抗疲劳1号对培养大鼠皮质神经细胞的抗损伤作用
作者：王健春 祝世功 侯忠赤 李天舒 刘潇 贺伟
单位：王健春 祝世功 李天舒 刘潇(白求恩医科大学 长春 130021)；侯忠赤(河北省保定市252医院)；贺伟(长春市职工医科大学)
关键词：神经细胞培养；抗疲劳1号；DNA；LDH；自由基
现代康复990818
摘要 目的：探讨抗疲劳1号(AF-1)对培养大鼠皮质神经细胞损伤的保护作用及机制。方法：应用谷氨酸诱导培养大鼠皮层神经细胞损伤的模型。通过测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、DNA断裂率、超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO)，观察AF-1药物的保护作用。结果：高浓度的谷氨酸可增加培养神经细胞的LDH释放率和DNA断裂率，并诱导自由基产生。AF-1明显降低谷氨酸的神经细胞毒性，使LDH释放率及DNA断裂率明显降低，LPO含量明显下降，SOD含量明显升高。结论：AF-1对大鼠皮层神经细胞损伤具有明显的保护作用。
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Protection of Antifatigue-1(AF-1)Against the Damage of Culture Cortical Neuron in Rats
Wang Jianchun ,Zhu Shigong,Hou Zhongchi,et al.
Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021.
Abstract Objective:To study the protection and mechanism of AF-1 against the damage of cultured rat cortical neuron.Methods:The damage of cultured cortical neuron was made with glutamate in rats .The protection of AF-1 was observed with the measurement of transudatory rate of LDH ,the breaking rate of DNA and contents of LPO and SOD,Results:The intotoxincation of glutamate was decreased by AF-1 which reduced the transudatory rate of LDH,the breaking rate of DNA and the content of LPO,and increased the content of SOD in culture significantly.Conclusion:AF-1 can obviously protect the cultured cortical neuron against damage in rats.
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Key words Neuronal culture AF-1 DNA LDH Free radical
近年来大量研究表明兴奋性氨基酸及其受体与自由基和能量代谢等具有密切关系,并参与某些中枢神经系统疾病的发病学。抗疲劳1号是本室研制的中草药制剂。前期动物实验表明[1,2]，抗疲劳1号能明显提高动物的耐缺氧能力和促进ATP生成，减少乳酸生成和自由基的产生。本实验采用大鼠皮层神经细胞谷氨酸损伤模型，从细胞水平研究抗疲劳1号对培养大鼠皮质神经细胞的抗损伤作用。
1 材料与方法
1.1 材料 抗疲劳1号由本室制备，由雄蚕蛾、红景天、西洋参等十余味中药经蒸馏、回流、提取浓缩等工艺制成，相当于1.45g/ml生药药液。DMEM培养基，HEPES(Gibco公司)。LPO，SOD检测试剂盒(长春汇力生物工程技术开发中心)，其他试剂均为国产分析纯。
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1.2 皮层神经细胞原代培养药物处理 参照Choi[3]等人的方法略加改动。取新生0～1d大鼠断头处死取出大脑皮层，置于0.25%胰蛋白酶消化液中剪碎，36℃水浴30min；然后离心500r/min，5min；弃上清，加入培养液反复吹打，200目尼龙网过滤后计数，将细胞浓度调为1.5×106/ml，接种于铺鼠尾胶的培养瓶中，每瓶15ml。置37℃体积分数为0.05的CO2孵箱中培养48h，全量换液并加入5μmol/L阿糖胞苷以抑制非神经元的增殖，此后每2d半量换液一次。培养基成分为DMEM培养基中添加谷氨酰胺5mmol/L，HEPES10mmol/L，NaHCO32.2g/L,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml,并加入10%小牛血清和胰岛素100U/L。继续培养10d,吸出培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hank's液漂洗2次，加入无血清培养液含有不同浓度谷氨酸(0.01mmol/L,0.05mmol/L,0.5mmol/L),每组六瓶，作用10min，然后吸出上清后，用Hank’s液漂洗2次，加入5%的小牛血清DMEM培养液，放入CO2孵箱中孵育24h，收集上清液测定LDH释放率，收集细胞进行DNA断裂率测定。
, 百拇医药
AF-1预处理组细胞先加入含AF-1(1.45μg/ml,0.725μg/ml,0.145μg/ml)的无血清KMEM培养液，作用20min，再加入含500μmol/L的谷氨酸的无血清DMEM培养液作用10min,用hank's液漂洗2次，加入5%的小牛血清DMEM培养液，放入CO2孵箱中孵育24h,收集上清液测定LDH的漏出率，细胞经收集后用于测定LPO，SOD，DNA断裂裂率。
1.3 观察指标及测定 参照Koh等人的方法进行LDH漏出率的测定[4]，泄漏率=上清中LDH/(上清中LDH+冻融后LDH)；参照Illera等人的方法进行片段化DNA定量检测[5]。LPO，SOD的检测按试剂盒说明书进行，LPO的含量以样品的TBA吸光度(A)表示。采用ANOVA和t检验进行统计学处理，结果以
±s表示。
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2 结果
2.1 谷氨酸对培养鼠皮质神经细胞的损伤作用 从表1可以看出，高浓度谷氨酸对培养神经细胞具有明显的损伤作用，作用3个剂量的谷氨酸可使培养神经细胞的LDH漏出率明显高于对照组(P<0.05和P<0.001)；其DNA断裂率也明显高于对照组(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。随谷氨酸浓度的增加，神经细胞损伤呈加重趋势。
表1 不同浓度的谷氨酸对大鼠皮层神经元LDH、DNA断裂率的影响(±s) 浓度
n
LDH漏出率(%)
DNA断裂率(%)
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对照
6
42.55±2.637
44.41±2.54
GLU0.01mmol/L
6
646.68±2.044*
48.21±2.41*
GLU0.05mmol/L
6
47.94±1.310*
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49.64±3.24*
GLU0.5mmol/L
6
49.51±1.260**
52.67±3.42**
*P<0.05；**P<0.001与对照组相比
2.2 抗疲劳1号对培养皮层细胞LPO，SOD的影响 从表2可看出，单纯抗疲劳1号组的神经细胞悬液中LPO和SOD含量与对照组比较无显著差异(P>0.05)，而谷氨酸损伤组LPO含量明显升高，SOD的含量显著下降，与对照组比较差异非常显著(P<0.01)。加入抗疲劳1号(1.45μg/L和0.725μg/L)的培养细胞LPO含量明显低于谷氨酸损伤组，SOD的含量则明显增加(P<0.01)。低剂量抗疲劳1号(0.145μg/L)作用不明显(P>0.05)。
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表2 抗疲劳1号对皮层神经细胞LPO、SOD、LDH漏出率和DNA断裂率的影响(± s) 浓度
n
LPO(A/m)
SOD(U/L)
LDH(%)
DNA(%)
对照
6
0.70± 0.035
1 010.31± 11.347
, 百拇医药
38.0± 5.60
40.39± 3.38
GLU
6
0.79± 0.031＃
972.25± 11.296＃
49.2± 2.301＃
52.22± 4.42＃
AF-1
6
0.71± 0.026
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1 012.63± 12.364
38.9± 3.40
41.34± 3.25
GLU+AF-1(1)
6
0.71± 0.035
1 002.45± 13.934
39.5± 4.40
42.24± 3.80
GLU+AF-1(2)
6
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0.75± 0.032
998.35± 12.365
39.1± 6.10
44.33± 3.16
GLU+AF-1(3)
6
0.78± 0.041
980.15± 13.254
39.9± 5.77
50.99± 4.74
＃P<0.001与对照组相比P<0.01 P<0.001与谷氨酸损伤组相比
, 百拇医药
2.3 抗疲劳1号对培养皮层细胞LDH漏出率和DNA断裂率的影响 表2结果显示，单纯AF-1培养组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。谷氨酸损伤组LDH漏出率和DNA断裂率均明显高于对照组(P<0.01)，3个剂量AF-1均使LDH释放率显著下降，与损伤组比较差异显著(P<0.01)，其中两个高剂量AF-1组的DNA断裂率也较损伤组明显降低(P<0.01)，低剂量AF-1的作用不明显。
3 讨论
众所周知，谷氨酸作为兴奋性氨基酸不仅参与神经细胞的某些重要生理生化功能，还具有神经毒性，大量研究表明，谷氨酸的神经毒性在脑缺血缺氧性疾病、神经元退行性变等疾病发病学中具有重要作用[6]。兴奋性氨基酸的过度释放，可引受体门控钙通道开放，细胞外Ca2+进入细胞内，促进细胞内钙超负荷发生，干扰线粒体的氧化磷酸化过程，导致细胞的能量代谢障碍ATP生成减少，同时导致自由基的生成增加和超氧化物歧化酶(SOD)等自由基清除剂减少。自由基通过其对脂膜的过氧化作用，引起细胞膜及亚细胞结构损伤，及至DNA损伤。本研究结果也表明随谷氨酸浓度的升高，皮质神经元的脂质过氧化物增多，SOD含量减少，DNA断裂率增多，LDH的漏出率明显升高，有力说明不同浓度谷氨酸对培养神经元具有明显的损伤作用，与文献报道一致。因此预防和降低谷氨酸过量释放将成为保护神经元损伤的重要环节。抗疲劳1号是我室研制的中草药制剂，在整体大鼠实验已证明，其具有抗缺氧，抗缺血，抗氧化，抗自由基的作用[2、7]。为了在细胞水平上进一步研究抗疲劳1号的神经细胞保护作用，本实验利用谷氨酸复制培养大鼠皮质神经细胞损伤模型，进一步研究了抗疲劳1号的保护作用。结果表明抗疲劳1号可显著降低谷氨酸损伤神经细胞的LDH释放率，同时明显减轻了谷氨酸引起的神经细胞DNA断裂程度。说明抗疲劳1号可在DNA水平和细胞水平保护谷氨酸引起的神经细胞损伤。另外用药保护组的LPO减少，SOD回升，进一步说明抗疲劳1号具有很强的抗自由基生成和加速自由基清除作用。进而阻止了由自由基引发的脂质过氧化链锁式损伤反应，防止了细胞内Ca2+超负荷的发生。进而稳定细胞膜、线粒体及溶酶体等的结构，加强了神经细胞的抗损伤能力。其细胞的分子机制有待进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
1 郭中钰,祝世功.抗疲劳1号对游泳大鼠血液、肌肉和脑中ATP含量及血乳酸含量的影响.中国病理生理杂志，1998，14(2)：385
2 郭中钰,计国义，王健春.抗疲劳1号抗自由基损伤作用的研究.白求恩医科大学学报，1998，24(2)：127
3 Koh JY,Choi DW. Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J Neurosci Method,1987,7:357
4 Koh JY,Choi DW.Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J Neurosci Method,1987,20(1)： 83
, 百拇医药
5 Illera VA,Perandones CE,Stunz LL,et al.Apoptosis in splenic B lymphocytes :Regulation by protein kinase C and IL-4.J Immunol,1993,151:2 965
6 母敬郁，熊文，杨世杰,等.自由基介导兴奋性氨基酸对培养皮层神经细胞毒性的研究.中风与神经疾病杂志，1996，13(1)：2
7 郭中钰，计国义.抗疲劳1号抗大鼠低张性缺氧机理实验研究.白求恩医科大学学报，1998，24(3)：248
收稿日期：1999-04-16, 百拇医药
单位：王健春 祝世功 李天舒 刘潇(白求恩医科大学 长春 130021)；侯忠赤(河北省保定市252医院)；贺伟(长春市职工医科大学)
关键词：神经细胞培养；抗疲劳1号；DNA；LDH；自由基
现代康复990818
摘要 目的：探讨抗疲劳1号(AF-1)对培养大鼠皮质神经细胞损伤的保护作用及机制。方法：应用谷氨酸诱导培养大鼠皮层神经细胞损伤的模型。通过测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、DNA断裂率、超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO)，观察AF-1药物的保护作用。结果：高浓度的谷氨酸可增加培养神经细胞的LDH释放率和DNA断裂率，并诱导自由基产生。AF-1明显降低谷氨酸的神经细胞毒性，使LDH释放率及DNA断裂率明显降低，LPO含量明显下降，SOD含量明显升高。结论：AF-1对大鼠皮层神经细胞损伤具有明显的保护作用。
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Protection of Antifatigue-1(AF-1)Against the Damage of Culture Cortical Neuron in Rats
Wang Jianchun ,Zhu Shigong,Hou Zhongchi,et al.
Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021.
Abstract Objective:To study the protection and mechanism of AF-1 against the damage of cultured rat cortical neuron.Methods:The damage of cultured cortical neuron was made with glutamate in rats .The protection of AF-1 was observed with the measurement of transudatory rate of LDH ,the breaking rate of DNA and contents of LPO and SOD,Results:The intotoxincation of glutamate was decreased by AF-1 which reduced the transudatory rate of LDH,the breaking rate of DNA and the content of LPO,and increased the content of SOD in culture significantly.Conclusion:AF-1 can obviously protect the cultured cortical neuron against damage in rats.
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Key words Neuronal culture AF-1 DNA LDH Free radical
近年来大量研究表明兴奋性氨基酸及其受体与自由基和能量代谢等具有密切关系,并参与某些中枢神经系统疾病的发病学。抗疲劳1号是本室研制的中草药制剂。前期动物实验表明[1,2]，抗疲劳1号能明显提高动物的耐缺氧能力和促进ATP生成，减少乳酸生成和自由基的产生。本实验采用大鼠皮层神经细胞谷氨酸损伤模型，从细胞水平研究抗疲劳1号对培养大鼠皮质神经细胞的抗损伤作用。
1 材料与方法
1.1 材料 抗疲劳1号由本室制备，由雄蚕蛾、红景天、西洋参等十余味中药经蒸馏、回流、提取浓缩等工艺制成，相当于1.45g/ml生药药液。DMEM培养基，HEPES(Gibco公司)。LPO，SOD检测试剂盒(长春汇力生物工程技术开发中心)，其他试剂均为国产分析纯。
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1.2 皮层神经细胞原代培养药物处理 参照Choi[3]等人的方法略加改动。取新生0～1d大鼠断头处死取出大脑皮层，置于0.25%胰蛋白酶消化液中剪碎，36℃水浴30min；然后离心500r/min，5min；弃上清，加入培养液反复吹打，200目尼龙网过滤后计数，将细胞浓度调为1.5×106/ml，接种于铺鼠尾胶的培养瓶中，每瓶15ml。置37℃体积分数为0.05的CO2孵箱中培养48h，全量换液并加入5μmol/L阿糖胞苷以抑制非神经元的增殖，此后每2d半量换液一次。培养基成分为DMEM培养基中添加谷氨酰胺5mmol/L，HEPES10mmol/L，NaHCO32.2g/L,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml,并加入10%小牛血清和胰岛素100U/L。继续培养10d,吸出培养液，用无Ca2+、Mg2+的Hank's液漂洗2次，加入无血清培养液含有不同浓度谷氨酸(0.01mmol/L,0.05mmol/L,0.5mmol/L),每组六瓶，作用10min，然后吸出上清后，用Hank’s液漂洗2次，加入5%的小牛血清DMEM培养液，放入CO2孵箱中孵育24h，收集上清液测定LDH释放率，收集细胞进行DNA断裂率测定。
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AF-1预处理组细胞先加入含AF-1(1.45μg/ml,0.725μg/ml,0.145μg/ml)的无血清KMEM培养液，作用20min，再加入含500μmol/L的谷氨酸的无血清DMEM培养液作用10min,用hank's液漂洗2次，加入5%的小牛血清DMEM培养液，放入CO2孵箱中孵育24h,收集上清液测定LDH的漏出率，细胞经收集后用于测定LPO，SOD，DNA断裂裂率。
1.3 观察指标及测定 参照Koh等人的方法进行LDH漏出率的测定[4]，泄漏率=上清中LDH/(上清中LDH+冻融后LDH)；参照Illera等人的方法进行片段化DNA定量检测[5]。LPO，SOD的检测按试剂盒说明书进行，LPO的含量以样品的TBA吸光度(A)表示。采用ANOVA和t检验进行统计学处理，结果以
±s表示。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 谷氨酸对培养鼠皮质神经细胞的损伤作用 从表1可以看出，高浓度谷氨酸对培养神经细胞具有明显的损伤作用，作用3个剂量的谷氨酸可使培养神经细胞的LDH漏出率明显高于对照组(P<0.05和P<0.001)；其DNA断裂率也明显高于对照组(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。随谷氨酸浓度的增加，神经细胞损伤呈加重趋势。
表1 不同浓度的谷氨酸对大鼠皮层神经元LDH、DNA断裂率的影响(
±s) 浓度n
LDH漏出率(%)
DNA断裂率(%)
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对照
6
42.55±2.637
44.41±2.54
GLU0.01mmol/L
6
646.68±2.044*
48.21±2.41*
GLU0.05mmol/L
6
47.94±1.310*
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49.64±3.24*
GLU0.5mmol/L
6
49.51±1.260**
52.67±3.42**
*P<0.05；**P<0.001与对照组相比
2.2 抗疲劳1号对培养皮层细胞LPO，SOD的影响 从表2可看出，单纯抗疲劳1号组的神经细胞悬液中LPO和SOD含量与对照组比较无显著差异(P>0.05)，而谷氨酸损伤组LPO含量明显升高，SOD的含量显著下降，与对照组比较差异非常显著(P<0.01)。加入抗疲劳1号(1.45μg/L和0.725μg/L)的培养细胞LPO含量明显低于谷氨酸损伤组，SOD的含量则明显增加(P<0.01)。低剂量抗疲劳1号(0.145μg/L)作用不明显(P>0.05)。
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表2 抗疲劳1号对皮层神经细胞LPO、SOD、LDH漏出率和DNA断裂率的影响(
± s) 浓度n
LPO(A/m)
SOD(U/L)
LDH(%)
DNA(%)
对照
6
0.70± 0.035
1 010.31± 11.347
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38.0± 5.60
40.39± 3.38
GLU
6
0.79± 0.031＃
972.25± 11.296＃
49.2± 2.301＃
52.22± 4.42＃
AF-1
6
0.71± 0.026
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1 012.63± 12.364
38.9± 3.40
41.34± 3.25
GLU+AF-1(1)
6
0.71± 0.035
1 002.45± 13.934
39.5± 4.40
42.24± 3.80
GLU+AF-1(2)
6
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0.75± 0.032
998.35± 12.365
39.1± 6.10
44.33± 3.16
GLU+AF-1(3)
6
0.78± 0.041
980.15± 13.254
39.9± 5.77
50.99± 4.74
＃P<0.001与对照组相比P<0.01 P<0.001与谷氨酸损伤组相比
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2.3 抗疲劳1号对培养皮层细胞LDH漏出率和DNA断裂率的影响 表2结果显示，单纯AF-1培养组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。谷氨酸损伤组LDH漏出率和DNA断裂率均明显高于对照组(P<0.01)，3个剂量AF-1均使LDH释放率显著下降，与损伤组比较差异显著(P<0.01)，其中两个高剂量AF-1组的DNA断裂率也较损伤组明显降低(P<0.01)，低剂量AF-1的作用不明显。
3 讨论
众所周知，谷氨酸作为兴奋性氨基酸不仅参与神经细胞的某些重要生理生化功能，还具有神经毒性，大量研究表明，谷氨酸的神经毒性在脑缺血缺氧性疾病、神经元退行性变等疾病发病学中具有重要作用[6]。兴奋性氨基酸的过度释放，可引受体门控钙通道开放，细胞外Ca2+进入细胞内，促进细胞内钙超负荷发生，干扰线粒体的氧化磷酸化过程，导致细胞的能量代谢障碍ATP生成减少，同时导致自由基的生成增加和超氧化物歧化酶(SOD)等自由基清除剂减少。自由基通过其对脂膜的过氧化作用，引起细胞膜及亚细胞结构损伤，及至DNA损伤。本研究结果也表明随谷氨酸浓度的升高，皮质神经元的脂质过氧化物增多，SOD含量减少，DNA断裂率增多，LDH的漏出率明显升高，有力说明不同浓度谷氨酸对培养神经元具有明显的损伤作用，与文献报道一致。因此预防和降低谷氨酸过量释放将成为保护神经元损伤的重要环节。抗疲劳1号是我室研制的中草药制剂，在整体大鼠实验已证明，其具有抗缺氧，抗缺血，抗氧化，抗自由基的作用[2、7]。为了在细胞水平上进一步研究抗疲劳1号的神经细胞保护作用，本实验利用谷氨酸复制培养大鼠皮质神经细胞损伤模型，进一步研究了抗疲劳1号的保护作用。结果表明抗疲劳1号可显著降低谷氨酸损伤神经细胞的LDH释放率，同时明显减轻了谷氨酸引起的神经细胞DNA断裂程度。说明抗疲劳1号可在DNA水平和细胞水平保护谷氨酸引起的神经细胞损伤。另外用药保护组的LPO减少，SOD回升，进一步说明抗疲劳1号具有很强的抗自由基生成和加速自由基清除作用。进而阻止了由自由基引发的脂质过氧化链锁式损伤反应，防止了细胞内Ca2+超负荷的发生。进而稳定细胞膜、线粒体及溶酶体等的结构，加强了神经细胞的抗损伤能力。其细胞的分子机制有待进一步研究。
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参考文献
1 郭中钰,祝世功.抗疲劳1号对游泳大鼠血液、肌肉和脑中ATP含量及血乳酸含量的影响.中国病理生理杂志，1998，14(2)：385
2 郭中钰,计国义，王健春.抗疲劳1号抗自由基损伤作用的研究.白求恩医科大学学报，1998，24(2)：127
3 Koh JY,Choi DW. Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J Neurosci Method,1987,7:357
4 Koh JY,Choi DW.Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay.J Neurosci Method,1987,20(1)： 83
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5 Illera VA,Perandones CE,Stunz LL,et al.Apoptosis in splenic B lymphocytes :Regulation by protein kinase C and IL-4.J Immunol,1993,151:2 965
6 母敬郁，熊文，杨世杰,等.自由基介导兴奋性氨基酸对培养皮层神经细胞毒性的研究.中风与神经疾病杂志，1996，13(1)：2
7 郭中钰，计国义.抗疲劳1号抗大鼠低张性缺氧机理实验研究.白求恩医科大学学报，1998，24(3)：248
收稿日期：1999-04-16, 百拇医药