并提呈给LPAK细胞有关[1]；也与其能分泌多种细胞因子有关[3]；而更重要的则与其可以通过MHCⅠ类分子途径将外源性抗原提呈给CD8+细胞，同时还提供充分的共刺激信号的功能密切相关[4]. 此外，最近又发现DC能通过分泌或外排一种具有抗原提呈能力的小体(exosomes)来诱导免疫反应，这无疑也增强了LPAK细胞的抗肿瘤功能[5].
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至于肿瘤细胞的死亡模式，我们认为应取决于LPAK细胞本身. LPAK细胞是一个异质性的细胞群体，诱导4d的LPAK细胞亚群以表达CD16+，CD8+和CD3-的细胞特征为主，而诱导7d的LPAK细胞亚群则主要表达DC16-，CD8+和CD3+的CTL细胞特征[6]. 诱导4d的LPAK细胞亚群所含的穿孔素在肿瘤细胞膜上打孔后，向肿瘤细胞内释放溶解素，甚至全部胞质，直接溶解肿瘤细胞，使之崩解、坏死[7]. 而诱导7d的LPAK细胞亚群虽然也分泌穿孔素，并在肿瘤细胞膜上形成孔道，但因该细胞亚群含有大量的细胞毒性颗粒，因此穿孔素协助了细胞毒性颗粒进入靶细胞，其中颗粒酶B在穿孔素的协助下，能快速进入靶细胞并诱导DNA降解导致凋亡；而颗粒酶A，则因其反应较慢而诱导凋亡晚期的DNA片段化降解；还存在的颗粒酶C，D，E，F，G，可能也参与晚期的杀伤机制[8，9]. 此外，7d的LPAK细胞膜上的纤维连接蛋白也与凋亡的发生密切相关[10]. 在现有应用LPAK细胞的临床治疗中，采用诱导7d的LPAK细胞为好；若先以自体外周血DC体外刺激LPAK细胞，再回输体内，可望获得更佳的治疗效果.
, http://www.100md.com
作者简介：张锦，女，1943-03-07生，广东省澄海市人，汉族. 1965年南京铁道医学院医疗系本科毕业，教授，硕士生导师，主要从事免疫细胞及其抗肿瘤研究，曾获省部级科技进步二等奖，发表论文48篇.
广东省高教厅自然科学重点资助项目，No.19952901
通讯作者 张锦，515031，广东省汕头市新陵路3号，汕头大学医学院肿瘤病理研究室.
Supported by Natural Science Foundation of the Higher Education Office of Guangdong Province, No.19952901
Correspondence to:Prof. ZHANG Jin-Kun, Cancer Pathology Laboratory, Shantou University Medical College, 3 Xinlinglu, Shantou 515031, Guangdong Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86.754.8551151 Ext.2087, Fax.+86.754.8557562
Email.Jkzhang@mailserv.stu.edu.cn
4 参考文献
1 Girolomoni G, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cells hold promise for immunotherapy. Immunol Today, 1997;18:102-104
2 Zhang JK, Sun JL, Chen HB, Zhou YQ. Ultrastructural comparison of apoptosis of human hepatoma cells and LAK cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:877-879
, http://www.100md.com
3 Winzler C, Rovere P, Rescigno M, Granucci F, Penna G, Adorini L, Zimmermann VS, Davoust J, Ricciardi Castagnoli P. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med, 1997;185:317-328
4 Austyn JM. New insights into the mobilization and phagocytic activity of dendritic cells. J Exp Med, 1996;183:1287-1292
5 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi Castagnoli P, Paposo G, Amigorena S. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med, 1998;4:594-600
, 百拇医药
6 Wu ZJ, Gao QR, Lin CH, Chai ZK, Xu J, Ye XR. Lymphokine-activated LAK/TIL cell and its phenotype. Zhonghua Weishengwuxue Yu Mianyixue Zazhi, 1997;17:120-125
7 Wang J, Zhang JK, Chen HB, Xu JD. Morphologic observation of the effect of human peripheral blood dendritic cells on LAK cells killing H7402 Cells. Zhongguo Zuzhihuaxue Yu Xibaohuaxue Zazhi, 1996;5:72-76
8 Sashchenko LP, Lukyanova TI, Kabanova OD, Mirkina I, Yatskin ON, Pongor S, Gnuchev NV. Different pathways of the release of cytotoxic proteins in LAK cells. Immunol Lett, 1996;53:25-29
, http://www.100md.com
9 Shresta S, Macivor DM, Heusel JW, Russell JH, Ley TJ. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92:5679-5683
10 Shemtov MM, Cheng DL, Kong L, Shu WP, Sassaroli M, Droller MJ, Liu BC. LAK cell mediated apoptosis of human bladder cancer cells involves a pH-dependent endonuclease system in the cancer cell: possible mechanism of BCG therapy. J Urol, 1995;154:269-274
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, 百拇医药
单位：汕头大学医学院肿瘤病理研究室 广东省汕头市 515031
关键词：树突细胞；LPAK细胞；肝肿瘤
世界华人消化杂志990811 中国图书馆分类号 R735.7
摘 要
目的 比较DC对诱导4d(L-4)和诱导7d(L-7)的LPAK细胞体外杀伤人肝癌细胞株BEL-7402(B)的杀伤力和杀伤模式的影响.
方法 L4组为B+L-4，LD4组为L4组+DC；L7组为B+L-7，LD7组为L7组+DC. L-4和L-7与B的效靶比均为5∶1和10∶1两种. 采用杀伤细胞检测技术及电镜技术，比较各组的杀伤效应和杀伤模式.
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结果 各组的细胞毒活性为LD4>L4(P<0.01)，LD7>L7(P<0.01). L4组和LD4组的BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死，L7组和LD7组的BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变.
结论 DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式.
0 引言
IL-2加PHA诱导的LPAK(lymphokine and PHA activated killer)过继免疫疗法较单用IL-2活化的LAK细胞在增殖能力和细胞毒活性方面有所增强，临床应用也取得一定疗效，但尚未有突破性的进展. 而应用树突状细胞(dendritic cell, DC)进行抗肿瘤免疫的研究，特别是在提呈肿瘤抗原和激发CTL活性方面的研究，已取得了长足的进展[1]. 我们比较了诱导4d和诱导7d的LPAK细胞，在DC的辅助下对人肝癌细胞株BEL-7402体外杀伤力及杀伤模式如下.
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1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株BEL-7402引自中山医科大学实验动物中心. 人外周血单个核细胞由健康青年志愿者捐赠. Percoll分离液为Pharmarcia公司产品. rhIL-2由南京军区军事医学研究所惠赠，PHA为广州工业研究所产品，人IgG和Ficoll分离液购自上海华美公司. 人外周血DC的分离按本室常规[2]，将人外周血单个核细胞悬液经不连续Percoll密度梯度分离并收集35%～50%界面层细胞，37℃培养36h后，置于IgG包被的培养皿中用panning法纯化. 收集的非粘附细胞即为高度富集的DC. LPAK细胞的诱导：调整人血单个核细胞浓度为2×109/L，加入IL-2 1000kU/L和PHA20mg/L，分别于37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下孵育4d和7d. 其中7d者孵育期间半保留换液扩增1次.
1.2 方法 ①抗肿瘤实验：实验按诱导4d的LPAK细胞(L-4)和诱导7d的LPAK细胞(L-7)分为两大组，每一大组又分成4个实验组. L-4大组：L4组为BEL-7402(B)+L-4，其中B的浓度8×107/L，L-4与B的效靶比为5∶1和10∶1两种；LD4组为相应的L4组+DC，DC的浓度为8×106/L. L-7大组：各分组中除将L4改为L7外，其余均与L-4大组相同，即分为两种效靶比的L7组和相应的LD7组. 另设未经任何处理的B组(BEL-7402对照组)和培养液空白对照组. 每组均设3个复孔，置含100mL/L新生牛血清的RPMI-1640培养液内，于96孔平底培养板中37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下培养48h后进行效应细胞的细胞毒活性检测. 实验重复4次. ②中性红摄入比色法检测LPAK的细胞毒活性：在上述培养细胞内加入中性红溶液并温育1h，再加入盐酸—乙醇溶液，于BIO-RAD3550-UV型全自动酶联检测仪上以570nm波长测各孔的吸光度A，用GB-STAT统计软件对实验数据进行方差分析. ③电镜样品的制备：取各组离心沉淀细胞，常规固定、脱水、包埋，超薄切片，电子染色，日立H300型透射电镜观察、摄片.
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2 结果
2.1 DC对诱导LPAK细胞的细胞毒活性 中性红摄入比色法检测和统计结果表明，L4，LD4和L7，LD7组各自的细胞毒活性均随效靶比的增高而增强(P<0.01). 而在同一效靶比条件下，各组的细胞毒活性为LD7>L7，LD4>L4(P<0.01，图1).
2.2 DC对诱导LPAK细胞的杀伤模式 对照组B组的BEL-7402细胞微绒毛丰富，细胞核大而圆，染色质分散，细胞质电子密度较低(图2). 实验组L-4和L-7大组中，不仅在DC与LPAK，LPAK与BEL-7402细胞之间，而且在DC与BEL-7402细胞之间都存在着细胞突起与微绒毛、或微绒毛与微绒毛的犬牙状交错接触(图3，4). 在L4组和LD4组中，BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死. 细胞膜破裂，细胞轮廓不清，细胞肿胀；细胞核形态不一，有的核肿胀，有的核固缩；细胞质内细胞器明显破坏，内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解消失，并可见髓鞘样小体(图5). L4组和LD4组的坏死细胞在形态上无明显差别. 在L7组和LD7组中，BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变. 凋亡细胞的形态多样，有典型的改变，如细胞膜微绒毛消失；细胞核移位，染色质或凝聚、浓缩成新月形、弧形边集于核膜下，或固缩成团块状，或碎裂成小块、碎块被内质网包裹形成自噬体；细胞质浓缩，线粒体皱缩变小；浓缩的细胞碎片还向细胞外出芽隆起形成凋亡小体等. 也有不典型的改变，如细胞核核膜虽于核孔处断裂，但核染色质浓缩边集形成“菜花状”；细胞质内肿胀的线粒体中，有的内含致密体，有的嵴紊乱、断裂、甚至空泡化，但遗留嵴的痕迹；内质网或增生肥大，或出现不同程度的退行性变，甚至肿胀空泡化；而细胞器界膜和细胞膜一般保持完好(图6，7). L7组和LD7组的凋亡细胞在形态上无明显差别.
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图1 DC对诱导LPAK杀伤活性的影响.
图2 对照组BEL-7402细胞微绒毛丰富，核大而圆，染色质分散，核仁清晰可见，细胞质电子密度低，细胞器完好. ×5000
图3 LD4组DC的突起与BEL-7402细胞膜紧密接触. ×10000
图4 LD7组DC的突起与BEL-7402细胞的微绒毛呈犬牙状交错接触. ×5000
图5 LD4组BEL-7402细胞呈明显的坏死改变. ×7000
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图6 L7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×5000
图7 LD7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×10000
3 讨论
本实验表明DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式. 我们认为，DC之所以能增强LPAK细胞的杀伤效应，固然与其表面有大量树枝状突起，使之有利于直接接触肿瘤抗原并提呈给LPAK细胞有关[1]；也与其能分泌多种细胞因子有关[3]；而更重要的则与其可以通过MHCⅠ类分子途径将外源性抗原提呈给CD8+细胞，同时还提供充分的共刺激信号的功能密切相关[4]. 此外，最近又发现DC能通过分泌或外排一种具有抗原提呈能力的小体(exosomes)来诱导免疫反应，这无疑也增强了LPAK细胞的抗肿瘤功能[5].
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至于肿瘤细胞的死亡模式，我们认为应取决于LPAK细胞本身. LPAK细胞是一个异质性的细胞群体，诱导4d的LPAK细胞亚群以表达CD16+，CD8+和CD3-的细胞特征为主，而诱导7d的LPAK细胞亚群则主要表达DC16-，CD8+和CD3+的CTL细胞特征[6]. 诱导4d的LPAK细胞亚群所含的穿孔素在肿瘤细胞膜上打孔后，向肿瘤细胞内释放溶解素，甚至全部胞质，直接溶解肿瘤细胞，使之崩解、坏死[7]. 而诱导7d的LPAK细胞亚群虽然也分泌穿孔素，并在肿瘤细胞膜上形成孔道，但因该细胞亚群含有大量的细胞毒性颗粒，因此穿孔素协助了细胞毒性颗粒进入靶细胞，其中颗粒酶B在穿孔素的协助下，能快速进入靶细胞并诱导DNA降解导致凋亡；而颗粒酶A，则因其反应较慢而诱导凋亡晚期的DNA片段化降解；还存在的颗粒酶C，D，E，F，G，可能也参与晚期的杀伤机制[8，9]. 此外，7d的LPAK细胞膜上的纤维连接蛋白也与凋亡的发生密切相关[10]. 在现有应用LPAK细胞的临床治疗中，采用诱导7d的LPAK细胞为好；若先以自体外周血DC体外刺激LPAK细胞，再回输体内，可望获得更佳的治疗效果.
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作者简介：张锦，女，1943-03-07生，广东省澄海市人，汉族. 1965年南京铁道医学院医疗系本科毕业，教授，硕士生导师，主要从事免疫细胞及其抗肿瘤研究，曾获省部级科技进步二等奖，发表论文48篇.
广东省高教厅自然科学重点资助项目，No.19952901
通讯作者 张锦，515031，广东省汕头市新陵路3号，汕头大学医学院肿瘤病理研究室.
Supported by Natural Science Foundation of the Higher Education Office of Guangdong Province, No.19952901
Correspondence to:Prof. ZHANG Jin-Kun, Cancer Pathology Laboratory, Shantou University Medical College, 3 Xinlinglu, Shantou 515031, Guangdong Province, China
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Tel. +86.754.8551151 Ext.2087, Fax.+86.754.8557562
Email.Jkzhang@mailserv.stu.edu.cn
4 参考文献
1 Girolomoni G, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cells hold promise for immunotherapy. Immunol Today, 1997;18:102-104
2 Zhang JK, Sun JL, Chen HB, Zhou YQ. Ultrastructural comparison of apoptosis of human hepatoma cells and LAK cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6:877-879
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3 Winzler C, Rovere P, Rescigno M, Granucci F, Penna G, Adorini L, Zimmermann VS, Davoust J, Ricciardi Castagnoli P. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med, 1997;185:317-328
4 Austyn JM. New insights into the mobilization and phagocytic activity of dendritic cells. J Exp Med, 1996;183:1287-1292
5 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, Ricciardi Castagnoli P, Paposo G, Amigorena S. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med, 1998;4:594-600
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6 Wu ZJ, Gao QR, Lin CH, Chai ZK, Xu J, Ye XR. Lymphokine-activated LAK/TIL cell and its phenotype. Zhonghua Weishengwuxue Yu Mianyixue Zazhi, 1997;17:120-125
7 Wang J, Zhang JK, Chen HB, Xu JD. Morphologic observation of the effect of human peripheral blood dendritic cells on LAK cells killing H7402 Cells. Zhongguo Zuzhihuaxue Yu Xibaohuaxue Zazhi, 1996;5:72-76
8 Sashchenko LP, Lukyanova TI, Kabanova OD, Mirkina I, Yatskin ON, Pongor S, Gnuchev NV. Different pathways of the release of cytotoxic proteins in LAK cells. Immunol Lett, 1996;53:25-29
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9 Shresta S, Macivor DM, Heusel JW, Russell JH, Ley TJ. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92:5679-5683
10 Shemtov MM, Cheng DL, Kong L, Shu WP, Sassaroli M, Droller MJ, Liu BC. LAK cell mediated apoptosis of human bladder cancer cells involves a pH-dependent endonuclease system in the cancer cell: possible mechanism of BCG therapy. J Urol, 1995;154:269-274
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, 百拇医药