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编号:10250001
麝香保心丸对兔动脉壁一氧化氮代谢的影响
http://www.100md.com 《中国急救医学》 1999年第8期
     作者:李 勇 罗心平 范维琥 戴瑞鸿

    单位:李 勇 罗心平 范维琥 戴瑞鸿 上海医科大学华山医院心内科,上海 200040

    关键词:麝香保心丸妇;高脂血症;一氧化氮合酶

    中国急救医学990801 摘要:目的 为阐明麝香保心丸改善心肌血流灌注的机理。方法 在高脂血症造成兔动脉壁一氧化氮代谢异常的动物模型上,采用定量 RT-PCR 等技术,观察了该药的干预作用。结果 高脂饮食可造成动脉一氧化氮代谢的紊乱,麝香保心丸可部分逆转这种损害;与高脂血症对照组相比,它有提高动脉壁内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 基因表达的趋势 (0.1>P>0.05)、显著增强动脉的 NOS 的活力 (P<0.05)、提高血浆一氧化氮代谢产物 (NOP) 的水平 (P<0.05)。结论 麝香保心丸的抗心肌缺血作用可能与保护动脉壁一氧化氮系统有关。

, http://www.100md.com     Effect of heart-protecting musk pill on nitric oxide metabolism of arterial wall in cholesteriol-fed rabbits

    LI Yong, LUO Xin-ping, FAN Wei-hu,et al .

    Department of Cardiology ,Huashan Hospital ,Shanghai Medical University, Shanghai 200040

    Abstract Objective In order to examine the mechanism of heart-protectin musk pill (HMP) in increasing blood perfusion of the ischemic myocardium .Methods We studied the effect of HMP on nitric oxide (NO) metabolism of arterial wall in cholesteriol-fed rabbits .The level of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) mRNA was detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Nitric oxide synthase (NOS)activity of arterial wall and the concentration of plasma nitric oxide production (NOP) were measured in three groups (Control group (C)n=8,Hypercholesterolemia group(HC)n=8 and HMP group (SX)n=9).Results Indicate that hyperlipidemia caused decrease in eNOS mRNA levels and NOS activity (compared with C group,P<0.05).It reduced the quantity of NOP simutanuoesly (compared with C group ,P<0.05).HMP can partly reverse the impairement of NO system .It had a tendency of increasing eNOS mRNA levels (compared with HC group, 0.1>P>0.05)and markedly elevated the NOS activity and the concentration of NOP (compared with HC group, P<0.05).Conclusion This observation supports the hypothesis that the effect of increasing myocardium perfusion of HMP may be related to improve NO metabolism.
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    Key words Hypercholesterolemia Nitric oxide synthase mRNA Heart-protecting musk pill (HMP)

    动物实验及临床研究均已证明:麝香保心丸可增加冠心病患者缺血区的血流灌注,减少心肌梗死面积,显著改善缺血性 S-T、T 波改变[1~4],但其机理却有待阐明。同时,一氧化氮 (NO) 作为内皮源性血管舒张因子 (EDRF) ,在改变血管基础张力、调节血流量以及在动脉粥样硬化的形成中均发挥重要作用[5];高脂血症则可造成动脉壁 NO 的代谢异常[6,7]。本文在此动物模型上,从基因表达、蛋白酶活力及代谢产物等水平观察了麝香保心丸对 NO 代谢的影响。

    1 资料与方法

    1.1 动物分组及模型建立 参照文献[6]复制高脂血症动物模型。雄性纯种新西兰家兔36只,体重2.1~3.2 kg,随机分为3组:①正常对照组( C 组10只),喂饲基础颗粒饲料;②高脂血症对照组( HC 组13只),喂饲造模饲料(基础颗粒饲料+3%猪油+1%胆固醇粉);③麝香保心丸组( SX 组13只),除喂饲造模饲料外,6周末开始每天6粒麝香保心丸(上海中药一厂,批号9510048)+生理盐水10 ml灌胃2周。实验第8周时测体重并断头处死全部动物。
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    1.2 观察指标及检测方法

    1.2.1 定量逆转录多聚酶链式反应 (RT-PCR) 测定内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)mRNA 的水平

    1.2.1.1 动脉壁组织总 RNA 的提取 处死后立即将冠脉及升主动脉离断取出,剪除外膜附着组织,冰生理盐水洗净血迹,立即置液氮中保存。测定时称取100 mg组织,加入 TrizolTM试剂 (Gibco BRL 产品)1 ml,4℃高速匀浆,参照文献[8]采用一步法抽提 RNA。然后用甲醛变性凝胶电泳分析 RNA 质量,BACKMAN 7500型分光光度计于260/280 nm处测 OD值,计算总 RNA 浓度。

    1.2.1.2 逆转录反应 采用随机引物法,试剂盒购自Gibco BRL公司,按说明书操作。每份标本抽取4 μg RNA作为逆转录模板,70℃变性10分钟,42℃预热5分钟后加入200 V/μ lSuper Script Ⅱ逆转录酶1 μl,总反应体积20 μl。42℃保温50分钟,72℃15分钟终止反应;最后用 RNase H 酶1 μ1 37℃消化 RNA 30分钟。
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    1.2.1.1 定量PCR 引物由上海医学神经生物国家重点实验室合成。参照文献[9]设计eNOS引物序列:5′CGCTTCGACGTGCTGCCCCT3′,5′CCATTCCCAAAGGTGCTGGT3′可扩增915-1793共878 bp 的 cDNA。以三磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)mRNA 作为内标,参照文献[10]设计GAPDH引物:5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA′,5′AGATCCACAACGGATACATT3′,可扩增309 bp的cDNA片段。取2 μl逆转录产物作为模板,按常规方法行PCR,条件为94℃预变达4分钟,94℃ 1分钟、52℃ 1分钟、72℃ 1.5分钟,30轮循环,最后一轮72℃延伸8分钟。

    反应结束后,每份标本取 PCR 产物10 μl,在相同的条件下用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析,常规0.5 μg/ml EB 液染色,立即用Alpha ImagerTM图象分析系统(Alpha Innotech公司)于紫外线下摄片分析,测定每份标本eNOS及GAPDH cDNA条带各自的光密度和面积,然后计算eNOS/GAPDH cDNA条带的密度×面积比,以此来反映每个动物动脉壁eNOS mRNA的表达量。
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    1.2.2 血管壁组织一氧化氮合酶 (NOS) 活力测定

    试剂盒由军事医学科学院放射医学所提供,按说明书操作。动脉标本置液氮中保存,测定时称取200 mg血管组织,加入40 mM pH 7.2的磷酸钾缓冲液、4 ℃彻底匀浆,10 000转/分钟离心20分钟,取上清液按说明书加入各种试剂,使NOS催化L-精氨酸产生瓜氨酸和NO,后者使氧合血红蛋白氧化成高铁血红蛋白,产生吸光度的改变;立即用BACKMAN DU7500型分光光度计于401 nm及421 nm处、间隔30秒测定光密度变化,共3分钟,然后计算NOS活力;以每分钟每克组织产生的NO量(nmol)表示活力。

    1.2.3 血清一氧化氮代谢产物(NOP)测定

    试剂盒购自军事医学科学院放射医学所,参照文献[11]的方法,按说明书操作。用分光光度计在545 nm处测样品光密度、亚硝酸钠溶液制作标准曲线,以nmol/ml表示血清NO代谢产物(NO2-及 NO3-)的浓度。
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    1.3 统计学处理

    采用SAS分析数据。计量资料以平均数±标准差(±sd)表示,方差分析比较,两组间的比较用Dunnett't Test;以P<0.05为显著性差异标准。

    2 结果

    2.1 动物的一般情况 实验中大部分动物健康状况良好,体重随时间增长。实验结束时25只动物的资料符合标准,可参加统计( C组8只,HC 组8只,SX 组9只)。

    2.2 麝香保心丸对eNOS mRNA表达的影响 总RNA电泳分析可见清淅的18 S及28 S条带;PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带清淅,可用于分析。如附表所示,与C组相比,HC组的动脉壁eNOS mRNA水平显著降低(P<0.05),加用麝香保心丸2周,SX 组的eNOS mRNA比HC组升高,但未达到显著性差异水平(0.1>P>0.05)。提示麝香保心丸有提高eNOS基因表达的趋势。
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    附表 麝香保心丸对动脉壁eNOS mRNA

    水平及NOS活力的影响(±sd) 组 别

    C组 (n=8)

    HC组 (n=8)

    SX组(n=9)

    eNOS/GAPDH c DNA

    (密度×面积比)

    2.41±0.39

    1.60±0.35*

    2.07±0.73*
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    NOS活力

    (mol/min/g)

    3.94±1.37

    1.30±0.88*

    3.55±1.67*#

    *与C组比较P<0.05 #与HC组比较P<0.05

    2.3 麝香保心丸对动脉壁NOS活力的影响 如表所示,与C组相比,高胆固醇喂饲8周后,HC组和 SX 组兔动脉壁NOS活力均显著降低(P<0.05);但SX组则高于HC组(P<0.05)。提示麝香保心丸对高脂血症损害NOS的活力有保护作用。

    2.4 麝香保心丸对血浆NOP的影响 高胆固醇喂饲6周时,血清NOP的含量分别是C组25.22±4.19 μmol/L,HC组19.40±5.82 μmol/L,SX组18.68±6.87 μmol/L。HC组和SX组均低于C组(P<0.05),但两组间无差异(P>0.05)。8周时,NOP 含量分别是C组26.95±5.32 μmol/L,HC组13.50±3.89 μmol/L,SX组20.94±5.78 μmol/L。三组间比较均有显著差异(P<0.05),提示高脂血症可引起NOP水平降低,麝香保心丸对这种损害有逆转作用。
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    3 讨论

    eNOS是动脉壁内一氧化氮合酶的主要存在形式,它催化L-精氨酸产生NO;NO在调节血管张力、抑制血小板聚集等方面发挥重要作用。它从内皮细胞产生后,立即扩散至邻近的血管平滑肌细胞,激活鸟苷酸环化酶,升高cGMP浓度,引起血管舒张[5,12]

    研究证实,高脂血症可造成动脉壁NO的代谢异常。这种异常导致血小板聚集性升高和血管反应性异常,表现为血栓易于形成、血管基础张力升高、对乙酰胆碱等血管活性物质的舒张反应性降低或出现与生理作用相反的收缩反应;其后果是升高动脉血压和冠脉阻力,诱发冠脉痉挛,促使动脉粥样硬化和冠心病事件的发生[5~7,12]。本文的结果发现,高脂饮食后,兔动脉壁eNOS mRNA表达下降,NOS活力减弱,血浆NOP水平降低,与文献报道一致[6,7,12,13]。麝香保心丸是一种治疗冠心病的有效中成药。基础及临床研究均已证实它能扩张冠脉,增加心肌血供,减少心梗面积[1~4],但其机理不明。本文的结果发现,麝香保心丸有增加eNOS mRNA表达的趋势,提高NOS活力及血浆NOP的水平;提示麝香保心丸的作用可能与保护血管一氧化氮系统有关。其保护机理可能与其成份有关,它主要由麝香、人参、苏合香、蟾酥等中药组成。文献报道麝香精提物可扩管,降压[14]。人参则有降低血脂、减少氧自由基、抑制平滑肌细胞增生等作用[15];近期的研究表明,麝香保心丸能降低冠心病患者血中TXA2及脂质过氧化物(LPO)的浓度,增加PGI2和SOD的水平也与保护NO系统有关[2,15]。它可能通过抑制氧自由基生成,减少NO系统的损害而生效。
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    (致谢:本文工作承蒙上海医学神经生物国家重点实验室马兰教授、赵靖、郑震林博士等专家指导,特此致谢。)

    参考文献

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    收稿:1998-07-14

    修回:1999-01-10, 百拇医药