心肌sMiMi-CK基因蛋白质对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响
作者：李 芳 刘 辉 关振中
单位：
李 芳 解放军211医院，150080；刘 辉 北安市第一人民医院；关振中 哈尔滨医科大学附属第二医院
关键词：sMiMi-CK蛋白；心肌缺血/再灌注；超微结构；能量代谢；羟自由基
摘要摘要：目的 本实验拟观察sMiMi-CK基因表达产物对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。方法 提取纯化sMiMi-CK基因蛋白质，建立大鼠离体心肌缺血/再灌注模型，以心肌超微结构的改变、能量代谢、自由基为指标观察其保护作用。结果 sMiMi-CK蛋白能明显保护缺血心肌超微结构，减轻线粒体内钙超载，明显提高ATP、ADP、AMP水平，减少羟自由基的生成。结论 sMiMi-CK蛋白对缺血/再灌注的大鼠心肌细胞具有明显的保护作用，从而为缺血性心脏病的基因治疗提供理论和实践基础。
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Effect of myocardial sMiMi-CK protein on ischemia/reperfusion in rats
LI Fang, LIU Hui，GUAN Zhen-zhong.
Chinese PLA 211 Hospital,Harbin 150080
Abstract Objective The present experiment was designed to study sMiMi-CK protein effects on the ischemia and reperfusion injury in rats .Methods Extracting and purificating sMiMi-CK protein and using ischemia / reperfusion injury model in vitro ,we studied the protective effects of sMiMi-CK protein on ultrastructive ,contents of high-energy prosphates and hydro free redical. Results sMiMi-CK showed significantly protective effects on ischemia myocardial ultrastructure ,reduced calcium overload and DHBAs formed, increased ATP,ADP,AMP levels in rat hearts.Conclusions sMiMi-CK protein had significantly protection to the myocardial ischemia /reperfusionin in rats.
, 百拇医药
Key words sMiMi-CK protein Ischemia/reperfusion Ultrastructive Contents of high -energy prosphates DHBAs
近年来心肌缺血/再灌注损伤的研究已深入到分子基因水平，对其治疗人们也尝试着进行基因治疗。目前已确认[1]心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因(sMiMi-CK)与能量代谢密切相关，而且在缺血/再灌注损伤的保护作用，从而为缺血性疾病的基因治疗提供实践依据。
1 资料与方法
1.1 资料 ①仪器：超薄切片机Olypus公司，H-600型透射电子显微镜，高效液相色谱仪(HPLC)，色谱柱：英国产Licrosorbc-18由中国科学院大连化学物理研究所色谱中心装柱。②试剂：2%锇酸(日本)，包埋剂Epon812，ATP、ADP、AMP、PCr、Cr辅酶Ⅰ(NAD)、次黄嘌呤(HYPO)均由美国SIGMA公司提供。
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1.2 方法
1.2.1 ①动物模型的制备 采用Langendorff无作功非循环式离体心脏灌流法制备心肌缺血/再灌注模型，灌流液为Krebs-Henseleit缓冲液。取2%戊巴比妥钠和0.25%肝素各按2 ml/kg体重腹腔注射，待动物麻醉后，迅速开胸，暴露心脏。在距主动脉起始部3～4 mm外剪下心脏，主即放入盛有冷灌流液(0～4℃)的平皿内，用冷灌流液冲掉残留在冠状血管内的血液，将心脏迅速移至Langendorff灌流装置上，灌流压力为90 cmH2O，平衡30 min 后，采用旷置法模拟全心缺血过程，打开旋塞恢复血流即再灌注，各实验组结束后，超微结构组将一部分心脏取下，放入2%戊二醛中，其它组将心脏迅速放入液氮中保存。
1.2.2 实验分组 正常对照组、缺血40分钟组，缺血40分钟+再灌20分钟组、缺血40分+ sMiMi-CK蛋白组，缺血40分钟+再灌20分钟+sMiMi-CK蛋白组，sMiMi-CK保护组是在灌流液中加入sMiMi-CK，使其浓度为10-2M。
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1.2.3 检测指标 a.超微结构观察 固定：用2%焦锑酸钾—1%锇酸水溶液固定2小时，冲洗用2%的焦锑酸钾溶液(pH 9.4)冲洗3次，常规脱水、浸透包埋及制作。b.能量代谢变化的观察 标准品的组成：1.34 mmol/L Cr、0.393 mmol/L Pcr、0.808 mmol/L HYPO、0.603 mmol/L NAD、0.349 mmol/L AMP、0.206 mmol/L ADP、0.430 mmol/L ATP，取10 ml标准品，注入HPLC。取液氮冷冻的心肌组织，匀浆3分钟，然后用超声波将线粒体膜打碎，再加1 M的KOH 0.70 ml，混匀，高速冷冻离心5 000 rpm 10分钟，取上清过滤、上柱。c羟自由基的测定 流动相组成：80% 0.03 M柠檬酸、0.03 M醋酸、20%甲醇、pH 3.6。剪取心肌200 mg，用 0.42 M HQO4 别成匀浆，再用1 M KOH中和，6 000 g离心15 min，取上清液1 ml置于10 ml试管内，加入40 μl 100 μl的2，4-DHBA作为内标，同时加入50 μl 1 N盐酸，10 ml乙醚，充分混匀120 S，静止分层，将乙醚层移到另一试管，置45℃水浴中，使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50 μl 1 N盐酸和32.5 μl流动相，将试管壁上结晶彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后，取30 μl此液注入HPLC进行分析。
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1.3 统计学处理 采用
±s表示，组间差异采用t检验，P<0.05显著性差异，P<0.01作为极显著差异。
2 结果
2.1 超微结构的变化 缺血40分钟时，肌浆水肿部分肌节破坏，核染色质周边化，线粒体肿胀，再灌注后其改变加重，肌膜损伤严重，线粒体极度肿胀，嵴断裂，空泡化，甚至破裂，其内有大量钙离子沉积。缺血40分钟及再灌注20分钟前加入sMiMi-CK蛋白，可使心肌细胞的结构明显改善，表现为肌膜完整，线粒体膜较完整，嵴无破裂，钙沉积明显减少。见图1、2、3、4。
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图1 缺血40分钟(2万倍) 图2 缺血40分钟组+sMiMi-CK蛋白组(2万倍)
图3 缺血40分钟组+再灌20分钟组(2万倍)
图4 缺血40分钟组+再灌20分钟组+sMiMi-CK蛋白组(2万倍)
2.2 ATP、ADP、AMP、AN、PCr变化。随着缺血时间的延长，ATP、ADP、AMP、AN及PCr逐渐减少，各组与正常组比较P<0.01，缺血40分钟+再灌20分钟组减少最明显，加入sMiMi-CK蛋白后，ATP、ADP、AMP、AN较相应的缺血组及再灌注组都有所回升，但PCr则不同，Ⅰ40+sMiMi-CK组与Ⅰ40组及Ⅰ40 R+sMiMi-CK组与Ⅰ40 R 组比较，PCr明显减少，P<0.01。见表1。
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表1 缺血再灌注时高能磷酸物的变化及sMiMi-CK蛋白的保护作用(±s)
分 组
例数
ATP
ADP
AMP
PCr
正常组
7
20.3±1.33
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4.74±0.09
4.08±0.28
21.30±0.03
缺血40分钟组
7
6.95±0.99*#
3.42±0.09*#
2.59±0.03*#
3.63±0.07*#
缺血40分钟+再灌20分钟组
7
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1.44±0.05*△#
2.66±0.08*△#
1.39±0.02*△#
1.73±0.14*△#
缺血40分钟+sMiMi-CK 组
7
9.70±0.16
4.45±0.10*
3.62±0.07*
2.45±0.97*
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缺血40分钟+再灌20分钟+sMiMi-CK 组
7
6.85±0.34
4.82±0.24*△
4.52±0.04*△
0.52±0.46*△
*与正常组比较 P<0.01 △与缺血组比较 P<0.01
#与相应的sMiMi-CK组比较P<0.01
2.3 羟自由基的变化 心肌样品的DHBA提示，随着缺血时间延长，DHBA增加，再灌注后增加更明显。sMiMi-CK蛋白能量显著减少DHBA的量，与相应组比较P<0.01，见表2。
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表2 缺血再灌注时DHBA的变化及sMiMi-CK
蛋白的保护作用(nM/g)(±s)
分组
例数
2，5-DHBA
2，3-DHBA
正常组
7
0.393±0.007
0.232±0.008
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缺血40分钟组
7
2.860±0.06*#
2.620±0.049*#
缺血40分钟+再灌20分钟组
7
6.866±0.098*△#
4.038±0.147*△#
缺血40分钟+ sMiMi-CK 组
7
1.142±0.032*
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1.025±0.052*
缺血40分钟+再灌20分钟+sMiMi-CK组
7
2.452±0.46*△
1.985±0.072*△
*与正常组比较P<0.01 △与缺血组比较P<0.01
#与相应的sMiMi-CK组比较P<0.01
3 讨论
基因治疗是近几年刚刚起步、比较吸引人的课题，作为一种生物制剂应用外源重组sMiMi-CK基因或其表达产物作用到人体，治疗相应的能量代谢障碍性疾病以及提高肌肉对缺氧的耐受性，打破以往治疗常规，将是很有前途的方法。
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实验表明sMiMi-CK基因表达蛋白质，能明显减轻细胞内钙超载，改善缺血心肌的超微结构变化，保护心肌线粒体。同时，sMiMi-CK蛋白能使ATP、ADP、AMP在缺血及再灌注时明显回升，从而改善机体的能量急需，避免氧化磷酸化脱偶联，改善电子传递及质子泵出的初速度，增强H+—ATP酶合成活性[3]。另外，sMiMi-CK蛋白还可通过改善Ca2+离子代谢来阻断黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶这一过程，使得再灌注OH生成明显减少，减轻心肌损伤[4]。
再灌注损伤发生的始动环节是能量代谢障碍，而直接损伤因素则是自由基，其结果导致细胞内钙超载。因此，要想阻止缺血再灌注损伤的发生，必须从改善心肌能量代谢障碍入手，其它问题则迎刃而解。sMiMi-CK蛋白作为一种廉价生物制品，恰能有效地提高机体ATP水平，改善线粒体内氧化磷酸化过程，减少自由基的生成，减轻肌膜损害，同时能够明显改善钙超载，避免心肌发生挛缩和心律失常。如能将sMiMi-CK基因的重组载体转染导入细胞内，可望在心肌缺血性及能量代谢性疾病的治疗方面开创一个基因治疗的新领域，将具有重要意义。
, 百拇医药
本课题系黑龙江省自然科学基金资助项目(D09613)
参考文献
[1]Jorg S,Beat ZW ,et al .Native mitochondrial creatine kinase forms octamaeric strucure .J Biological Chemistry ,1998,263(32):16942-16853.
[2]李芳，李守岩，凌虹，等.急性缺血/再灌注时心肌 sMiMi-CK mRNA 变化的研究.中国急救医学.1999.1：14-15.
[3]Ingnall J S, et al.Eur Heart J 1990,11 (Supp):3.
[4]Manning A, Bernier M, Crome R, et al. Reperfusio-induced Arrhythmias:a study of the role of xanthine oxidase-derived free radicals in the rat heat.J Mo; Cell Cardiol,1988,20(1):35.
收稿：1999-03-17, 百拇医药
单位：
李 芳 解放军211医院，150080；刘 辉 北安市第一人民医院；关振中 哈尔滨医科大学附属第二医院
关键词：sMiMi-CK蛋白；心肌缺血/再灌注；超微结构；能量代谢；羟自由基
摘要摘要：目的 本实验拟观察sMiMi-CK基因表达产物对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。方法 提取纯化sMiMi-CK基因蛋白质，建立大鼠离体心肌缺血/再灌注模型，以心肌超微结构的改变、能量代谢、自由基为指标观察其保护作用。结果 sMiMi-CK蛋白能明显保护缺血心肌超微结构，减轻线粒体内钙超载，明显提高ATP、ADP、AMP水平，减少羟自由基的生成。结论 sMiMi-CK蛋白对缺血/再灌注的大鼠心肌细胞具有明显的保护作用，从而为缺血性心脏病的基因治疗提供理论和实践基础。
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Effect of myocardial sMiMi-CK protein on ischemia/reperfusion in rats
LI Fang, LIU Hui，GUAN Zhen-zhong.
Chinese PLA 211 Hospital,Harbin 150080
Abstract Objective The present experiment was designed to study sMiMi-CK protein effects on the ischemia and reperfusion injury in rats .Methods Extracting and purificating sMiMi-CK protein and using ischemia / reperfusion injury model in vitro ,we studied the protective effects of sMiMi-CK protein on ultrastructive ,contents of high-energy prosphates and hydro free redical. Results sMiMi-CK showed significantly protective effects on ischemia myocardial ultrastructure ,reduced calcium overload and DHBAs formed, increased ATP,ADP,AMP levels in rat hearts.Conclusions sMiMi-CK protein had significantly protection to the myocardial ischemia /reperfusionin in rats.
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Key words sMiMi-CK protein Ischemia/reperfusion Ultrastructive Contents of high -energy prosphates DHBAs
近年来心肌缺血/再灌注损伤的研究已深入到分子基因水平，对其治疗人们也尝试着进行基因治疗。目前已确认[1]心肌线粒体肌酸激酶肌膜型亚基基因(sMiMi-CK)与能量代谢密切相关，而且在缺血/再灌注损伤的保护作用，从而为缺血性疾病的基因治疗提供实践依据。
1 资料与方法
1.1 资料 ①仪器：超薄切片机Olypus公司，H-600型透射电子显微镜，高效液相色谱仪(HPLC)，色谱柱：英国产Licrosorbc-18由中国科学院大连化学物理研究所色谱中心装柱。②试剂：2%锇酸(日本)，包埋剂Epon812，ATP、ADP、AMP、PCr、Cr辅酶Ⅰ(NAD)、次黄嘌呤(HYPO)均由美国SIGMA公司提供。
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1.2 方法
1.2.1 ①动物模型的制备 采用Langendorff无作功非循环式离体心脏灌流法制备心肌缺血/再灌注模型，灌流液为Krebs-Henseleit缓冲液。取2%戊巴比妥钠和0.25%肝素各按2 ml/kg体重腹腔注射，待动物麻醉后，迅速开胸，暴露心脏。在距主动脉起始部3～4 mm外剪下心脏，主即放入盛有冷灌流液(0～4℃)的平皿内，用冷灌流液冲掉残留在冠状血管内的血液，将心脏迅速移至Langendorff灌流装置上，灌流压力为90 cmH2O，平衡30 min 后，采用旷置法模拟全心缺血过程，打开旋塞恢复血流即再灌注，各实验组结束后，超微结构组将一部分心脏取下，放入2%戊二醛中，其它组将心脏迅速放入液氮中保存。
1.2.2 实验分组 正常对照组、缺血40分钟组，缺血40分钟+再灌20分钟组、缺血40分+ sMiMi-CK蛋白组，缺血40分钟+再灌20分钟+sMiMi-CK蛋白组，sMiMi-CK保护组是在灌流液中加入sMiMi-CK，使其浓度为10-2M。
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1.2.3 检测指标 a.超微结构观察 固定：用2%焦锑酸钾—1%锇酸水溶液固定2小时，冲洗用2%的焦锑酸钾溶液(pH 9.4)冲洗3次，常规脱水、浸透包埋及制作。b.能量代谢变化的观察 标准品的组成：1.34 mmol/L Cr、0.393 mmol/L Pcr、0.808 mmol/L HYPO、0.603 mmol/L NAD、0.349 mmol/L AMP、0.206 mmol/L ADP、0.430 mmol/L ATP，取10 ml标准品，注入HPLC。取液氮冷冻的心肌组织，匀浆3分钟，然后用超声波将线粒体膜打碎，再加1 M的KOH 0.70 ml，混匀，高速冷冻离心5 000 rpm 10分钟，取上清过滤、上柱。c羟自由基的测定 流动相组成：80% 0.03 M柠檬酸、0.03 M醋酸、20%甲醇、pH 3.6。剪取心肌200 mg，用 0.42 M HQO4 别成匀浆，再用1 M KOH中和，6 000 g离心15 min，取上清液1 ml置于10 ml试管内，加入40 μl 100 μl的2，4-DHBA作为内标，同时加入50 μl 1 N盐酸，10 ml乙醚，充分混匀120 S，静止分层，将乙醚层移到另一试管，置45℃水浴中，使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50 μl 1 N盐酸和32.5 μl流动相，将试管壁上结晶彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后，取30 μl此液注入HPLC进行分析。
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1.3 统计学处理 采用
±s表示，组间差异采用t检验，P<0.05显著性差异，P<0.01作为极显著差异。2 结果
2.1 超微结构的变化 缺血40分钟时，肌浆水肿部分肌节破坏，核染色质周边化，线粒体肿胀，再灌注后其改变加重，肌膜损伤严重，线粒体极度肿胀，嵴断裂，空泡化，甚至破裂，其内有大量钙离子沉积。缺血40分钟及再灌注20分钟前加入sMiMi-CK蛋白，可使心肌细胞的结构明显改善，表现为肌膜完整，线粒体膜较完整，嵴无破裂，钙沉积明显减少。见图1、2、3、4。
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图1 缺血40分钟(2万倍) 图2 缺血40分钟组+sMiMi-CK蛋白组(2万倍)
图3 缺血40分钟组+再灌20分钟组(2万倍)
图4 缺血40分钟组+再灌20分钟组+sMiMi-CK蛋白组(2万倍)
2.2 ATP、ADP、AMP、AN、PCr变化。随着缺血时间的延长，ATP、ADP、AMP、AN及PCr逐渐减少，各组与正常组比较P<0.01，缺血40分钟+再灌20分钟组减少最明显，加入sMiMi-CK蛋白后，ATP、ADP、AMP、AN较相应的缺血组及再灌注组都有所回升，但PCr则不同，Ⅰ40+sMiMi-CK组与Ⅰ40组及Ⅰ40 R+sMiMi-CK组与Ⅰ40 R 组比较，PCr明显减少，P<0.01。见表1。
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表1 缺血再灌注时高能磷酸物的变化及sMiMi-CK蛋白的保护作用(
±s)分 组
例数
ATP
ADP
AMP
PCr
正常组
7
20.3±1.33
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4.74±0.09
4.08±0.28
21.30±0.03
缺血40分钟组
7
6.95±0.99*#
3.42±0.09*#
2.59±0.03*#
3.63±0.07*#
缺血40分钟+再灌20分钟组
7
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1.44±0.05*△#
2.66±0.08*△#
1.39±0.02*△#
1.73±0.14*△#
缺血40分钟+sMiMi-CK 组
7
9.70±0.16
4.45±0.10*
3.62±0.07*
2.45±0.97*
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缺血40分钟+再灌20分钟+sMiMi-CK 组
7
6.85±0.34
4.82±0.24*△
4.52±0.04*△
0.52±0.46*△
*与正常组比较 P<0.01 △与缺血组比较 P<0.01
#与相应的sMiMi-CK组比较P<0.01
2.3 羟自由基的变化 心肌样品的DHBA提示，随着缺血时间延长，DHBA增加，再灌注后增加更明显。sMiMi-CK蛋白能量显著减少DHBA的量，与相应组比较P<0.01，见表2。
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表2 缺血再灌注时DHBA的变化及sMiMi-CK
蛋白的保护作用(nM/g)(
±s)分组
例数
2，5-DHBA
2，3-DHBA
正常组
7
0.393±0.007
0.232±0.008
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缺血40分钟组
7
2.860±0.06*#
2.620±0.049*#
缺血40分钟+再灌20分钟组
7
6.866±0.098*△#
4.038±0.147*△#
缺血40分钟+ sMiMi-CK 组
7
1.142±0.032*
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缺血40分钟+再灌20分钟+sMiMi-CK组
7
2.452±0.46*△
1.985±0.072*△
*与正常组比较P<0.01 △与缺血组比较P<0.01
#与相应的sMiMi-CK组比较P<0.01
3 讨论
基因治疗是近几年刚刚起步、比较吸引人的课题，作为一种生物制剂应用外源重组sMiMi-CK基因或其表达产物作用到人体，治疗相应的能量代谢障碍性疾病以及提高肌肉对缺氧的耐受性，打破以往治疗常规，将是很有前途的方法。
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实验表明sMiMi-CK基因表达蛋白质，能明显减轻细胞内钙超载，改善缺血心肌的超微结构变化，保护心肌线粒体。同时，sMiMi-CK蛋白能使ATP、ADP、AMP在缺血及再灌注时明显回升，从而改善机体的能量急需，避免氧化磷酸化脱偶联，改善电子传递及质子泵出的初速度，增强H+—ATP酶合成活性[3]。另外，sMiMi-CK蛋白还可通过改善Ca2+离子代谢来阻断黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶这一过程，使得再灌注OH生成明显减少，减轻心肌损伤[4]。
再灌注损伤发生的始动环节是能量代谢障碍，而直接损伤因素则是自由基，其结果导致细胞内钙超载。因此，要想阻止缺血再灌注损伤的发生，必须从改善心肌能量代谢障碍入手，其它问题则迎刃而解。sMiMi-CK蛋白作为一种廉价生物制品，恰能有效地提高机体ATP水平，改善线粒体内氧化磷酸化过程，减少自由基的生成，减轻肌膜损害，同时能够明显改善钙超载，避免心肌发生挛缩和心律失常。如能将sMiMi-CK基因的重组载体转染导入细胞内，可望在心肌缺血性及能量代谢性疾病的治疗方面开创一个基因治疗的新领域，将具有重要意义。
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参考文献
[1]Jorg S,Beat ZW ,et al .Native mitochondrial creatine kinase forms octamaeric strucure .J Biological Chemistry ,1998,263(32):16942-16853.
[2]李芳，李守岩，凌虹，等.急性缺血/再灌注时心肌 sMiMi-CK mRNA 变化的研究.中国急救医学.1999.1：14-15.
[3]Ingnall J S, et al.Eur Heart J 1990,11 (Supp):3.
[4]Manning A, Bernier M, Crome R, et al. Reperfusio-induced Arrhythmias:a study of the role of xanthine oxidase-derived free radicals in the rat heat.J Mo; Cell Cardiol,1988,20(1):35.
收稿：1999-03-17, 百拇医药