急性重症胰腺炎犬胰组织P-选择素表达的变化
作者：诸琦 徐家裕 袁耀宗 储谦 程齐俭 黄晔
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院
关键词：P-选择素；急性重症胰腺炎；动物实验
上海医学990804 【摘要】 目的 研究实验动物急性重症胰腺炎时P-选择素的表达变化，拟进一步阐明重症胰腺炎的发病机制。方法 制备犬急性重症胰腺炎模型，取胰组织用免疫组化技术观察P-选择素的表达，并经图像扫描作量化处理。结果 正常胰组织中P-选择素几乎无阳性表达，而急性重症胰腺炎时其表达呈大幅度上调，为(30.76±7.47)%，且发现中性粒细胞胞浆P-选择素呈阳性表达。结论 P-选择素参与并介导了炎症反应，在急性重症胰腺炎发病中是导致炎症发生、发展的重要因素。同时，提出了中性粒细胞可能存在自身激活的初步观点。
The expression of P-selectin in pancreatic
, http://www.100md.com
tissue of canine severe acute pancr eatitis
ZHU Qi, XU Jia-yu, YUAN Yaozong, et al.
Department of Gastroenterology, Shanghai Second
Medical University, Ruijin Hos pital 200025
【Abstract】 Objective In animal experiment, th e expression of P-selectin in pancreatic tissue during acute severe pancreatit is (ASP) was studied in an attempt to further elucidate the pathogenesis of seve re acute pancreatitis; Method ASP model was prepared in five dogs, the expression of P-selectin in pancreatic tissue was studied with its monoclonal antibody and l abelled streptavidin biotin (LSAB) immunocyto-chemical staining technique. Posi ti ve expression of P-selectin was measured by the use of Computer Image Digital A nalysis System; Results P-selectin was present in ASP dogs' pancreatic tissue but nearly absent in normal pancreatic tissue, the positive expression density o f P-selectin especially in neutrophils of the pancreatic interstitium in ASP wa s 30.76%±7.47%;Conclusion P-selectin by initiating and mediating cell activat ion, might play an active role in the development of inflammation in ASP. Beside s, The neutrophils might serve the role of self-activati on during ASP.(Shanghai Med J, 1999,22∶460-462)
, 百拇医药
【Key words】 P-selectin Acute severe pancreatitis Animal experiment
近年来，细胞粘附分子及其研究已成为热点，而作为其家族成员之一的P-选择素(P-selectin)，由于介导活化血小板及炎症细胞与血管内皮细胞的相互作用，参与炎症的发生、发展，因此备受人们关注。鉴于急性重症胰腺炎(ASP)病理组织及病理生理学的改变，中性粒细胞浸润仍作为该疾病产生的重要基础，本文旨在通过运用动物模型，研究ASP时胰组织中P-选择素的表达，试图阐明其在ASP发病机制中的作用。
材料和方法
一、实验动物及标本来源
成年杂种犬5条，体重10.5～13.0kg，雌雄不拘(购自上海市实验动物中心)，于致ASP模型后4小时处死，取胰组织10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切4μm厚片待检。另取犬正常胰组织作对照。
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二、犬ASP模型制备
所有犬实验前禁食12小时，不禁水；实验当日先予氯胺酮肌内注射诱导麻醉继以2.5%戊巴比妥钠(1ml/kg)静脉麻醉。进腹后寻及十二指肠，于降段系膜缘对侧纵行剖开肠管约2cm，并于系膜侧找见主胰管开口，置一细硅胶管于主胰管内，均匀向内加压注入5%牛磺酸钠(0.7ml/mg)和狗自身胆汁2～3ml混合液，滞留5分钟后拔管。
三、主要试剂及设备
P-选择素单抗(苏州医学院)，LSAB试剂盒(丹麦DAKO公司)，KS400图像分析系统，UMSP显微分光光度计(德国ZEISS公司生产)。
四、免疫组化方法
免疫组化采用链霉亲和素-生物素酶标法(labelled streptavidin biotin,LSAB)。
, 百拇医药
五、结果判定
先于光镜下判定有无阳性表达(阳性呈棕黄色颗粒)，再利用计算机图像扫描分析系统对阳性表达区域进行量值化处理。每张切片计算3个阳性表达区域高倍光镜(400×)视野；灰度阈值设定为150。结果以阳性表达密度(%)的均数±标准差(
±s)表示。
结果
一、正常犬胰组织中未见炎症细胞浸润及P-选择素阳性表达，而犬ASP4小时时除胰腺腺泡细胞和组织血管内皮P-选择素阳性表达外，见胰组织间质中大量炎症细胞浸润，其中以中性粒细胞为主并伴胞浆P-选择素阳性表达。
二、表1示犬ASP4小时时胰组织中P-选择素的表达密度
表1 ASP后4小时3个阳性表达区胰腺组织P-选择
, http://www.100md.com
素表达密度(%) 序号
P-选择素表达密度(%)
1
38.31
27.44
25.61
30.45
2
39.96
11.20
36.86
, http://www.100md.com 29.34
3
35.43
31.55
28.25
31.74
4
24.66
37.48
27.45
29.86
5
37.34
, http://www.100md.com
27.22
32.70
32.42
讨论
ASP是临床常见的较为凶险的疾病，其发病机制极为复杂。过去认为胰蛋白酶原的激活引起其他胰酶的激活而促发胰腺炎症，而现在认为多形核细胞激活并分泌细胞因子甚至是更为重要的机制。已经证实，ASP时最先出现在炎症区的是中性粒细胞，以后有巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞及其他细胞。
P-选择素140(granular membrane protein 140,GMP140)，又称血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白(platelet activation dependent granule external membrane protein,PADGEM)或CD62p，是一种由789个氨基酸碱基构成的相对分子质量为140000的膜糖蛋白。在血小板或内皮细胞受凝血酶、组胺、肿瘤坏死因子(TNF)或氧自由基等介导而活化时，血小板的α-颗粒和内皮细胞Weibel-Palade小体膜与细胞膜迅速融合，导致P-选择素在细胞上的表达[1]；进而，P-选择素通过与白细胞膜上的P-选择素配体(Sialyl-lewisX抗原)结合，调节白细胞在血管内皮细胞上的“滚动”并介导炎症细胞外渗[2,3]，同时，它还参与介导活化的内皮细胞或血小板、中性粒细胞、单核细胞及T淋巴细胞亚群之间的相互作用，从而介导正常组织结构的破坏，导致组织的炎症、损伤[4]。因此，P-选择素在正常情况下为低水平表达或不表达，而在急性炎症早期炎症细胞向受损部位趋集过程中表达明显增加[5]。
, 百拇医药
本研究结果提示，在正常犬胰组织中P-选择素几乎没有表达，而在ASP状态下胰腺组织包括胰腺腺泡细胞和血管内皮细胞等的表达均呈大幅度上调，达(30.76±7.47)%，这与目前研究结论相符[6～8]；因此，推测P-选择素作为激活血小板等分泌表达的活化分子或标志，在使炎症细胞趋向炎症区域以及介导活化血小板、内皮细胞、与中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞的粘附，在重症胰腺炎的早期炎症中起着参与与介导的关键作用；进而，由这些炎症细胞所释放的具组织破坏性能的介质，包括弹性蛋白酶、磷脂酶A2、血小板活化因子、各种反应性氧物质及细胞因子等将进一步加重胰腺炎症的程度。
此外，本研究又发现，P-选择素的阳性表达还大多集中于原来认为其胞膜仅存在P-选择素配体的中性粒细胞的胞浆内，这一结果一方面进一步揭示了P-选择素在ASP发病机制中是导致炎症发生、发展的重要因素，阐明了炎症细胞激活的始动机制；另一方面，可能预示着炎症细胞尤为中性粒细胞可能同时存在P-选择素和其配体的情况。因此，提出了在ASP炎症过程早期中性粒细胞可以自身激活的假说。诚然，目前的结果只是初步的、蛋白质水平的论证，今后仍有待于利用RT-PCR或原位杂交方法从核酸水平加以证实，且其重复性也有待进一步考证。
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总之，本研究通过对ASP时P-选择素表达变化的初探，证实了ASP早期P-选择素在炎症细胞快速粘附并跨过血管内皮游走至受损部位参与且启动炎症反应过程中的作用；同时，提出了中性粒细胞自身激活的假说，深化了我们对ASP发病机制的认识。此外，结合考虑P-选择素在细胞胞浆的表达不需要一个蛋白合成的过程，对其是否可在临床早期即预示胰腺炎的严重程度及活动转归；或是否可通过其单克隆抗体及受体拮抗剂的应用，达到临床治疗的目的，也为以后该研究的深入提供了一定的思路。 参考文献
1 Bevilague MP, Nalson RM. Selectins. J Chin Invest, 1993,910:379.
2 Wagner DD. P-selectin chases a butterfly. J Clin Invest, 1995,95:195.
3 Cooling LL, Zhang DS, Walker KE, et al. Detection in human blood plate lets of sialyl Lewis X gangliosides, potential ligands for CD62 and other select ins. Glycobiology, 1995,5:571-581.
, 百拇医药
4 Boukerche H, Ruchand-Sparagano MH, Roune C, et al. A monoclonal antib ody directed against a granule membrane glycoprotein (GMP 140/PADGEM, P-selecti n, CD 62p) inhibits ristocetin-induced platelet aggregation. Br J Haematol, 1996,92:442-451.
5 Kameda H, Morita I, Handa M, et al. Re-expression of functional P-se lectin molecules on the endothelial cell surface by replaced stimulation with th rombin. Pre J Haematol, 1997,97:348-355.
, http://www.100md.com
6 Holme S, Sweeney JD, Sawyer S, et al. The expression of P-selectin du ring collection, processing and storage of platelet concentrations:relationship to loss of vivo viability. Transfusion,1997,37:12-17.
7 李晓，周同，郝翠兰，等.Significance of P-selectin expression in human glomerulonephritis. Chinese Medical Journal, 1997,110:512-514.
8 Kameda H, Moritin I, Handa M, et al. Re-expression of functional P-s electin molecules on the endothelial cell surface by repeated stimulation with thrombin. Br J Haematol, 1997,97:348:355.
(收稿：1999-02-12；修回：1999-04-15), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学附属瑞金医院
关键词：P-选择素；急性重症胰腺炎；动物实验
上海医学990804 【摘要】 目的 研究实验动物急性重症胰腺炎时P-选择素的表达变化，拟进一步阐明重症胰腺炎的发病机制。方法 制备犬急性重症胰腺炎模型，取胰组织用免疫组化技术观察P-选择素的表达，并经图像扫描作量化处理。结果 正常胰组织中P-选择素几乎无阳性表达，而急性重症胰腺炎时其表达呈大幅度上调，为(30.76±7.47)%，且发现中性粒细胞胞浆P-选择素呈阳性表达。结论 P-选择素参与并介导了炎症反应，在急性重症胰腺炎发病中是导致炎症发生、发展的重要因素。同时，提出了中性粒细胞可能存在自身激活的初步观点。
The expression of P-selectin in pancreatic
, http://www.100md.com
tissue of canine severe acute pancr eatitis
ZHU Qi, XU Jia-yu, YUAN Yaozong, et al.
Department of Gastroenterology, Shanghai Second
Medical University, Ruijin Hos pital 200025
【Abstract】 Objective In animal experiment, th e expression of P-selectin in pancreatic tissue during acute severe pancreatit is (ASP) was studied in an attempt to further elucidate the pathogenesis of seve re acute pancreatitis; Method ASP model was prepared in five dogs, the expression of P-selectin in pancreatic tissue was studied with its monoclonal antibody and l abelled streptavidin biotin (LSAB) immunocyto-chemical staining technique. Posi ti ve expression of P-selectin was measured by the use of Computer Image Digital A nalysis System; Results P-selectin was present in ASP dogs' pancreatic tissue but nearly absent in normal pancreatic tissue, the positive expression density o f P-selectin especially in neutrophils of the pancreatic interstitium in ASP wa s 30.76%±7.47%;Conclusion P-selectin by initiating and mediating cell activat ion, might play an active role in the development of inflammation in ASP. Beside s, The neutrophils might serve the role of self-activati on during ASP.(Shanghai Med J, 1999,22∶460-462)
, 百拇医药
【Key words】 P-selectin Acute severe pancreatitis Animal experiment
近年来，细胞粘附分子及其研究已成为热点，而作为其家族成员之一的P-选择素(P-selectin)，由于介导活化血小板及炎症细胞与血管内皮细胞的相互作用，参与炎症的发生、发展，因此备受人们关注。鉴于急性重症胰腺炎(ASP)病理组织及病理生理学的改变，中性粒细胞浸润仍作为该疾病产生的重要基础，本文旨在通过运用动物模型，研究ASP时胰组织中P-选择素的表达，试图阐明其在ASP发病机制中的作用。
材料和方法
一、实验动物及标本来源
成年杂种犬5条，体重10.5～13.0kg，雌雄不拘(购自上海市实验动物中心)，于致ASP模型后4小时处死，取胰组织10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切4μm厚片待检。另取犬正常胰组织作对照。
, http://www.100md.com
二、犬ASP模型制备
所有犬实验前禁食12小时，不禁水；实验当日先予氯胺酮肌内注射诱导麻醉继以2.5%戊巴比妥钠(1ml/kg)静脉麻醉。进腹后寻及十二指肠，于降段系膜缘对侧纵行剖开肠管约2cm，并于系膜侧找见主胰管开口，置一细硅胶管于主胰管内，均匀向内加压注入5%牛磺酸钠(0.7ml/mg)和狗自身胆汁2～3ml混合液，滞留5分钟后拔管。
三、主要试剂及设备
P-选择素单抗(苏州医学院)，LSAB试剂盒(丹麦DAKO公司)，KS400图像分析系统，UMSP显微分光光度计(德国ZEISS公司生产)。
四、免疫组化方法
免疫组化采用链霉亲和素-生物素酶标法(labelled streptavidin biotin,LSAB)。
, 百拇医药
五、结果判定
先于光镜下判定有无阳性表达(阳性呈棕黄色颗粒)，再利用计算机图像扫描分析系统对阳性表达区域进行量值化处理。每张切片计算3个阳性表达区域高倍光镜(400×)视野；灰度阈值设定为150。结果以阳性表达密度(%)的均数±标准差(
±s)表示。结果
一、正常犬胰组织中未见炎症细胞浸润及P-选择素阳性表达，而犬ASP4小时时除胰腺腺泡细胞和组织血管内皮P-选择素阳性表达外，见胰组织间质中大量炎症细胞浸润，其中以中性粒细胞为主并伴胞浆P-选择素阳性表达。
二、表1示犬ASP4小时时胰组织中P-选择素的表达密度
表1 ASP后4小时3个阳性表达区胰腺组织P-选择
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素表达密度(%) 序号
P-选择素表达密度(%)
1
38.31
27.44
25.61
30.45
2
39.96
11.20
36.86
, http://www.100md.com 29.34
3
35.43
31.55
28.25
31.74
4
24.66
37.48
27.45
29.86
5
37.34
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27.22
32.70
32.42
讨论
ASP是临床常见的较为凶险的疾病，其发病机制极为复杂。过去认为胰蛋白酶原的激活引起其他胰酶的激活而促发胰腺炎症，而现在认为多形核细胞激活并分泌细胞因子甚至是更为重要的机制。已经证实，ASP时最先出现在炎症区的是中性粒细胞，以后有巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞及其他细胞。
P-选择素140(granular membrane protein 140,GMP140)，又称血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白(platelet activation dependent granule external membrane protein,PADGEM)或CD62p，是一种由789个氨基酸碱基构成的相对分子质量为140000的膜糖蛋白。在血小板或内皮细胞受凝血酶、组胺、肿瘤坏死因子(TNF)或氧自由基等介导而活化时，血小板的α-颗粒和内皮细胞Weibel-Palade小体膜与细胞膜迅速融合，导致P-选择素在细胞上的表达[1]；进而，P-选择素通过与白细胞膜上的P-选择素配体(Sialyl-lewisX抗原)结合，调节白细胞在血管内皮细胞上的“滚动”并介导炎症细胞外渗[2,3]，同时，它还参与介导活化的内皮细胞或血小板、中性粒细胞、单核细胞及T淋巴细胞亚群之间的相互作用，从而介导正常组织结构的破坏，导致组织的炎症、损伤[4]。因此，P-选择素在正常情况下为低水平表达或不表达，而在急性炎症早期炎症细胞向受损部位趋集过程中表达明显增加[5]。
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本研究结果提示，在正常犬胰组织中P-选择素几乎没有表达，而在ASP状态下胰腺组织包括胰腺腺泡细胞和血管内皮细胞等的表达均呈大幅度上调，达(30.76±7.47)%，这与目前研究结论相符[6～8]；因此，推测P-选择素作为激活血小板等分泌表达的活化分子或标志，在使炎症细胞趋向炎症区域以及介导活化血小板、内皮细胞、与中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞的粘附，在重症胰腺炎的早期炎症中起着参与与介导的关键作用；进而，由这些炎症细胞所释放的具组织破坏性能的介质，包括弹性蛋白酶、磷脂酶A2、血小板活化因子、各种反应性氧物质及细胞因子等将进一步加重胰腺炎症的程度。
此外，本研究又发现，P-选择素的阳性表达还大多集中于原来认为其胞膜仅存在P-选择素配体的中性粒细胞的胞浆内，这一结果一方面进一步揭示了P-选择素在ASP发病机制中是导致炎症发生、发展的重要因素，阐明了炎症细胞激活的始动机制；另一方面，可能预示着炎症细胞尤为中性粒细胞可能同时存在P-选择素和其配体的情况。因此，提出了在ASP炎症过程早期中性粒细胞可以自身激活的假说。诚然，目前的结果只是初步的、蛋白质水平的论证，今后仍有待于利用RT-PCR或原位杂交方法从核酸水平加以证实，且其重复性也有待进一步考证。
, http://www.100md.com
总之，本研究通过对ASP时P-选择素表达变化的初探，证实了ASP早期P-选择素在炎症细胞快速粘附并跨过血管内皮游走至受损部位参与且启动炎症反应过程中的作用；同时，提出了中性粒细胞自身激活的假说，深化了我们对ASP发病机制的认识。此外，结合考虑P-选择素在细胞胞浆的表达不需要一个蛋白合成的过程，对其是否可在临床早期即预示胰腺炎的严重程度及活动转归；或是否可通过其单克隆抗体及受体拮抗剂的应用，达到临床治疗的目的，也为以后该研究的深入提供了一定的思路。 参考文献
1 Bevilague MP, Nalson RM. Selectins. J Chin Invest, 1993,910:379.
2 Wagner DD. P-selectin chases a butterfly. J Clin Invest, 1995,95:195.
3 Cooling LL, Zhang DS, Walker KE, et al. Detection in human blood plate lets of sialyl Lewis X gangliosides, potential ligands for CD62 and other select ins. Glycobiology, 1995,5:571-581.
, 百拇医药
4 Boukerche H, Ruchand-Sparagano MH, Roune C, et al. A monoclonal antib ody directed against a granule membrane glycoprotein (GMP 140/PADGEM, P-selecti n, CD 62p) inhibits ristocetin-induced platelet aggregation. Br J Haematol, 1996,92:442-451.
5 Kameda H, Morita I, Handa M, et al. Re-expression of functional P-se lectin molecules on the endothelial cell surface by replaced stimulation with th rombin. Pre J Haematol, 1997,97:348-355.
, http://www.100md.com
6 Holme S, Sweeney JD, Sawyer S, et al. The expression of P-selectin du ring collection, processing and storage of platelet concentrations:relationship to loss of vivo viability. Transfusion,1997,37:12-17.
7 李晓，周同，郝翠兰，等.Significance of P-selectin expression in human glomerulonephritis. Chinese Medical Journal, 1997,110:512-514.
8 Kameda H, Moritin I, Handa M, et al. Re-expression of functional P-s electin molecules on the endothelial cell surface by repeated stimulation with thrombin. Br J Haematol, 1997,97:348:355.
(收稿：1999-02-12；修回：1999-04-15), 百拇医药