不同浓度清毒饮和养正片对L7212白血病小鼠脾脏B细胞功能的影响★
作者：李振波 丘和明
单位：
关键词：白血病；中药疗法；B细胞；＠清毒饮；治疗应用；＠养正片；治疗应用
新中医990819 提 要 采用溶血空斑法观察不同浓度清毒饮和养正片对L7212白血病小鼠脾脏B细胞功能的影响。结果：200%、100%、50%浓度的清毒饮能明显提高L7212白血病小鼠脾细胞溶血空斑的形成，P值分别为P<0.01、P<0.05、P<0.05；200%、100%浓度的养正片能显著提高L7212白血病小鼠脾细胞溶血空斑的形成，均P<0.05。提示：清毒饮和养正片均能提高L7212白血病小鼠脾脏B细胞功能，以清毒饮为佳。
清毒饮和养正片是我院治疗急性白血病的有效方剂，为了探讨其疗效机理，本研究以L7212白血病小鼠为模型，观察了不同浓度清毒饮和养正片对脾脏B细胞功能的影响。
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1 材料与方法
1.1 动物 615近交系小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，雄性，由中国医学科学院实验动物中心提供。L7212白血病细胞株，由中国医学科学院血液病研究所病理室提供。
1.2 药品 清毒饮：由重楼、白花蛇舌草、山慈菇、法半夏、莪术、三七、胡黄连、大青叶、竹茹、制大黄、生地黄、仙鹤草组成；养正片：由人参、黄芪、补骨脂、熟地黄、黄精、灵芝、三七、女贞子、旱莲草、鸡内金、虎杖、茜草组成。中药饮片由本院中药房提供，制剂由本院临床药理制剂室制成，水煎醇提液，浓度为200%。分别以蒸馏水将清毒饮、养正片各梯度稀释成4个浓度，为200%、100%、50%、25%。
1.3 材料 解剖器械、载玻片、双面胶条、石蜡。
1.4 试剂 绵羊红细胞(SRBC)。取新鲜SRBC以生理盐水洗3次，每次1000 rpm，10 分钟，用生理盐水配成5%、0.3%的浓度。新鲜豚鼠补体1∶5。
, 百拇医药
1.5 仪器 BIO-KAD 3550酶标仪，美国产品。
1.6 白血病细胞接种量和时间的确定 取6只615小鼠， 3只每只接种 L7212脾细胞悬液1×105， 3只不接种，接种1天后给每只小鼠腹腔注射5%SRBC 0.4 ml以免疫小鼠。5天后用小室液相法〔1〕测溶血空斑形成情况。
预试结果：肉眼下见空斑。显微镜下计数空斑形成数，计数出2×106脾细胞所形成的空斑数，L7212小鼠组与615小鼠组比空斑形成率比明显减少，P<0.001。故采用每只1×105的接种量，接种后5天，做下面实验。
1.7 分组及方法 取30只615小鼠，分成4大组：清毒饮组、养正片组、L7212小鼠组、615小鼠组。两种中药分别取4个浓度梯度，每一浓度组取3只小鼠，用相应浓度中药灌胃；L7212小鼠组、615小鼠组以生理盐水灌胃做为对照。每只0.3 ml，每天1次，灌胃当天除615组外，其余各组每只小鼠右腋皮下接种1×105个L7212白血病小鼠脾细胞悬液，接种后1天，各组小鼠每只均腹腔注射5%SRBC 0.4 ml，各组继续灌胃，注射SRBC4天后脱颈处死小鼠。
, 百拇医药
1.8 PFC形成的测定〔1〕 ①取脾脏研磨制成脾细胞悬液，计数调细胞浓度为2×107/ml。②用96孔板，每孔加0.3%SRBC 50 μl，脾细胞100 μl，为2×106细胞/孔，1∶5新鲜豚鼠补体50 μl，对照孔不加脾细胞悬液，以PBS 100 μl代替。加4块96孔板，每板每孔做4个复孔，故每个标本共16个孔。③37℃孵育1小时后离心1000 rpm 10 分钟，吸取上清移至另外4块96孔板内。用酶标仪测OD值。先以PBS 200 μl调零点，测每孔OD值。以每样本OD值减去对照孔OD值，即得该样品的OD值，求出每样本OD值的平均值，做统计学处理。
2 结果
清毒饮和养正片各浓度组OD值的比较，见附表。
从附表可见清毒饮200%、100%、50%与L7212组比较P值分别为P<0.01、P<0.05、P<0.05。养正片200%、100%与L7212组比较差异均有显著性意义(P<0.05、P<0.05)。清毒饮以200%、养正片以100%浓度OD值最高。2组比较各浓度组清毒饮的OD值均高于养正片。
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附表 消毒饮和养正片各浓度组OD值比较(
±s) 组 别
OD 值
清毒饮组
25%
0.3296±0.0487
50%
0.3800±0.1315※
100%
0.4042±0.0760※
200%
, 百拇医药
0.4300±0.0451※※
养正片组
25%
0.2992±0.1109
50%
0.3292±0.0427
100%
0.3517±0.0237※
200%
0.3433±0.0530※
, 百拇医药
L7212小鼠组
0.2983±0.0291
615小鼠组
0.4542±0.0593
n＝3，与L7212组比较，※P<0.05，※※P<0.01
3 讨论
清毒饮和养正片配合化疗治疗急性非淋巴细胞白血病取得了较好的疗效〔2〕。实验证明其能改善环磷酰胺所致的造血抑制小鼠的粒系造血，减轻化疗毒副反应；延长L7212白血病小鼠生存期；提高其脾细胞培养上清中的白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)活性及其mRNA表达(待发表)。说明其在白血病免疫调控方面起一定作用。
, 百拇医药
本研究采用的615小鼠，1985年即被列为国际标准近交系小鼠〔3〕，L7212为615小鼠自发白血病(T淋巴细胞白血病)。615小鼠接种L7212白血病小鼠脾细胞悬液后100%发病，脾脏明显肿大，有大量白血病细胞增殖期浸润，破坏脾脏T、B淋巴细胞的免疫功能〔4〕。脾脏分布有占全身50%～65%的B细胞。预试发现以每只1×105接种量接种后5天，PFC形成比正常615小鼠明显减少约50%，与正常615小鼠比P<0.001。表明以每只1×105接种量给615小鼠接种后5天，脾脏既保持免疫功能，又有白血病细胞浸润，保证了小鼠既患有白血病又保持部分免疫功能。
以溶血空斑试验检测不同浓度清毒饮和养正片对B淋巴细胞功能的影响。结果表明清毒饮200%、100%、50%与L7212小鼠组比较均有显著性或非常显著性意义(P<0.01、P<0.05、P<0.05)，养正片200%、100%与L7212小鼠组比较均有显著性意义(P<0.05、P<0.05)。清毒饮以200%浓度、养正片以100%浓度OD值最高。清毒饮和养正片比较各浓度组清毒饮的OD值均高于养正片，说明两方均能提高抗体形成细胞数，即提高B细胞数，以清毒饮的作用为强。
, 百拇医药
从以下两方面分析上述结果。第一，清毒饮方中的重楼、白花蛇舌草、山慈菇、莪术、胡黄连、大青叶清热解毒，活血化痰散结；半夏、竹茹化痰降逆止呕；三七、生地黄、大黄、仙鹤草凉血活血止血。养正片方中的人参、黄芪健脾益气以生血，补骨脂、熟地黄、黄精、灵芝、女贞子、旱莲草补肾填精养阴。第二，清毒饮所用药物在治疗白血病的同时，又有抵抗化疗的胃肠道反应和骨髓抑制作用；养正片所用药物以改善免疫功能为主。从中药药理研究来看对机体免疫功能起调节作用的药物以补益类药为主，而在对L7212白血病小鼠B细胞功能的调节方面清毒饮优于养正片，这可能与清毒饮通过直接杀伤L7212白血病细胞起到间接保护脾脏B细胞功能的作用有关；而养正片则以调节免疫功能，通过免疫机制达到其抗白血病的目的。这可能是两方抗白血病的不同机制之所在。
★ 国家中医药管理局资助课题(95C041)
参考文献
1 钱玉昆，殷金珠.实用免疫学新技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994.14～15
2 丘和明，陈志雄，张惠臣，等.中西医结合治疗急性非淋巴细胞白血病23例临床观察.广州中医药大学学报，1995，12(3)∶23～26
3 褚建新，李肇玫.615近交系小鼠及其在实验肿瘤研究中的应用.北京∶人民卫生出版社，1989.104～105
4 褚建新，齐淑玲，雷健玲，等.可移植性小鼠白血病模型(L7212)的建立及其生物学特性.中华肿瘤学杂志，1981，3(3)∶287～291
(修回日期：1999-03-09), http://www.100md.com
单位：
关键词：白血病；中药疗法；B细胞；＠清毒饮；治疗应用；＠养正片；治疗应用
新中医990819 提 要 采用溶血空斑法观察不同浓度清毒饮和养正片对L7212白血病小鼠脾脏B细胞功能的影响。结果：200%、100%、50%浓度的清毒饮能明显提高L7212白血病小鼠脾细胞溶血空斑的形成，P值分别为P<0.01、P<0.05、P<0.05；200%、100%浓度的养正片能显著提高L7212白血病小鼠脾细胞溶血空斑的形成，均P<0.05。提示：清毒饮和养正片均能提高L7212白血病小鼠脾脏B细胞功能，以清毒饮为佳。
清毒饮和养正片是我院治疗急性白血病的有效方剂，为了探讨其疗效机理，本研究以L7212白血病小鼠为模型，观察了不同浓度清毒饮和养正片对脾脏B细胞功能的影响。
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1 材料与方法
1.1 动物 615近交系小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，雄性，由中国医学科学院实验动物中心提供。L7212白血病细胞株，由中国医学科学院血液病研究所病理室提供。
1.2 药品 清毒饮：由重楼、白花蛇舌草、山慈菇、法半夏、莪术、三七、胡黄连、大青叶、竹茹、制大黄、生地黄、仙鹤草组成；养正片：由人参、黄芪、补骨脂、熟地黄、黄精、灵芝、三七、女贞子、旱莲草、鸡内金、虎杖、茜草组成。中药饮片由本院中药房提供，制剂由本院临床药理制剂室制成，水煎醇提液，浓度为200%。分别以蒸馏水将清毒饮、养正片各梯度稀释成4个浓度，为200%、100%、50%、25%。
1.3 材料 解剖器械、载玻片、双面胶条、石蜡。
1.4 试剂 绵羊红细胞(SRBC)。取新鲜SRBC以生理盐水洗3次，每次1000 rpm，10 分钟，用生理盐水配成5%、0.3%的浓度。新鲜豚鼠补体1∶5。
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1.5 仪器 BIO-KAD 3550酶标仪，美国产品。
1.6 白血病细胞接种量和时间的确定 取6只615小鼠， 3只每只接种 L7212脾细胞悬液1×105， 3只不接种，接种1天后给每只小鼠腹腔注射5%SRBC 0.4 ml以免疫小鼠。5天后用小室液相法〔1〕测溶血空斑形成情况。
预试结果：肉眼下见空斑。显微镜下计数空斑形成数，计数出2×106脾细胞所形成的空斑数，L7212小鼠组与615小鼠组比空斑形成率比明显减少，P<0.001。故采用每只1×105的接种量，接种后5天，做下面实验。
1.7 分组及方法 取30只615小鼠，分成4大组：清毒饮组、养正片组、L7212小鼠组、615小鼠组。两种中药分别取4个浓度梯度，每一浓度组取3只小鼠，用相应浓度中药灌胃；L7212小鼠组、615小鼠组以生理盐水灌胃做为对照。每只0.3 ml，每天1次，灌胃当天除615组外，其余各组每只小鼠右腋皮下接种1×105个L7212白血病小鼠脾细胞悬液，接种后1天，各组小鼠每只均腹腔注射5%SRBC 0.4 ml，各组继续灌胃，注射SRBC4天后脱颈处死小鼠。
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1.8 PFC形成的测定〔1〕 ①取脾脏研磨制成脾细胞悬液，计数调细胞浓度为2×107/ml。②用96孔板，每孔加0.3%SRBC 50 μl，脾细胞100 μl，为2×106细胞/孔，1∶5新鲜豚鼠补体50 μl，对照孔不加脾细胞悬液，以PBS 100 μl代替。加4块96孔板，每板每孔做4个复孔，故每个标本共16个孔。③37℃孵育1小时后离心1000 rpm 10 分钟，吸取上清移至另外4块96孔板内。用酶标仪测OD值。先以PBS 200 μl调零点，测每孔OD值。以每样本OD值减去对照孔OD值，即得该样品的OD值，求出每样本OD值的平均值，做统计学处理。
2 结果
清毒饮和养正片各浓度组OD值的比较，见附表。
从附表可见清毒饮200%、100%、50%与L7212组比较P值分别为P<0.01、P<0.05、P<0.05。养正片200%、100%与L7212组比较差异均有显著性意义(P<0.05、P<0.05)。清毒饮以200%、养正片以100%浓度OD值最高。2组比较各浓度组清毒饮的OD值均高于养正片。
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附表 消毒饮和养正片各浓度组OD值比较(
±s) 组 别OD 值
清毒饮组
25%
0.3296±0.0487
50%
0.3800±0.1315※
100%
0.4042±0.0760※
200%
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0.4300±0.0451※※
养正片组
25%
0.2992±0.1109
50%
0.3292±0.0427
100%
0.3517±0.0237※
200%
0.3433±0.0530※
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L7212小鼠组
0.2983±0.0291
615小鼠组
0.4542±0.0593
n＝3，与L7212组比较，※P<0.05，※※P<0.01
3 讨论
清毒饮和养正片配合化疗治疗急性非淋巴细胞白血病取得了较好的疗效〔2〕。实验证明其能改善环磷酰胺所致的造血抑制小鼠的粒系造血，减轻化疗毒副反应；延长L7212白血病小鼠生存期；提高其脾细胞培养上清中的白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)活性及其mRNA表达(待发表)。说明其在白血病免疫调控方面起一定作用。
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本研究采用的615小鼠，1985年即被列为国际标准近交系小鼠〔3〕，L7212为615小鼠自发白血病(T淋巴细胞白血病)。615小鼠接种L7212白血病小鼠脾细胞悬液后100%发病，脾脏明显肿大，有大量白血病细胞增殖期浸润，破坏脾脏T、B淋巴细胞的免疫功能〔4〕。脾脏分布有占全身50%～65%的B细胞。预试发现以每只1×105接种量接种后5天，PFC形成比正常615小鼠明显减少约50%，与正常615小鼠比P<0.001。表明以每只1×105接种量给615小鼠接种后5天，脾脏既保持免疫功能，又有白血病细胞浸润，保证了小鼠既患有白血病又保持部分免疫功能。
以溶血空斑试验检测不同浓度清毒饮和养正片对B淋巴细胞功能的影响。结果表明清毒饮200%、100%、50%与L7212小鼠组比较均有显著性或非常显著性意义(P<0.01、P<0.05、P<0.05)，养正片200%、100%与L7212小鼠组比较均有显著性意义(P<0.05、P<0.05)。清毒饮以200%浓度、养正片以100%浓度OD值最高。清毒饮和养正片比较各浓度组清毒饮的OD值均高于养正片，说明两方均能提高抗体形成细胞数，即提高B细胞数，以清毒饮的作用为强。
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从以下两方面分析上述结果。第一，清毒饮方中的重楼、白花蛇舌草、山慈菇、莪术、胡黄连、大青叶清热解毒，活血化痰散结；半夏、竹茹化痰降逆止呕；三七、生地黄、大黄、仙鹤草凉血活血止血。养正片方中的人参、黄芪健脾益气以生血，补骨脂、熟地黄、黄精、灵芝、女贞子、旱莲草补肾填精养阴。第二，清毒饮所用药物在治疗白血病的同时，又有抵抗化疗的胃肠道反应和骨髓抑制作用；养正片所用药物以改善免疫功能为主。从中药药理研究来看对机体免疫功能起调节作用的药物以补益类药为主，而在对L7212白血病小鼠B细胞功能的调节方面清毒饮优于养正片，这可能与清毒饮通过直接杀伤L7212白血病细胞起到间接保护脾脏B细胞功能的作用有关；而养正片则以调节免疫功能，通过免疫机制达到其抗白血病的目的。这可能是两方抗白血病的不同机制之所在。
★ 国家中医药管理局资助课题(95C041)
参考文献
1 钱玉昆，殷金珠.实用免疫学新技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994.14～15
2 丘和明，陈志雄，张惠臣，等.中西医结合治疗急性非淋巴细胞白血病23例临床观察.广州中医药大学学报，1995，12(3)∶23～26
3 褚建新，李肇玫.615近交系小鼠及其在实验肿瘤研究中的应用.北京∶人民卫生出版社，1989.104～105
4 褚建新，齐淑玲，雷健玲，等.可移植性小鼠白血病模型(L7212)的建立及其生物学特性.中华肿瘤学杂志，1981，3(3)∶287～291
(修回日期：1999-03-09), http://www.100md.com