放射性核素标记的单克隆抗体的定量测定
作者：苗积生 沈毅
单位：200433 上海市肺科医院
关键词：放射性标记；单克隆抗体；免疫反应活性分数；抗体测定
放射性核素标记的单克隆抗体的定量测定 【摘要】 目的 测定放射性核素标记单克隆抗体(McAb)的含量。方法 应用标记的McAb与靶细胞抗原的结合试验，采用平衡方程式T/B=1+1/(Ka.C)+T/C。Ka，T，B，C分别是结合常数，总的McAb的浓度，结合的McAb的浓度及恒定靶细胞抗原的浓度。结果 实验数据说明T/B对T有极明显的直线相关性。通过直线回归分析，可计算出直线方程。直线与T/B轴相交点的T/B值的倒数是标记的免疫反应的活性部分。用恒定的标记McAb浓度和不同的未标记的McAb代替T，实验结果仍表现T/B与未标记的McAb呈明显的直线相关性。此直线与免疫反应活性部分的倒数T/B值直线的交点到T/B轴的距离就是标记的McAb的实际浓度。结论 本实验方法对放射性核素标记McAb的定量测定是可行的。
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Quantitative determination of
radionuclide-labelled monoclonal antibodies
MIAO Jisheng,SHEN Yi.
Shanghai Pulmonolo gy Hospital,Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To determine the quantit y of radionuclide-labelled monoclonal antibodies. Methods Using binding assay for radionuclide-labelled McAb wi th target cell antigen,the formula of equilibrium plot was T/B=1+1(Ka.C)+T/C.Ka , T,B and C were the association constants,the concentration of total McAb,the conc entration of binding McAb and constant concentration of target cell antigen,resp ectively.Results The experimental data demonstrated a very significant l i near correlationship of T/B to T,and was calculated by means of linear regressio n analysis.The inverse T/B value of the intersecting point of the T/B axis was th e imm unoreactive fraction of labelled McAb.Using constant labelled McAb concentration and unlabelled McAb concentration substitute for T,the data also demonstrated a very close linear correlationship of T/B as a function of unlabelled McAb.The d i stance from the intersecting point of this line with T/B line of immunoreactive fraction to T/ B axis was the actual concentration of inmunoreactive fraction of labelled McAb.Conclusion The above method is feasible as a quantitive determi nation of radionuclide-labelled McAb.(Shanghai Med J, 1992,22:457-459)
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【Key words】 Radiolabel Monoclonal antibody Immun oreactive fraction Quantitative detemination
以放射性核素标记的McAb进行免疫学研究是广泛应用的方法之一。由于标记McAb核素量微，容器对其吸附作用有差异，标记本身对McAb活性有损伤，标记后要加无关蛋白保护，实验应用时常常还要多次稀释，因此要确切测定标记的McAb的含量有一定的难度。本文用标记McAb与靶抗原结合实验的放射性分析法，为标记单抗的定量提供一个方法。
材料和方法
一、实验材料
抗原为人小细胞肺癌细胞株NCI-H128，以含15%小牛血清的1640培养基培养，细胞呈悬浮状，取对数生长的细胞。抗此细胞的McAb2F7，为IgG2a型，由上海市肿瘤研究所提供，用proteinA-SepharoseCL4B亲和层析柱纯化，用Iodogen法标记131I，约37MBq/mgMcAb。
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二、标记McAb免疫活性测定
我们建立一种测定标记McAb免疫活性的方法[1]。基本原理是标记McAb与靶抗原保温处于平衡时，根据质量作用定律近似符合如下公式：T/B=1+1/(Ka.C)+T/C,T、B、C分别代表实验中总的和结合的标记McAb浓度及靶抗原浓度。Ka为亲和常数。当C浓度恒定，T与T/B近似呈直线关系，在T趋于无穷小时，由于C相对过量，有活性的标记McAb都应结合到靶抗原上。此时的B/T最大，代表标记McAb活性的保持程度。其值为上述直线在T/B轴上截距的倒数，可由直线回归分析计算出，见图1。在理想条件下，即标记McAb活性保持不变，此直线与T/B轴交点的T/B→1。通常标记McAb活性必定受损则T/B>1，B/T<1。实验的131I-2F7为50～1000ng/ml(反应的最终浓度，下同)。每个实验管中靶细胞数相同，为6×105/ml，反应体积为0.5ml，内含5%小牛血清PBS液。4℃旋转保温2小时，测各管计数率，即代表各管中加入的标记McAb浓度T。用5%小牛血清PBS液洗细胞2次，将未结合在细胞抗原上的游离的标记McAb洗去后再测计数率，即为各管中结合在细胞上的标记McAb浓度B。同时做封闭对照试验，方法同上，不同的是试管中多加50μg未标记的2F7竞争抑制标记McAb与细胞的结合。以封闭管的B/T为空白对照，通常它的B/T<0.02。
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图1 不同浓度131I-2F7McAb与恒定浓度抗原细胞结合实验
三、标记的McAb定量测定
上述公式中如T中标记的McAb浓度也保持不变，实验中再加入系列浓度的未标记McAb，则上述公式意义未变，T为标记和未标记的McAb的总和。因标记McAb浓度是恒定不变的，因此T/B与未标记McAb浓度仍呈近似直线关系。可以T/B对未标记McAb浓度作图，得一近似的直线，见图2。直线会与标记McAb免疫活性分数B/T值的倒数T/B值的直线相交。此交点反映了实验中加入标记及未标记McAb都是0，在图2横坐标中表现为负值，此点到T/B轴距离的绝对值，就是实验中加入标记McAb的实际浓度。实验靶细胞数2×105/每管，加入标记的McAb浓度相同以cpm计，平均为5816cpm，加入的未标记McAb分别为300，150，75，37.5，18.8，9.4，4.7，2.4，0ng。保温、测定等其他操作同上。
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图2 不同浓度的2F7加恒定浓度的131I-2F7McAb与恒定浓度抗原细胞结合实验
结果
一、标记McAb免疫活性测定管共做6个梯度，加131I-2F7的计数率分别为1698，4164，7614，12833，20075和34131cpm；测得的T/B值(已减去封闭管)分别为1.50，1.75，2.92，3.91，6.40和8.64。以T/B为纵轴，计数率为横轴作图得一近似直线，见图1。直线回归方程为T/B=1.09+2.3×10-4T，T以放射性计数率表示，相关系数为0.991,P<0.01，相关是极显著的。直线在纵轴的截距为1.09，其倒数为0.92。从而得出本试验131I-2F7活性保持在92%。
二、标记的McAb恒定量测定管中加入未标记McAb的量从300ng至0测得的B/T百分比分别是9.8，18.8，25.9，30.1，37.3，39.0，39.8，45.2，48.4；则T/B分别是10.20，5.32，3.86，3.32，2.68，2.56，2.51，2.21，2.07。以T/B为纵座标，加入未标记McAb量为横座标作图，得一近似直线，见图2。直线回归分析的相关系数γ=0.993,P<0.01，直线相关极显著。回归方程为T/B=2.16+0.0257x，x为McAb的ng数。由标记McAb免疫活性分析，得出本标记的免疫反应活性保持的程度为0.92，其倒数为1.09。所以上述直线与纵坐标值为1.09的直线相交，其交点到横坐标的距离绝对值，即为加入的标记McAb的含量，按上述回归方程计算含量平均为41.63ng，平均的cpm为5816，那当时标记的每ngMcAb为140cpm，放射性活度为21.7Bq。
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讨论
放射性核素标记化合物的定量一般按投入的化合物的量和标记率来计算化合物上的核素量。在标记McAb的实验中，按此定量误差很大。我们对比过这2种计算方法与本文介绍的方法比较可相差几倍。显然将极大影响定量的免疫研究结果。我们介绍的方法其特点是将标记的McAb表示为相当于多少未标记的McAb量。这是因为标记时，放射性核素对McAb除了有损伤破坏作用外，还可能对McAb进行了一定的修饰，改变了与抗原结合的某些特性，产生一定的变化。从这个角度讲，与未标记McAb是不等同的，尤其表现在免疫的某些特性上。
我们在放射性核素标记McAb的免疫活性的研究中，分析了抗原抗体反应近似存在T/B=1+1/(Ka.C)+T/C的反应平衡方程。我们对多种McAb进行了研究，证明实验中T/B与T确实存在着极显著的直线相关性。这和Lindmo提出的方程式一样，都可在测定标记的McAb活性方面得到很好应用[2，3]。标记McAb的活性和含量测定方法解决了，就可以计算出McAb的亲和常数及每个靶抗原细胞上可以结合McAb的最大容量等定量方法。进而开展抗原抗体的定量研究则可保证准确可靠。
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参考文献
1 苗积生，沈毅，吴吉勇.放射性核素标记单克隆抗体(McAb)免疫反应活性分数的测定.同位素，1996，9：85.
2 Lindmo T,Boven E,Cuttitta F,et al.Determination of the immunoreactive fractio n of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at in finite antigen excess.J Immuno Meth,1984,72:77.
3 苗积生，沈毅，吴吉勇，等.放射性核素标记的单克隆抗体免疫活性测定.中国实验临床 免疫学杂志，1991，3：13.
(收稿：1998-09-30 修回：1998-12-10), 百拇医药
单位：200433 上海市肺科医院
关键词：放射性标记；单克隆抗体；免疫反应活性分数；抗体测定
放射性核素标记的单克隆抗体的定量测定 【摘要】 目的 测定放射性核素标记单克隆抗体(McAb)的含量。方法 应用标记的McAb与靶细胞抗原的结合试验，采用平衡方程式T/B=1+1/(Ka.C)+T/C。Ka，T，B，C分别是结合常数，总的McAb的浓度，结合的McAb的浓度及恒定靶细胞抗原的浓度。结果 实验数据说明T/B对T有极明显的直线相关性。通过直线回归分析，可计算出直线方程。直线与T/B轴相交点的T/B值的倒数是标记的免疫反应的活性部分。用恒定的标记McAb浓度和不同的未标记的McAb代替T，实验结果仍表现T/B与未标记的McAb呈明显的直线相关性。此直线与免疫反应活性部分的倒数T/B值直线的交点到T/B轴的距离就是标记的McAb的实际浓度。结论 本实验方法对放射性核素标记McAb的定量测定是可行的。
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radionuclide-labelled monoclonal antibodies
MIAO Jisheng,SHEN Yi.
Shanghai Pulmonolo gy Hospital,Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To determine the quantit y of radionuclide-labelled monoclonal antibodies. Methods Using binding assay for radionuclide-labelled McAb wi th target cell antigen,the formula of equilibrium plot was T/B=1+1(Ka.C)+T/C.Ka , T,B and C were the association constants,the concentration of total McAb,the conc entration of binding McAb and constant concentration of target cell antigen,resp ectively.Results The experimental data demonstrated a very significant l i near correlationship of T/B to T,and was calculated by means of linear regressio n analysis.The inverse T/B value of the intersecting point of the T/B axis was th e imm unoreactive fraction of labelled McAb.Using constant labelled McAb concentration and unlabelled McAb concentration substitute for T,the data also demonstrated a very close linear correlationship of T/B as a function of unlabelled McAb.The d i stance from the intersecting point of this line with T/B line of immunoreactive fraction to T/ B axis was the actual concentration of inmunoreactive fraction of labelled McAb.Conclusion The above method is feasible as a quantitive determi nation of radionuclide-labelled McAb.(Shanghai Med J, 1992,22:457-459)
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【Key words】 Radiolabel Monoclonal antibody Immun oreactive fraction Quantitative detemination
以放射性核素标记的McAb进行免疫学研究是广泛应用的方法之一。由于标记McAb核素量微，容器对其吸附作用有差异，标记本身对McAb活性有损伤，标记后要加无关蛋白保护，实验应用时常常还要多次稀释，因此要确切测定标记的McAb的含量有一定的难度。本文用标记McAb与靶抗原结合实验的放射性分析法，为标记单抗的定量提供一个方法。
材料和方法
一、实验材料
抗原为人小细胞肺癌细胞株NCI-H128，以含15%小牛血清的1640培养基培养，细胞呈悬浮状，取对数生长的细胞。抗此细胞的McAb2F7，为IgG2a型，由上海市肿瘤研究所提供，用proteinA-SepharoseCL4B亲和层析柱纯化，用Iodogen法标记131I，约37MBq/mgMcAb。
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二、标记McAb免疫活性测定
我们建立一种测定标记McAb免疫活性的方法[1]。基本原理是标记McAb与靶抗原保温处于平衡时，根据质量作用定律近似符合如下公式：T/B=1+1/(Ka.C)+T/C,T、B、C分别代表实验中总的和结合的标记McAb浓度及靶抗原浓度。Ka为亲和常数。当C浓度恒定，T与T/B近似呈直线关系，在T趋于无穷小时，由于C相对过量，有活性的标记McAb都应结合到靶抗原上。此时的B/T最大，代表标记McAb活性的保持程度。其值为上述直线在T/B轴上截距的倒数，可由直线回归分析计算出，见图1。在理想条件下，即标记McAb活性保持不变，此直线与T/B轴交点的T/B→1。通常标记McAb活性必定受损则T/B>1，B/T<1。实验的131I-2F7为50～1000ng/ml(反应的最终浓度，下同)。每个实验管中靶细胞数相同，为6×105/ml，反应体积为0.5ml，内含5%小牛血清PBS液。4℃旋转保温2小时，测各管计数率，即代表各管中加入的标记McAb浓度T。用5%小牛血清PBS液洗细胞2次，将未结合在细胞抗原上的游离的标记McAb洗去后再测计数率，即为各管中结合在细胞上的标记McAb浓度B。同时做封闭对照试验，方法同上，不同的是试管中多加50μg未标记的2F7竞争抑制标记McAb与细胞的结合。以封闭管的B/T为空白对照，通常它的B/T<0.02。
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图1 不同浓度131I-2F7McAb与恒定浓度抗原细胞结合实验
三、标记的McAb定量测定
上述公式中如T中标记的McAb浓度也保持不变，实验中再加入系列浓度的未标记McAb，则上述公式意义未变，T为标记和未标记的McAb的总和。因标记McAb浓度是恒定不变的，因此T/B与未标记McAb浓度仍呈近似直线关系。可以T/B对未标记McAb浓度作图，得一近似的直线，见图2。直线会与标记McAb免疫活性分数B/T值的倒数T/B值的直线相交。此交点反映了实验中加入标记及未标记McAb都是0，在图2横坐标中表现为负值，此点到T/B轴距离的绝对值，就是实验中加入标记McAb的实际浓度。实验靶细胞数2×105/每管，加入标记的McAb浓度相同以cpm计，平均为5816cpm，加入的未标记McAb分别为300，150，75，37.5，18.8，9.4，4.7，2.4，0ng。保温、测定等其他操作同上。
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图2 不同浓度的2F7加恒定浓度的131I-2F7McAb与恒定浓度抗原细胞结合实验
结果
一、标记McAb免疫活性测定管共做6个梯度，加131I-2F7的计数率分别为1698，4164，7614，12833，20075和34131cpm；测得的T/B值(已减去封闭管)分别为1.50，1.75，2.92，3.91，6.40和8.64。以T/B为纵轴，计数率为横轴作图得一近似直线，见图1。直线回归方程为T/B=1.09+2.3×10-4T，T以放射性计数率表示，相关系数为0.991,P<0.01，相关是极显著的。直线在纵轴的截距为1.09，其倒数为0.92。从而得出本试验131I-2F7活性保持在92%。
二、标记的McAb恒定量测定管中加入未标记McAb的量从300ng至0测得的B/T百分比分别是9.8，18.8，25.9，30.1，37.3，39.0，39.8，45.2，48.4；则T/B分别是10.20，5.32，3.86，3.32，2.68，2.56，2.51，2.21，2.07。以T/B为纵座标，加入未标记McAb量为横座标作图，得一近似直线，见图2。直线回归分析的相关系数γ=0.993,P<0.01，直线相关极显著。回归方程为T/B=2.16+0.0257x，x为McAb的ng数。由标记McAb免疫活性分析，得出本标记的免疫反应活性保持的程度为0.92，其倒数为1.09。所以上述直线与纵坐标值为1.09的直线相交，其交点到横坐标的距离绝对值，即为加入的标记McAb的含量，按上述回归方程计算含量平均为41.63ng，平均的cpm为5816，那当时标记的每ngMcAb为140cpm，放射性活度为21.7Bq。
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讨论
放射性核素标记化合物的定量一般按投入的化合物的量和标记率来计算化合物上的核素量。在标记McAb的实验中，按此定量误差很大。我们对比过这2种计算方法与本文介绍的方法比较可相差几倍。显然将极大影响定量的免疫研究结果。我们介绍的方法其特点是将标记的McAb表示为相当于多少未标记的McAb量。这是因为标记时，放射性核素对McAb除了有损伤破坏作用外，还可能对McAb进行了一定的修饰，改变了与抗原结合的某些特性，产生一定的变化。从这个角度讲，与未标记McAb是不等同的，尤其表现在免疫的某些特性上。
我们在放射性核素标记McAb的免疫活性的研究中，分析了抗原抗体反应近似存在T/B=1+1/(Ka.C)+T/C的反应平衡方程。我们对多种McAb进行了研究，证明实验中T/B与T确实存在着极显著的直线相关性。这和Lindmo提出的方程式一样，都可在测定标记的McAb活性方面得到很好应用[2，3]。标记McAb的活性和含量测定方法解决了，就可以计算出McAb的亲和常数及每个靶抗原细胞上可以结合McAb的最大容量等定量方法。进而开展抗原抗体的定量研究则可保证准确可靠。
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参考文献
1 苗积生，沈毅，吴吉勇.放射性核素标记单克隆抗体(McAb)免疫反应活性分数的测定.同位素，1996，9：85.
2 Lindmo T,Boven E,Cuttitta F,et al.Determination of the immunoreactive fractio n of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at in finite antigen excess.J Immuno Meth,1984,72:77.
3 苗积生，沈毅，吴吉勇，等.放射性核素标记的单克隆抗体免疫活性测定.中国实验临床 免疫学杂志，1991，3：13.
(收稿：1998-09-30 修回：1998-12-10), 百拇医药