糖尿病大鼠肾脏内皮素-1基因表达研究
作者：盛宏光 倪连松 吴万龄 杨裕国
单位：盛宏光(200031 上海市徐汇区中心医院)；倪连松、吴万龄、杨裕国(上海第二医科大学第九人民医院)
关键词：
上海医学990821 内皮素(ET)包括ET-1、ET-2、ET-3三种异构体。其中ET-1为迄今所知体内最强的缩血管多肽。人体内，首先由前内皮素原(preproET)经前内皮素剪切成39个残基组成的大内皮素，最后再经内皮素转化酶作用形成活性形式的内皮素[1～4]。已有研究表明，ET-1在糖尿病肾病的发生和发展中起着重要的作用。本研究检测了12周链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾皮质preproET-1的mRNA水平，并探讨其意义。
材料与方法
一、动物模型的建立
, 百拇医药
选择体重200～250g健康雄性Wistar大鼠20只，测血糖正常，尿糖阴性，随机取12只，禁食10小时后，以链脲佐菌素(STZ)50mg/kg体重一次性腹腔内注射，另取8只注射相当体积的柠檬酸缓冲液，作为对照组(NC组)。24小时后，用OneTouchⅡ血糖仪测定尾静脉全血血糖，当血糖≥13.8mmol/L时为糖尿病大鼠，作为糖尿病组(DM组)。自由进食进水，每2周测定血糖、体重、进水量、尿量、尿糖等指标，根据血糖和尿糖变化注射NovolinN2～4U。
二、总RNA的抽提
称取肾皮质100mg，在研钵中加液氮研碎后，采用异硫氰酸胍一步法制备总RNA。1.5%琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测RNA的完整性，28SrRNA、18SrRNA条带十分清晰，比值约为2∶1。紫外分光光度计(UV-1601Shimadzu)鉴定RNA的纯度及定量，所用RNA的A260/280均在1.7～2.0之间。
, 百拇医药 三、逆转录反应
取1μg总RNA加0.5μgOligo(dT)12～18后加DEPC水至12μl，70°C10分钟后置冰浴中5分钟，短暂离心。按以下次序加入试剂5×RTBuffer4μl,10mmol/LdNTP2μl,Rnasin(40U/ml)0.5μl,AMV(10U/μl)1.5μl。转弹管壁，短暂离心后42°C1小时。置冰浴后，保存于-20°C。所用试剂皆为Promega公司产品。
四、引物
preproET-1引物[1](美国赛百盛公司合成)：上游：5′-TCTTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT-3′；下游：5′-TCTTTTACGCCTTTCTG-CATGGTA-3′，扩增长度为407bp。β-actin引物[2](美国赛百盛公司合成)：上游：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′；下游：5′-CTCTTTGATGTCACGC-ACGATTTC-3′，扩增长度为540bp。
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五、PCR扩增
优化PCR扩增的Mg2+浓度及最佳循环数，使PCR扩增在对数期内进行。每个逆转录产物均分别进行preproET-1及β-actin扩增。最后的扩增条件为：ddH2O10.5μl，15mmol/LMgCl25.5μl,10×buffer2.5μl,2mmol/LNTP2.5μl,10μmol/L的上、下游引物各1μl，逆转录产物1μl。离心混匀后，加石蜡油20μl覆盖表面，97°C5分钟后加Taq酶1U，总反应体积为25μl。在DNA扩增仪(GeneAmpPCRsystem9600美国PE公司)上进行PCR扩增;94℃50秒，55℃40秒，72℃60秒，反应30个循环后72℃延伸7分钟。分别取preproET-1PCR产物10μl、β-actin5μl在1.2%琼脂糖中进行电泳，摄影后行灰度扫描。以preproET-1与β-actin的PCR产物DNA条带灰度值之比(preproET-1/β-actin)作为反映preproET-1的mRNA水平的相对指标。所用试剂皆为Promega公司产品。
, 百拇医药
六、统计学处理
方差齐性的同样本均数比较采用t检验；方差不齐的两样本均数比较则采用t′检验。设α-0.01，结果以
±s表示。
结果
一、Wistar大鼠血糖的改变
DM组大鼠各时点血糖均明显高于NC组(P<0.05)，且一直维持在较高水平，血糖值波动也较大，表明STZ诱导的糖尿病大鼠模型是成功的(表1)。
表1 糖尿病及正常对照组大鼠血糖的变化(±s)
血糖(mmol/L)
, 百拇医药
0周
2周
4周
6周
8周
10周
12周
NC
3.9±0.2
3.8±0.4
3.7±0.3
3.6±0.4
3.6±0.4
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3.6±0.4
4.2±0.2
DM
21.4±4.5*
21.2±2.9*
21.5±3.3*
21.0±2.1*
27.7±6.7*
24.0±6.5*
23.5±5.9*
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注：*与NC组比较P<0.05(t′检验) 二、RT-PCR检测肾皮质preproET-1的mRNA表达
糖尿病大鼠(n=8)肾皮质preproET-1与β-actinPCR产物的DENS(灰度×面积)比值(0.724±0.090)较正常组(n=8)(0.399±0.097)明显增高(P<0.01，t检验)，结果表明，糠尿病大鼠肾皮质preproET-1的mRNA表达较正常明显增强。
讨论
糖尿病时血浆或尿液中ET-1水平增高[3，4]。伴有慢性并发症者尤为明显。糖尿病时血浆ET-1水平的升高是内皮损伤的标志。Fukui[4]等报道4、12、24周STZ-糖尿病大鼠肾小球ET-1mRNA水平较正常明显升高，而胰岛素治疗则可部分缓解这一改变。本研究应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了12周STZ诱导的糖尿病大鼠肾皮质前内皮素原-1(preproET-1)的mRNA水平，结果发现，糖尿病大鼠肾皮质preproET-1的mRNA水平较正常明显增高，与Fukui等的报道一致。提示糖尿病时肾脏ET-1合成的增加可能参与糖尿病肾病的发生与发展。然而Shin等[5]却发现6周时随着肾小球滤过率的增高，STZ-糖尿病大鼠肾组织ET-1含量及mRNA水平较正常下降，胰岛素治疗则可部分缓解这一改变。这就与本实验结果相矛盾，其原因尚难以解释，可能与糖尿病病程不同有关。
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导致糖尿病时肾脏ET-1合成增加的因素可能是多方面的。曾有报道[6，7]TGF-β、TNF-α能促进培养的系膜细胞及肾小球毛细血管内皮细胞ET-1mRNA水平的增加。已有文献[8]证实糖尿病大鼠肾小球TGF-β、TNF-α、PDGF-B、bFGF的mRNA水平升高，因此糖尿病时肾组织生长因子合成的增加可能刺激了ET-1的合成。此外，还发现胰岛素能刺激培养的人内皮细胞合成及分泌内皮素[9]，而高胰岛素血症是2型糖尿病患者的特征之一；并且对1型糖尿病患者而言，过量的外源性胰岛素注射也可能会刺激肾脏ET-1的合成。Yamauchi等[10]还发现高葡萄糖浓度能刺激培养的猪主动脉内皮细胞ET-1的基因表达及释放。
ET-1作为一种内分泌或旁分泌激素，可引起肾脏血管的强烈收缩，减少肾血流量，降低肾小球滤过率。此外，ET-1还是一种促有丝分裂原，具有刺激血管平滑肌细胞、肾小球系膜细胞增生及促进胶原合成的作用。Nakamura等[11]曾观察到内皮素受体A拮抗剂FR139317治疗能显著降低24周糖尿病大鼠肾小球Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及lamininB1、B2的mRNA水平；并还能缓解释TGF-β、TNF-α、PDGF-B、bFGFmRNA水平的增高。
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综上所述，糖尿病时可能存在肾组织内皮素合成的增加，这一变化可能与糖尿病肾病的发生与发展密切相关。
参考文献
1 MoriseT,Takeuchi Y, Kawano, et al. Increased plasma levels of immuno reactive endothelin and von willebrand factor in NIDDM patients. Diabetes Care, 1995,18:87-89
2 Morabito E, Corsico N, Arrigoni ME, et al. Endothelins urinary excreti on is increased in spontaneously diabetic rats:BB/BB.Life Sci, 1994, 56:PL13-18 .
, 百拇医药
3 王乐伟，于志文，毛腾淑，等.糖尿病性肾病患者血浆内皮素水平的变化及其与 肾功能的关系.中华内科杂志,1995,34：318-321.
4 Fukui M, Nakamura T, Ebihara I, et al. Gene expression for endothelins and their receptors in glomeruli of diabetic rats. J Lab Clin Med, 1993,122:149 -156.
5 Shin SJ, Lee YJ, Lin SR, et al. Decrease of renal endothelin-1 conten t and gene expression in diabetic rats with moderate hyperglycemia. Nephron, 199 5,70:486-493.
, 百拇医药 6 Zoja C, Oiisio S, Perico N, et al. Constitutive expression of endothel in gene in cultured hurnan mesangial cells and its modulation by transforming gr owth factor-β、thrombin and a thromboxane A2 analogue. Lab Invest, 1991,64:16 -20.
7 Marsden P A, Brenner BM, Transcriptional regulation of the endothelin -1 gene by TNF-α. Am J Physiol, 1982,262:C854-861.
8 Nakamura T, Fukkui M, Ebihara I, et al. mRNA expression of growth fact ors in glomeruli from diabetic rats. Diabetes, 1993,42:450-456.
, http://www.100md.com
9 Ferri C, Piccoli A, Ptoperzi G, et al. Insulin induces endothelin-1 r elease from human cultured endothelial cells. J Hypertens, 1994 (suppl 3),12: s7 05.
10 Yamauchi T, Ohnaka K, Takayanagi R, et al. Enhanced secretion of endo thelin-1 by elevated glucose levels from cultured bovine aortic endothelial cel ls. FEBS Lett, 1990,267:16-18.
11 Nakamura T, Ebihara I, Fukui M, et al. Effect of a sepcific endotheli n receptor A antagonist on mRNA levels for extracellular matrix components and g rowth factors in diabetic glomeruli. Diabetes, 1995,44:895-899.
(收稿：1999-04-19，修回：1999-06-24), 百拇医药
单位：盛宏光(200031 上海市徐汇区中心医院)；倪连松、吴万龄、杨裕国(上海第二医科大学第九人民医院)
关键词：
上海医学990821 内皮素(ET)包括ET-1、ET-2、ET-3三种异构体。其中ET-1为迄今所知体内最强的缩血管多肽。人体内，首先由前内皮素原(preproET)经前内皮素剪切成39个残基组成的大内皮素，最后再经内皮素转化酶作用形成活性形式的内皮素[1～4]。已有研究表明，ET-1在糖尿病肾病的发生和发展中起着重要的作用。本研究检测了12周链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾皮质preproET-1的mRNA水平，并探讨其意义。
材料与方法
一、动物模型的建立
, 百拇医药
选择体重200～250g健康雄性Wistar大鼠20只，测血糖正常，尿糖阴性，随机取12只，禁食10小时后，以链脲佐菌素(STZ)50mg/kg体重一次性腹腔内注射，另取8只注射相当体积的柠檬酸缓冲液，作为对照组(NC组)。24小时后，用OneTouchⅡ血糖仪测定尾静脉全血血糖，当血糖≥13.8mmol/L时为糖尿病大鼠，作为糖尿病组(DM组)。自由进食进水，每2周测定血糖、体重、进水量、尿量、尿糖等指标，根据血糖和尿糖变化注射NovolinN2～4U。
二、总RNA的抽提
称取肾皮质100mg，在研钵中加液氮研碎后，采用异硫氰酸胍一步法制备总RNA。1.5%琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测RNA的完整性，28SrRNA、18SrRNA条带十分清晰，比值约为2∶1。紫外分光光度计(UV-1601Shimadzu)鉴定RNA的纯度及定量，所用RNA的A260/280均在1.7～2.0之间。
, 百拇医药 三、逆转录反应
取1μg总RNA加0.5μgOligo(dT)12～18后加DEPC水至12μl，70°C10分钟后置冰浴中5分钟，短暂离心。按以下次序加入试剂5×RTBuffer4μl,10mmol/LdNTP2μl,Rnasin(40U/ml)0.5μl,AMV(10U/μl)1.5μl。转弹管壁，短暂离心后42°C1小时。置冰浴后，保存于-20°C。所用试剂皆为Promega公司产品。
四、引物
preproET-1引物[1](美国赛百盛公司合成)：上游：5′-TCTTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT-3′；下游：5′-TCTTTTACGCCTTTCTG-CATGGTA-3′，扩增长度为407bp。β-actin引物[2](美国赛百盛公司合成)：上游：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′；下游：5′-CTCTTTGATGTCACGC-ACGATTTC-3′，扩增长度为540bp。
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五、PCR扩增
优化PCR扩增的Mg2+浓度及最佳循环数，使PCR扩增在对数期内进行。每个逆转录产物均分别进行preproET-1及β-actin扩增。最后的扩增条件为：ddH2O10.5μl，15mmol/LMgCl25.5μl,10×buffer2.5μl,2mmol/LNTP2.5μl,10μmol/L的上、下游引物各1μl，逆转录产物1μl。离心混匀后，加石蜡油20μl覆盖表面，97°C5分钟后加Taq酶1U，总反应体积为25μl。在DNA扩增仪(GeneAmpPCRsystem9600美国PE公司)上进行PCR扩增;94℃50秒，55℃40秒，72℃60秒，反应30个循环后72℃延伸7分钟。分别取preproET-1PCR产物10μl、β-actin5μl在1.2%琼脂糖中进行电泳，摄影后行灰度扫描。以preproET-1与β-actin的PCR产物DNA条带灰度值之比(preproET-1/β-actin)作为反映preproET-1的mRNA水平的相对指标。所用试剂皆为Promega公司产品。
, 百拇医药
六、统计学处理
方差齐性的同样本均数比较采用t检验；方差不齐的两样本均数比较则采用t′检验。设α-0.01，结果以
±s表示。结果
一、Wistar大鼠血糖的改变
DM组大鼠各时点血糖均明显高于NC组(P<0.05)，且一直维持在较高水平，血糖值波动也较大，表明STZ诱导的糖尿病大鼠模型是成功的(表1)。
表1 糖尿病及正常对照组大鼠血糖的变化(
±s)血糖(mmol/L)
, 百拇医药
0周
2周
4周
6周
8周
10周
12周
NC
3.9±0.2
3.8±0.4
3.7±0.3
3.6±0.4
3.6±0.4
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3.6±0.4
4.2±0.2
DM
21.4±4.5*
21.2±2.9*
21.5±3.3*
21.0±2.1*
27.7±6.7*
24.0±6.5*
23.5±5.9*
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注：*与NC组比较P<0.05(t′检验) 二、RT-PCR检测肾皮质preproET-1的mRNA表达
糖尿病大鼠(n=8)肾皮质preproET-1与β-actinPCR产物的DENS(灰度×面积)比值(0.724±0.090)较正常组(n=8)(0.399±0.097)明显增高(P<0.01，t检验)，结果表明，糠尿病大鼠肾皮质preproET-1的mRNA表达较正常明显增强。
讨论
糖尿病时血浆或尿液中ET-1水平增高[3，4]。伴有慢性并发症者尤为明显。糖尿病时血浆ET-1水平的升高是内皮损伤的标志。Fukui[4]等报道4、12、24周STZ-糖尿病大鼠肾小球ET-1mRNA水平较正常明显升高，而胰岛素治疗则可部分缓解这一改变。本研究应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了12周STZ诱导的糖尿病大鼠肾皮质前内皮素原-1(preproET-1)的mRNA水平，结果发现，糖尿病大鼠肾皮质preproET-1的mRNA水平较正常明显增高，与Fukui等的报道一致。提示糖尿病时肾脏ET-1合成的增加可能参与糖尿病肾病的发生与发展。然而Shin等[5]却发现6周时随着肾小球滤过率的增高，STZ-糖尿病大鼠肾组织ET-1含量及mRNA水平较正常下降，胰岛素治疗则可部分缓解这一改变。这就与本实验结果相矛盾，其原因尚难以解释，可能与糖尿病病程不同有关。
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导致糖尿病时肾脏ET-1合成增加的因素可能是多方面的。曾有报道[6，7]TGF-β、TNF-α能促进培养的系膜细胞及肾小球毛细血管内皮细胞ET-1mRNA水平的增加。已有文献[8]证实糖尿病大鼠肾小球TGF-β、TNF-α、PDGF-B、bFGF的mRNA水平升高，因此糖尿病时肾组织生长因子合成的增加可能刺激了ET-1的合成。此外，还发现胰岛素能刺激培养的人内皮细胞合成及分泌内皮素[9]，而高胰岛素血症是2型糖尿病患者的特征之一；并且对1型糖尿病患者而言，过量的外源性胰岛素注射也可能会刺激肾脏ET-1的合成。Yamauchi等[10]还发现高葡萄糖浓度能刺激培养的猪主动脉内皮细胞ET-1的基因表达及释放。
ET-1作为一种内分泌或旁分泌激素，可引起肾脏血管的强烈收缩，减少肾血流量，降低肾小球滤过率。此外，ET-1还是一种促有丝分裂原，具有刺激血管平滑肌细胞、肾小球系膜细胞增生及促进胶原合成的作用。Nakamura等[11]曾观察到内皮素受体A拮抗剂FR139317治疗能显著降低24周糖尿病大鼠肾小球Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及lamininB1、B2的mRNA水平；并还能缓解释TGF-β、TNF-α、PDGF-B、bFGFmRNA水平的增高。
, http://www.100md.com
综上所述，糖尿病时可能存在肾组织内皮素合成的增加，这一变化可能与糖尿病肾病的发生与发展密切相关。
参考文献
1 MoriseT,Takeuchi Y, Kawano, et al. Increased plasma levels of immuno reactive endothelin and von willebrand factor in NIDDM patients. Diabetes Care, 1995,18:87-89
2 Morabito E, Corsico N, Arrigoni ME, et al. Endothelins urinary excreti on is increased in spontaneously diabetic rats:BB/BB.Life Sci, 1994, 56:PL13-18 .
, 百拇医药
3 王乐伟，于志文，毛腾淑，等.糖尿病性肾病患者血浆内皮素水平的变化及其与 肾功能的关系.中华内科杂志,1995,34：318-321.
4 Fukui M, Nakamura T, Ebihara I, et al. Gene expression for endothelins and their receptors in glomeruli of diabetic rats. J Lab Clin Med, 1993,122:149 -156.
5 Shin SJ, Lee YJ, Lin SR, et al. Decrease of renal endothelin-1 conten t and gene expression in diabetic rats with moderate hyperglycemia. Nephron, 199 5,70:486-493.
, 百拇医药 6 Zoja C, Oiisio S, Perico N, et al. Constitutive expression of endothel in gene in cultured hurnan mesangial cells and its modulation by transforming gr owth factor-β、thrombin and a thromboxane A2 analogue. Lab Invest, 1991,64:16 -20.
7 Marsden P A, Brenner BM, Transcriptional regulation of the endothelin -1 gene by TNF-α. Am J Physiol, 1982,262:C854-861.
8 Nakamura T, Fukkui M, Ebihara I, et al. mRNA expression of growth fact ors in glomeruli from diabetic rats. Diabetes, 1993,42:450-456.
, http://www.100md.com
9 Ferri C, Piccoli A, Ptoperzi G, et al. Insulin induces endothelin-1 r elease from human cultured endothelial cells. J Hypertens, 1994 (suppl 3),12: s7 05.
10 Yamauchi T, Ohnaka K, Takayanagi R, et al. Enhanced secretion of endo thelin-1 by elevated glucose levels from cultured bovine aortic endothelial cel ls. FEBS Lett, 1990,267:16-18.
11 Nakamura T, Ebihara I, Fukui M, et al. Effect of a sepcific endotheli n receptor A antagonist on mRNA levels for extracellular matrix components and g rowth factors in diabetic glomeruli. Diabetes, 1995,44:895-899.
(收稿：1999-04-19，修回：1999-06-24), 百拇医药