固定化胰蛋白酶水解酪蛋白及亲合吸附提取磷肽的研究
作者：夏宇东
单位：江苏省锡山市卫生进修学校，无锡，214101
关键词：酪蛋白；壳聚糖交联珠；磷肽
苏州医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SUZHOU1999年 第19卷 第8期 Vol 摘要 采用固定化胰蛋白酶水解酪蛋白，在pH 8.0的硼酸缓冲液中40°C恒温水浴20 h，得到含有磷肽的溶液；然后用壳聚糖交联珠在pH 3.6的HCl—甘氨酸缓冲液中亲和吸附磷肽，再用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，计算平均磷肽吸附量。结果显示，壳聚糖交联珠亲合吸附法与常规的硫氨络铁琼脂糖珠提取法的磷肽吸附量基本相同，但壳聚糖交联珠亲合吸附法操作简便，特异性高，价格低廉。
中图法分类 R34
食物中的酪蛋白经肠道可被消化成小分子的磷肽，能促进小肠对钙的吸收[1]，故磷肽是极好的钙磷营养补给剂。用磷肽制成的磷肽钙可渗入牙洞，使牙齿的表面沉积一层磷酸钙保护层，可防治龋齿[2]。氯化物虽也可防治龋齿，但有毒性[2]。磷肽将成为牙膏、糖果及口香糖的重要添加剂。然而酪蛋白经酶水解后含磷肽量很低，提取困难。为此，我们设计出用壳聚糖凝胶珠特异性亲和吸附法提取磷肽，并对此方法的操作过程、吸磷量与传统方法进行比较，结果报告于下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器：酪蛋白、固定化胰蛋白酶、壳聚糖凝胶珠和硫氨络铁琼脂糖珠均由南京师范大学生化教研室提供)；751-分光光度计(上海第一分析仪器厂)；OLYMPUS CH型双目显微镜(日本奥林帕斯公司)。
1.2 方法
1.2.1 酪蛋白水解：用0.1 mol/L硼酸pH 8缓冲液配制2%的酪蛋白溶液，取200 ml加入50g固定化胰蛋白酶，40°C水解20 h.
1.2.2 实验组壳聚糖珠交联实验：将壳聚糖珠以1∶5体积置于1%乙醛和1%Na2HPO4混合液中，常温下浸泡30 min，然后经0.1 mol/L的柠檬酸pH 5缓冲液洗3次，再将珠置于pH 9的乙醇胺溶液中，40°C恒温1 h，用蒸馏水洗至pH中性，取少量珠观察交联前、后珠的直径变化。
, 百拇医药
1.2.3 实验组壳聚糖凝胶珠亲合吸附磷肽：壳聚糖交联珠经0.025 mol/L的HCl-甘氨酸pH 3.6缓冲液调到pH 3.6后，装柱8cm×2cm 5柱，平衡每柱柱体，调整流速。取酪蛋白酶解液50 ml用0.1 mol/L的盐酸调到pH 3.6，然后依次在5支柱体上上样(每支上样10ml酪蛋白酶解液)，停止流动30 min，使之被充分吸附，然后用平衡液(pH3.5的HCl-甘氨酸)洗去不吸附部分，洗至280nm下、OD值<0.05(表示基本无蛋白质)后，换0.1 mol/L Tris-HCl pH 8缓冲液洗脱，控制流速为10 min/管，每管液体4.5 ml，依次测50管液体OD值。
1.2.4 对照组硫氨络铁琼脂糖珠亲合吸附磷肽实验：硫氨络铁琼脂糖珠装柱8cm×2cm,装5支柱，用1 mol/L醋酸钠-醋酸pH 4.0缓冲液平衡柱体，取50ml酶解液，用0.1 mol/L的盐酸调到pH 3.6，然后依次在5支柱体上上样(每支上样10 ml酪蛋白酶解液)，停止流动30 min,然后用平衡液(pH 4.0的HCl-甘氨酸)洗去不吸附部分，洗至280nm下、OD<0.05(表示基本无蛋白质)，换0.1 mol/L Tris-HCl pH 8缓冲液洗脱，控制流速为10 minl/管，每管液体4.5 ml,依次测50管液体OD值。
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1.2.5 洗脱液中磷肽含量的测定：以0.2 mg/L中血清白蛋白280nm波长下的OD值为标准，计算实验组和对照组磷肽的吸附量。
2 结果
2.1 双目显微镜(10×10)观察结果：交联前珠直径为10～20μm,交联后直径为8～15μm。交联的成功，增加了凝胶珠的机械强度和吸附能力。
2.2 实验组与对照组在磷肽的吸附量和被吸附的磷肽浓度无显著差异(P>0.05)，见附表。
附表 两组对磷肽吸附量比较(
±s)
OD值
磷肽吸附量(mg/cm3)
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磷肽浓度(g/L)
实验组
0.388±0.077
3.58±0.25
0.255±0.048
对照组
0.383±0.091
3.51±0.21
0.251±0.048
3 讨论
胰蛋白酶水解酪蛋白，其水解局限于羧端为精氨酸、赖氨酸的肽键，水解得到的多肽大部分为含磷多肽，能抵抗进一步的酶降解[2]，水解后所得磷肽的等电点pH大于3.6，壳聚糖分子中有游离的-NH+基团，为阴离子交换树脂，可吸附阳离子调节溶液的pH值来吸附、冼脱磷肽。
, 百拇医药
用硫氨络铁琼脂糖珠提取磷肽，是利用金属子和磷肽络合作用，特异性较强，但成本高，且易破碎，不利于大规模生产，难以推广。我们选用壳聚糖交联珠亲合吸附磷肽，结果其吸磷量与对照组无显著差异(P>0.05)。但壳聚糖来源广泛，成本低廉，机械强度大，不易破碎，可反复使用，操作简单。在洗脱剂的选用方面，Andersson和Muszynska[3，4]用氯化镁、磷酸丝氨酸和磷酸盐作洗脱剂，MgCl2不能用于食品生产，磷酸丝氨酸价格太贵；另外，磷酸盐对消化后磷的测定也有影响。本实验选用pH8的Tris-HCl缓冲液洗脱，获得同样效果，但克服上述缺点。
磷肽的研究为糖果工业的发展注入了新的活力，它降低了龋齿的潜在危险性，并是极好的钙磷补给剂，因此科学合理的、简便价廉的磷肽提取法有广阔的应用领域。
参考文献
1 Scanff P, et al. Immobilized Fe3+ affinity chromatographic isolation of phosphopetides. J chromat, 1991, 539(2)∶425
, http://www.100md.com
2 Reynalds Enic, Scienle and Technology. Australian: Newsletter, 1993∶68
3 Andersson L, et al., Isolation of phosphoproteins by immiobilized metal (Fe3+) affinity chromatgraphy.
4 Muszynsha g, et al. Selectio adsorption of phosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate. Biochemistry, 1994, 25∶6850
(1999年5月5日收稿), http://www.100md.com
单位：江苏省锡山市卫生进修学校，无锡，214101
关键词：酪蛋白；壳聚糖交联珠；磷肽
苏州医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SUZHOU1999年 第19卷 第8期 Vol 摘要 采用固定化胰蛋白酶水解酪蛋白，在pH 8.0的硼酸缓冲液中40°C恒温水浴20 h，得到含有磷肽的溶液；然后用壳聚糖交联珠在pH 3.6的HCl—甘氨酸缓冲液中亲和吸附磷肽，再用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，计算平均磷肽吸附量。结果显示，壳聚糖交联珠亲合吸附法与常规的硫氨络铁琼脂糖珠提取法的磷肽吸附量基本相同，但壳聚糖交联珠亲合吸附法操作简便，特异性高，价格低廉。
中图法分类 R34
食物中的酪蛋白经肠道可被消化成小分子的磷肽，能促进小肠对钙的吸收[1]，故磷肽是极好的钙磷营养补给剂。用磷肽制成的磷肽钙可渗入牙洞，使牙齿的表面沉积一层磷酸钙保护层，可防治龋齿[2]。氯化物虽也可防治龋齿，但有毒性[2]。磷肽将成为牙膏、糖果及口香糖的重要添加剂。然而酪蛋白经酶水解后含磷肽量很低，提取困难。为此，我们设计出用壳聚糖凝胶珠特异性亲和吸附法提取磷肽，并对此方法的操作过程、吸磷量与传统方法进行比较，结果报告于下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器：酪蛋白、固定化胰蛋白酶、壳聚糖凝胶珠和硫氨络铁琼脂糖珠均由南京师范大学生化教研室提供)；751-分光光度计(上海第一分析仪器厂)；OLYMPUS CH型双目显微镜(日本奥林帕斯公司)。
1.2 方法
1.2.1 酪蛋白水解：用0.1 mol/L硼酸pH 8缓冲液配制2%的酪蛋白溶液，取200 ml加入50g固定化胰蛋白酶，40°C水解20 h.
1.2.2 实验组壳聚糖珠交联实验：将壳聚糖珠以1∶5体积置于1%乙醛和1%Na2HPO4混合液中，常温下浸泡30 min，然后经0.1 mol/L的柠檬酸pH 5缓冲液洗3次，再将珠置于pH 9的乙醇胺溶液中，40°C恒温1 h，用蒸馏水洗至pH中性，取少量珠观察交联前、后珠的直径变化。
, 百拇医药
1.2.3 实验组壳聚糖凝胶珠亲合吸附磷肽：壳聚糖交联珠经0.025 mol/L的HCl-甘氨酸pH 3.6缓冲液调到pH 3.6后，装柱8cm×2cm 5柱，平衡每柱柱体，调整流速。取酪蛋白酶解液50 ml用0.1 mol/L的盐酸调到pH 3.6，然后依次在5支柱体上上样(每支上样10ml酪蛋白酶解液)，停止流动30 min，使之被充分吸附，然后用平衡液(pH3.5的HCl-甘氨酸)洗去不吸附部分，洗至280nm下、OD值<0.05(表示基本无蛋白质)后，换0.1 mol/L Tris-HCl pH 8缓冲液洗脱，控制流速为10 min/管，每管液体4.5 ml，依次测50管液体OD值。
1.2.4 对照组硫氨络铁琼脂糖珠亲合吸附磷肽实验：硫氨络铁琼脂糖珠装柱8cm×2cm,装5支柱，用1 mol/L醋酸钠-醋酸pH 4.0缓冲液平衡柱体，取50ml酶解液，用0.1 mol/L的盐酸调到pH 3.6，然后依次在5支柱体上上样(每支上样10 ml酪蛋白酶解液)，停止流动30 min,然后用平衡液(pH 4.0的HCl-甘氨酸)洗去不吸附部分，洗至280nm下、OD<0.05(表示基本无蛋白质)，换0.1 mol/L Tris-HCl pH 8缓冲液洗脱，控制流速为10 minl/管，每管液体4.5 ml,依次测50管液体OD值。
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1.2.5 洗脱液中磷肽含量的测定：以0.2 mg/L中血清白蛋白280nm波长下的OD值为标准，计算实验组和对照组磷肽的吸附量。
2 结果
2.1 双目显微镜(10×10)观察结果：交联前珠直径为10～20μm,交联后直径为8～15μm。交联的成功，增加了凝胶珠的机械强度和吸附能力。
2.2 实验组与对照组在磷肽的吸附量和被吸附的磷肽浓度无显著差异(P>0.05)，见附表。
附表 两组对磷肽吸附量比较(
±s)OD值
磷肽吸附量(mg/cm3)
, 百拇医药
磷肽浓度(g/L)
实验组
0.388±0.077
3.58±0.25
0.255±0.048
对照组
0.383±0.091
3.51±0.21
0.251±0.048
3 讨论
胰蛋白酶水解酪蛋白，其水解局限于羧端为精氨酸、赖氨酸的肽键，水解得到的多肽大部分为含磷多肽，能抵抗进一步的酶降解[2]，水解后所得磷肽的等电点pH大于3.6，壳聚糖分子中有游离的-NH+基团，为阴离子交换树脂，可吸附阳离子调节溶液的pH值来吸附、冼脱磷肽。
, 百拇医药
用硫氨络铁琼脂糖珠提取磷肽，是利用金属子和磷肽络合作用，特异性较强，但成本高，且易破碎，不利于大规模生产，难以推广。我们选用壳聚糖交联珠亲合吸附磷肽，结果其吸磷量与对照组无显著差异(P>0.05)。但壳聚糖来源广泛，成本低廉，机械强度大，不易破碎，可反复使用，操作简单。在洗脱剂的选用方面，Andersson和Muszynska[3，4]用氯化镁、磷酸丝氨酸和磷酸盐作洗脱剂，MgCl2不能用于食品生产，磷酸丝氨酸价格太贵；另外，磷酸盐对消化后磷的测定也有影响。本实验选用pH8的Tris-HCl缓冲液洗脱，获得同样效果，但克服上述缺点。
磷肽的研究为糖果工业的发展注入了新的活力，它降低了龋齿的潜在危险性，并是极好的钙磷补给剂，因此科学合理的、简便价廉的磷肽提取法有广阔的应用领域。
参考文献
1 Scanff P, et al. Immobilized Fe3+ affinity chromatographic isolation of phosphopetides. J chromat, 1991, 539(2)∶425
, http://www.100md.com
2 Reynalds Enic, Scienle and Technology. Australian: Newsletter, 1993∶68
3 Andersson L, et al., Isolation of phosphoproteins by immiobilized metal (Fe3+) affinity chromatgraphy.
4 Muszynsha g, et al. Selectio adsorption of phosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate. Biochemistry, 1994, 25∶6850
(1999年5月5日收稿), http://www.100md.com