定量PCR检测慢性HBV感染者血清HBV-DNA含量
作者：雷瑞祥 梅咏予 徐启桓 张 英 邓练贤 杨绍基
单位：中山医科大学附属第三医院传染科(510630)
关键词：乙型肝炎病毒；核糖核酸；定量PCR
广东医学990813 【摘要】 目的 了解不同慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清HBV-DNA 含量并探讨其临床意义。方法应用荧光能量转移定量聚合酶链反应(QPCR) 检测 245例不同临床类型慢性HBV感染者血清HBV-DNA含量。结果 HBeAg阳性患者HBV -DNA含量(106.22±2.05拷贝/mL)显著高于HBeAg阴性/抗-HBe阳性患者的含量(104.54±1.84拷贝/mL)(P<0.001)；不同临床类型HBV感染者HBV-DNA含量：慢性携带者，慢性肝炎，慢性重型肝炎，乙型肝炎肝硬化，四组间差异无显著性(P> 0.05)。结论 HBV-DNA含量与HBeAg密切相关；HBV复制状态与慢性肝病的病期无明显关系。
, 百拇医药
我们采用荧光定量PCR法，调查了不同临床类型HBV感染者的HBV-DNA含量水平，结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 选择1998年1月～1999年1月在本科住院和门诊诊治的245例慢性HBV感染者(HBsAg均阳性)，年龄12～75岁(37.2±12.6岁)。男198例，女47例。按1995 年北京第5次全国传染病与寄生虫病学术会议修订诊断标准，其中，慢性HBV携带者28例，慢性肝炎143例(轻度45例，中度61例，重度37例)，慢性重型肝炎21例，乙型肝炎肝硬化53例。
1.2 HBV血清学标志和肝功能检测 采用常规ELISA方法检测HBV标志物，全自动生化分析仪检测肝功能。
1.3 血清HBV-DNA荧光定量PCR检测 采用荧光能量转移定量PCR法[1]，美国Biotronic公司提供的DNA扩增仪(AG-9600 Thermal station)、荧光阅读仪(AG -9600 AMPLISENSOR MINILYZER)、586型计算机及配套ASAP软件；荧光信号试剂及标化HBV- DNA由美国Biotronic公司提供。不对称扩增引物1为5′-TGTCTCGTGTTACAGGCGGGGT-3′；引物 2为5′-GAGGCATAGCAGCAGGAGAAGAG-3′；荧光信号引物为5′-TCGCTGGAAGTGTCTGCGGCGT-3 ′。 DNA定量结果分析按每毫升血清中检出一个3.2 Kb HBV-DNA定为一个拷贝(copy)，结果以指数N=10X拷贝/mL表示。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用STATA统计软件作统计分析。
2 结果
2.1 慢性HBV感染者血清e系统变化与血清HBV-DNA水平的观察 HBeAg阳性组血清HBV-DNA含量高于HBeAg阴性/抗-HBe阳性组。两组间含量比较有显著性统计学差异(表 1)(P<0.001)。
表1 慢性HBV感染者血清e系统与HBV-DNA水平的关系 组 别
例数
HBV-DNA含量的对数值(
±s)
HBeAg阳性
138
, 百拇医药
6.22±2.05
HBeAg阴性/抗-HBe阳性
107
4.54±1.84
2.2 不同临床类型HBV感染者血清HBV-DNA水平
各组间比较，经统计学分析，无统计学差异(P>0.05)。
表2 不同临床类型慢性HBV感染者血清HBV-DNA含量 组 别
例数
HBV-DNA含量的对数值(±s)
, http://www.100md.com
慢性HBV携带者
28
5.27±1.86
慢性肝炎(包括轻、中、重度)
143
5.56±1.99
慢性重型肝炎
21
5.41±1.95
乙型肝炎肝硬化
53
5.43±2.04
, 百拇医药
3 讨论
传统观点认为，HBeAg是HBV复制活跃及传染性强的指标，而抗-HBe意义基本与HBeAg相反，它的出现表明病毒复制减少，传染性减弱。Baker BL等[2]报告HBeAg阳性患者HBV-DNA(PCR)阳性率明显高于HBeAg阴性/抗-HBe阳性患者，而Jardi等[3]采用分支链DNA信号扩增法(bDNA法)，定量检测HBeAg阳性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性组的HBV-DN A含量，前者明显高于后者。信号引物能量转移定量PCR法是在常规PCR技术基础上发展起来的HBV-DNA定量检测法，较一般PCR检测HBV-DNA敏感性提高1万倍，本研究发现 HBeAg阳性HBV感染者血清HBV-DNA含量明显高于HBeAg阴性/抗-HB e阳性组(P<0.001)，与周子成等[4]报道相一致，从而从基因水平证实了HB eAg是反映HBV复制和传染性的良好指标。
本研究显示，慢性乙型肝炎病毒携带者，慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、乙型肝炎肝硬化四组间血清HBV-DNA含量无统计学差异(P>0.05 )，与文献一致[4]，说明HBV的复制状态在不同临床类型慢性肝病间无明显差异，病毒复制是否活跃与不同类型慢性肝病的病期无明显内在关系。通过肝活检结合血清HBV-DNA含量检测，研究表明肝组织活动性积分(HAI)与血清HBV-DNA含量无明显相关[5]。所以，在不同个体间，病情轻重与HBV-DNA含量无明显关系，可能跟机体不同的免疫状态有关。有必要对HBV-DNA含量、机体免疫状态、肝脏损伤程度三者之间的关系进行进一步研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Dzaki H, Mclaughlin LW. The estimation of distances bet ween spe cific backbone labeled sites in DNA using fluorecence resonance energy transfer. Nucleic Acids Res,1992,20:5205
2 Baker BL, Dibisceglie AM, Kanedo S, et al. Determination of hepatitis B virus DNA in serum using the polymerase chain reaction: clinical significance and correlation with biochemical and serological markers. Hepatology,1991,13:632
, http://www.100md.com
3 Jardi R, Buti M, Cotrina M, et al. Quantitative determination of HBV-DNA in chronic hepatitis B: comparison of three methods. Gastroenterol Hepatol,1998 , 21(7):327
4 周子成，刘重阳，杨建民.不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检测及其临床意义.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(2)：129
5 焦平华，杨 伟，马 光.乙型肝炎患者肝活动指数与血清HBV-DNA含量关系初探.实用肝脏病杂志，1998，3(4)：198, http://www.100md.com
单位：中山医科大学附属第三医院传染科(510630)
关键词：乙型肝炎病毒；核糖核酸；定量PCR
广东医学990813 【摘要】 目的 了解不同慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清HBV-DNA 含量并探讨其临床意义。方法应用荧光能量转移定量聚合酶链反应(QPCR) 检测 245例不同临床类型慢性HBV感染者血清HBV-DNA含量。结果 HBeAg阳性患者HBV -DNA含量(106.22±2.05拷贝/mL)显著高于HBeAg阴性/抗-HBe阳性患者的含量(104.54±1.84拷贝/mL)(P<0.001)；不同临床类型HBV感染者HBV-DNA含量：慢性携带者，慢性肝炎，慢性重型肝炎，乙型肝炎肝硬化，四组间差异无显著性(P> 0.05)。结论 HBV-DNA含量与HBeAg密切相关；HBV复制状态与慢性肝病的病期无明显关系。
, 百拇医药
我们采用荧光定量PCR法，调查了不同临床类型HBV感染者的HBV-DNA含量水平，结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 选择1998年1月～1999年1月在本科住院和门诊诊治的245例慢性HBV感染者(HBsAg均阳性)，年龄12～75岁(37.2±12.6岁)。男198例，女47例。按1995 年北京第5次全国传染病与寄生虫病学术会议修订诊断标准，其中，慢性HBV携带者28例，慢性肝炎143例(轻度45例，中度61例，重度37例)，慢性重型肝炎21例，乙型肝炎肝硬化53例。
1.2 HBV血清学标志和肝功能检测 采用常规ELISA方法检测HBV标志物，全自动生化分析仪检测肝功能。
1.3 血清HBV-DNA荧光定量PCR检测 采用荧光能量转移定量PCR法[1]，美国Biotronic公司提供的DNA扩增仪(AG-9600 Thermal station)、荧光阅读仪(AG -9600 AMPLISENSOR MINILYZER)、586型计算机及配套ASAP软件；荧光信号试剂及标化HBV- DNA由美国Biotronic公司提供。不对称扩增引物1为5′-TGTCTCGTGTTACAGGCGGGGT-3′；引物 2为5′-GAGGCATAGCAGCAGGAGAAGAG-3′；荧光信号引物为5′-TCGCTGGAAGTGTCTGCGGCGT-3 ′。 DNA定量结果分析按每毫升血清中检出一个3.2 Kb HBV-DNA定为一个拷贝(copy)，结果以指数N=10X拷贝/mL表示。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用STATA统计软件作统计分析。
2 结果
2.1 慢性HBV感染者血清e系统变化与血清HBV-DNA水平的观察 HBeAg阳性组血清HBV-DNA含量高于HBeAg阴性/抗-HBe阳性组。两组间含量比较有显著性统计学差异(表 1)(P<0.001)。
表1 慢性HBV感染者血清e系统与HBV-DNA水平的关系 组 别
例数
HBV-DNA含量的对数值(
±s)HBeAg阳性
138
, 百拇医药
6.22±2.05
HBeAg阴性/抗-HBe阳性
107
4.54±1.84
2.2 不同临床类型HBV感染者血清HBV-DNA水平
各组间比较，经统计学分析，无统计学差异(P>0.05)。
表2 不同临床类型慢性HBV感染者血清HBV-DNA含量 组 别
例数
HBV-DNA含量的对数值(
±s), http://www.100md.com
慢性HBV携带者
28
5.27±1.86
慢性肝炎(包括轻、中、重度)
143
5.56±1.99
慢性重型肝炎
21
5.41±1.95
乙型肝炎肝硬化
53
5.43±2.04
, 百拇医药
3 讨论
传统观点认为，HBeAg是HBV复制活跃及传染性强的指标，而抗-HBe意义基本与HBeAg相反，它的出现表明病毒复制减少，传染性减弱。Baker BL等[2]报告HBeAg阳性患者HBV-DNA(PCR)阳性率明显高于HBeAg阴性/抗-HBe阳性患者，而Jardi等[3]采用分支链DNA信号扩增法(bDNA法)，定量检测HBeAg阳性和HBeAg阴性/抗-HBe阳性组的HBV-DN A含量，前者明显高于后者。信号引物能量转移定量PCR法是在常规PCR技术基础上发展起来的HBV-DNA定量检测法，较一般PCR检测HBV-DNA敏感性提高1万倍，本研究发现 HBeAg阳性HBV感染者血清HBV-DNA含量明显高于HBeAg阴性/抗-HB e阳性组(P<0.001)，与周子成等[4]报道相一致，从而从基因水平证实了HB eAg是反映HBV复制和传染性的良好指标。
本研究显示，慢性乙型肝炎病毒携带者，慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、乙型肝炎肝硬化四组间血清HBV-DNA含量无统计学差异(P>0.05 )，与文献一致[4]，说明HBV的复制状态在不同临床类型慢性肝病间无明显差异，病毒复制是否活跃与不同类型慢性肝病的病期无明显内在关系。通过肝活检结合血清HBV-DNA含量检测，研究表明肝组织活动性积分(HAI)与血清HBV-DNA含量无明显相关[5]。所以，在不同个体间，病情轻重与HBV-DNA含量无明显关系，可能跟机体不同的免疫状态有关。有必要对HBV-DNA含量、机体免疫状态、肝脏损伤程度三者之间的关系进行进一步研究。
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参考文献
1 Dzaki H, Mclaughlin LW. The estimation of distances bet ween spe cific backbone labeled sites in DNA using fluorecence resonance energy transfer. Nucleic Acids Res,1992,20:5205
2 Baker BL, Dibisceglie AM, Kanedo S, et al. Determination of hepatitis B virus DNA in serum using the polymerase chain reaction: clinical significance and correlation with biochemical and serological markers. Hepatology,1991,13:632
, http://www.100md.com
3 Jardi R, Buti M, Cotrina M, et al. Quantitative determination of HBV-DNA in chronic hepatitis B: comparison of three methods. Gastroenterol Hepatol,1998 , 21(7):327
4 周子成，刘重阳，杨建民.不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检测及其临床意义.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(2)：129
5 焦平华，杨 伟，马 光.乙型肝炎患者肝活动指数与血清HBV-DNA含量关系初探.实用肝脏病杂志，1998，3(4)：198, http://www.100md.com