葡萄糖激酶基因与中国人2型糖尿病的相关性研究△
作者：班 博 王 华 何戎华 马立隽 金卫新
单位：班 博 王 华 何戎华 马立隽 南京医科大学第一附属医院内分泌科 邮政编码：210029；金卫新 南京医科大学生物技术国家重点实验室；班 博 现在济宁医学院附属医院
关键词：2型糖尿病 葡萄糖激酶 基因 短串联重复序列
江苏医药990908 摘要 目的：研究葡萄糖激酶(GCK)基因多态性与2型糖尿病的关系，并获得GCK基因频率在中国人群中的分布规律。方法：运用聚合酶联反应技术结合短串联重复序列(STR)的方法检测107例2型糖尿病患者及101例正常对照者的GCK基因型。结果：两组1、2、3、4和5等位基因的分布频率分别为0.08、0.46、0.07、0.29、0.10和0.11、0.49、0.16、0.23、0.01，其总体频率分布存在显著性差异，2型糖尿病组的5等位基因频率明显高于对照组。比较GCK基因座在中国人群与欧洲人及北美人群的分布，发现存在明显的种族差异。结论：GCK基因多态标记与中国人2型糖尿病相关联。
, 百拇医药
葡萄糖激酶(Glucokinase，GCK)是糖代谢的第一个限速酶，如果GCK功能缺陷或表达减少，将使肝脏葡萄糖利用受阻及胰岛β细胞胰岛素分泌减少。因而，葡萄糖激酶基因变异可能是糖尿病的发病原因之一。GCK基因位于第7号染色体的短臂上(7p)，其3’端10Kb处有一个多态性的(CA)n微卫星双碱基重复序列，该部位很容易出现缺失或插入2n个核苷酸片段，已经发现GCK基因变异与2型糖尿病的一个亚型MODY(maturity-onset diabetes of the young，幼年起病的成年型糖尿病)的发病密切相关[1，2]。GCK等位基因的多态性分布与常见的2型糖尿病亦有明显的相关性[3]。由于在不同种族间等位基因的多态性分布具有差异，因此目前尚不能肯定究竟这个基因在多大程度上参与了糖尿病的发病过程。本研究拟采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术结合短串联重复序列(short tandern repeats，STR)的方法，对中国人群GCK基因(CA)n重复序列多态性的分布情况进行分析，探讨这一多态性与中国人2型糖尿病之间的关系。
, 百拇医药
材料与方法
一、研究对象 107例2型糖尿病均根据1985年WHO标准确诊，其中男性51例，女性56例。平均年龄57.8±7.6岁。正常对照组101例，男46例，女55例，平均年龄52.2±7.6岁(P>0.05)。以上研究对象均为山东地区汉族，无亲缘关系及糖尿病家族史。分别测量身高、体重、血压、腹围和臀围，测空腹及餐后2小时血糖、血清胰岛素和C肽，测定空腹血脂谱，包括血浆胆固醇、甘油三酯、高密度及低密度脂蛋白、载脂蛋白和脂蛋白a。
二、基因组DNA的制备 采取抗凝血10ml分离白细胞，常规酚―氯仿法制备基因组DNA。DNA浓度用紫外分光光度计测定。
三、PCR扩增 引物：9509 5′-3′TTGGTCAGTGTAGGCTGAACTCATG，95105′-3′CCCACACCAAAACTGCCTGTATTAG(由中国科学院上海细胞生物学研究所合成)。微卫星标记引物的设计和多态性片段长度有关数据来源于PC-GDB(基因数据库)。PCR反应体积为25μl，基因组DNA1μg，引物各10mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，?dNTP?200?μmol/L及Taq酶1u(Promega公司产品)。PCR条件为：94℃预变性5分钟后进入主循环，变性94℃45秒，退火58℃45秒，延伸72℃45秒，共30个循环。扩增在480型热循环仪上完成。
, 百拇医药
四、电泳分离和银染 将PCR产物5μl和STR载样缓冲液2.5μl(25mmol/LNaOH，95%甲酰胺，0.025%二甲苯蓝，0.025%溴酚兰)混匀，97℃变性5分钟后迅速置于冰水中，然后上样，在4%变性丙烯酰胺胶上(acrylamide∶bis＝19∶1)以恒功率60W电泳1小时。然后用银染的方法进行显色。
五、数据处理 组间频率比较用χ2检验。多态信息含量(PIC)是度量群体杂和度的方法，具体计算公式如下：PIC＝1-Σfi2，fi为等位片段的频率。
结 果
检测来自山东地区遗传上无相关的糖尿病和正常汉族个体208人，其中男105人、女103人，总计416条染色体中共检出5种等位基因片段，片段长度依次为203bp、201bp、199bp、197bp、195bp，分别命名为1、2、3、4、5等位基因，其分布频率见表1。检出9种基因型，在杂合子中可见两条主带，纯合子中只见一条主带。
, 百拇医药
表1 2型糖尿病与对照组间GCK等位基因分布频率比较 类别
2型糖尿病
(个数/频率)
正常对照者
(个数/频率)
RR
P值
1
16/0.08
23/0.11
0.28
<0.001
, 百拇医药
2
99/0.46
100/0.49
0.88
>0.05
3
14/0.07
32/0.16
0.15
<0.001
4
63/0.29
46/0.23
, 百拇医药
1.41
>0.1
5
22/0.10
1/0.01
15.7
<0.001
总计
214
202
由表1可知：GCK等位基因5与2型糖尿病呈显著性正相关(RR＝15.7，P<0.001)，等位基因1和3与2型糖尿病呈显著性负相关(RR＝0.28，P<0.001和RR＝0.15，P<0.001)，等位基因3和4在疾病组与对照组的分布无明显差异。另外，具有等位基因5的2型糖尿病患者的临床特征，与不具有等位基因5的患者比较，在性别、发病年龄、体质指数、血糖、胰岛素及血脂间均无差异。
, 百拇医药
中国人与欧洲人及北美人人群的等位基因频率分布存在着明显的差异(P<0.01)，但最常见的等位基因均为2(见表2)。中国人群GCK位点的多态性程度(PIC＝66.9%)明显高于上述两个种族。表2 中国人群中GCK等位基因频率与欧洲人及北美人人群多态分布的比较 等位基因
片段长度(bp)
等位基因频率
多态信息含量(PIC)
Ch(n＝202)
Eu(n＝142)
NA(n＝80)
Ch
Eu
, 百拇医药
NA
1
203
0.11
0
0
0.67
0.50
0.54
2
201
0.49
0.66
, 百拇医药 0.60
3
199
0.16
0.09
0.10
4
197
0.23
0.24
0.30
5
195
, http://www.100md.com 0.01
0.01
0
6
180
0
0
0
Ch：中国人群；Eu：欧洲人；NA：北美人人群。Eu、NA的资料来源于PC-GDB。讨 论
位于第7号染色体上的GCK基因变异是迄今首先被发现的2型糖尿病的基因异常，这种病因可以解释2%左右的糖尿病病例(MODY)。这一发现给其它98%的糖尿病寻找致病基因带来了希望。在常见的糖尿病与GCK基因相关性的研究中，不同群体的糖尿病与GCK不同的等位基因相关联，美国黑人和日本人与等位基因3(199bp)关联，毛里求斯Creole人与等位基因4(197bp)关联，印度人与等位基因5(195bp)关联[3～5]。本研究的结论是中国山东汉族人常见的2型糖尿病与GCK等位基因5关联。
, 百拇医药
疾病与标志性状关联的强度一般用相对风险率(relative risk，RR)表示，即具某种标志性状的人患某种疾病的风险率是无此标志性状者的多少倍。本组资料按Haldane提出的估计RR值的修正公式计算等位基因5与糖尿病的关联强度RR＝15.70，经显著性检验P<0.001，说明这种关联强度有价值。关联强度表明具有等位基因5的人患2型糖尿病的可能性是没有等位基因5人的15.7倍。等位基因1、3与疾病组成负关联，表明等位基因1、3对2型糖尿病具有保护作用。而在台湾人的研究中[6]，等位基因4是2型糖尿病的保护因子，说明存在着民族与地区的差异。
具有GCK基因突变的MODY病人，以发病年龄早，轻度高血糖，葡萄糖激酶不足，而糖尿病的慢性并发症少见为临床特征[2，7]。而在常见的2型糖尿病中表现则不明显，本实验结果亦表明具有或不具有等位基因5的糖尿病患者的临床特征无差别。
2型糖尿病是一种多基因遗传病，其遗传模式复杂，在不同的糖尿病个体可能有不同的基因变异所致，而单个基因变异在糖尿病发病过程中只起微小效应，发病原因并不能用上述发现加以完全解释，只能说明GCK基因与中国人常见的2型糖尿病相关联。故寻找2型糖尿病致病基因是一项艰巨的工作，需要各国学者、医生不懈的努力与研究的积累。
, 百拇医药
此外，本研究得出了一个中国人群的GCK等位基因分布频率(PIC＝66.9%)，与欧洲人、北美人群的分布比较存在着明显的种族差异。中国人群与其它种族人群相比存在着异质性，对大量中国人群样本的收集和基因分析，不仅对医学生物学的研究(致病基因和疾病易感基因分离、鉴定及其在基因诊断和治疗中的应用)有重大意义，而且对人类学和社会学的研究也具有特殊意义。
△ 本课题为国家自然科学基金资助项目(3950072)
参考文献
?[1] Velho G, et al. Eur J Endocrinal 1998；138：233.
?[2] Velho G, et al. Diabetologia 1997；40：217.
?[3] Chiu KC, et al. Diabetes 1992；41：843.
?[4] Noda K, et al. Diabetes 1993；42：1147.
?[5] McCarthy MI, et al. Diabetologia 1993；36：633.
?[6] Wu HP, et al. Diabetes Res Chin Pract 1995；30：21.
?[7] Tappy L, et al. Diabetes 1997；46：204.
(1998年12月28日收稿 1999年3月30日修回), 百拇医药
单位：班 博 王 华 何戎华 马立隽 南京医科大学第一附属医院内分泌科 邮政编码：210029；金卫新 南京医科大学生物技术国家重点实验室；班 博 现在济宁医学院附属医院
关键词：2型糖尿病 葡萄糖激酶 基因 短串联重复序列
江苏医药990908 摘要 目的：研究葡萄糖激酶(GCK)基因多态性与2型糖尿病的关系，并获得GCK基因频率在中国人群中的分布规律。方法：运用聚合酶联反应技术结合短串联重复序列(STR)的方法检测107例2型糖尿病患者及101例正常对照者的GCK基因型。结果：两组1、2、3、4和5等位基因的分布频率分别为0.08、0.46、0.07、0.29、0.10和0.11、0.49、0.16、0.23、0.01，其总体频率分布存在显著性差异，2型糖尿病组的5等位基因频率明显高于对照组。比较GCK基因座在中国人群与欧洲人及北美人群的分布，发现存在明显的种族差异。结论：GCK基因多态标记与中国人2型糖尿病相关联。
, 百拇医药
葡萄糖激酶(Glucokinase，GCK)是糖代谢的第一个限速酶，如果GCK功能缺陷或表达减少，将使肝脏葡萄糖利用受阻及胰岛β细胞胰岛素分泌减少。因而，葡萄糖激酶基因变异可能是糖尿病的发病原因之一。GCK基因位于第7号染色体的短臂上(7p)，其3’端10Kb处有一个多态性的(CA)n微卫星双碱基重复序列，该部位很容易出现缺失或插入2n个核苷酸片段，已经发现GCK基因变异与2型糖尿病的一个亚型MODY(maturity-onset diabetes of the young，幼年起病的成年型糖尿病)的发病密切相关[1，2]。GCK等位基因的多态性分布与常见的2型糖尿病亦有明显的相关性[3]。由于在不同种族间等位基因的多态性分布具有差异，因此目前尚不能肯定究竟这个基因在多大程度上参与了糖尿病的发病过程。本研究拟采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术结合短串联重复序列(short tandern repeats，STR)的方法，对中国人群GCK基因(CA)n重复序列多态性的分布情况进行分析，探讨这一多态性与中国人2型糖尿病之间的关系。
, 百拇医药
材料与方法
一、研究对象 107例2型糖尿病均根据1985年WHO标准确诊，其中男性51例，女性56例。平均年龄57.8±7.6岁。正常对照组101例，男46例，女55例，平均年龄52.2±7.6岁(P>0.05)。以上研究对象均为山东地区汉族，无亲缘关系及糖尿病家族史。分别测量身高、体重、血压、腹围和臀围，测空腹及餐后2小时血糖、血清胰岛素和C肽，测定空腹血脂谱，包括血浆胆固醇、甘油三酯、高密度及低密度脂蛋白、载脂蛋白和脂蛋白a。
二、基因组DNA的制备 采取抗凝血10ml分离白细胞，常规酚―氯仿法制备基因组DNA。DNA浓度用紫外分光光度计测定。
三、PCR扩增 引物：9509 5′-3′TTGGTCAGTGTAGGCTGAACTCATG，95105′-3′CCCACACCAAAACTGCCTGTATTAG(由中国科学院上海细胞生物学研究所合成)。微卫星标记引物的设计和多态性片段长度有关数据来源于PC-GDB(基因数据库)。PCR反应体积为25μl，基因组DNA1μg，引物各10mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，?dNTP?200?μmol/L及Taq酶1u(Promega公司产品)。PCR条件为：94℃预变性5分钟后进入主循环，变性94℃45秒，退火58℃45秒，延伸72℃45秒，共30个循环。扩增在480型热循环仪上完成。
, 百拇医药
四、电泳分离和银染 将PCR产物5μl和STR载样缓冲液2.5μl(25mmol/LNaOH，95%甲酰胺，0.025%二甲苯蓝，0.025%溴酚兰)混匀，97℃变性5分钟后迅速置于冰水中，然后上样，在4%变性丙烯酰胺胶上(acrylamide∶bis＝19∶1)以恒功率60W电泳1小时。然后用银染的方法进行显色。
五、数据处理 组间频率比较用χ2检验。多态信息含量(PIC)是度量群体杂和度的方法，具体计算公式如下：PIC＝1-Σfi2，fi为等位片段的频率。
结 果
检测来自山东地区遗传上无相关的糖尿病和正常汉族个体208人，其中男105人、女103人，总计416条染色体中共检出5种等位基因片段，片段长度依次为203bp、201bp、199bp、197bp、195bp，分别命名为1、2、3、4、5等位基因，其分布频率见表1。检出9种基因型，在杂合子中可见两条主带，纯合子中只见一条主带。
, 百拇医药
表1 2型糖尿病与对照组间GCK等位基因分布频率比较 类别
2型糖尿病
(个数/频率)
正常对照者
(个数/频率)
RR
P值
1
16/0.08
23/0.11
0.28
<0.001
, 百拇医药
2
99/0.46
100/0.49
0.88
>0.05
3
14/0.07
32/0.16
0.15
<0.001
4
63/0.29
46/0.23
, 百拇医药
1.41
>0.1
5
22/0.10
1/0.01
15.7
<0.001
总计
214
202
由表1可知：GCK等位基因5与2型糖尿病呈显著性正相关(RR＝15.7，P<0.001)，等位基因1和3与2型糖尿病呈显著性负相关(RR＝0.28，P<0.001和RR＝0.15，P<0.001)，等位基因3和4在疾病组与对照组的分布无明显差异。另外，具有等位基因5的2型糖尿病患者的临床特征，与不具有等位基因5的患者比较，在性别、发病年龄、体质指数、血糖、胰岛素及血脂间均无差异。
, 百拇医药
中国人与欧洲人及北美人人群的等位基因频率分布存在着明显的差异(P<0.01)，但最常见的等位基因均为2(见表2)。中国人群GCK位点的多态性程度(PIC＝66.9%)明显高于上述两个种族。表2 中国人群中GCK等位基因频率与欧洲人及北美人人群多态分布的比较 等位基因
片段长度(bp)
等位基因频率
多态信息含量(PIC)
Ch(n＝202)
Eu(n＝142)
NA(n＝80)
Ch
Eu
, 百拇医药
NA
1
203
0.11
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0.67
0.50
0.54
2
201
0.49
0.66
, 百拇医药 0.60
3
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0.16
0.09
0.10
4
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0.23
0.24
0.30
5
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, http://www.100md.com 0.01
0.01
0
6
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Ch：中国人群；Eu：欧洲人；NA：北美人人群。Eu、NA的资料来源于PC-GDB。讨 论
位于第7号染色体上的GCK基因变异是迄今首先被发现的2型糖尿病的基因异常，这种病因可以解释2%左右的糖尿病病例(MODY)。这一发现给其它98%的糖尿病寻找致病基因带来了希望。在常见的糖尿病与GCK基因相关性的研究中，不同群体的糖尿病与GCK不同的等位基因相关联，美国黑人和日本人与等位基因3(199bp)关联，毛里求斯Creole人与等位基因4(197bp)关联，印度人与等位基因5(195bp)关联[3～5]。本研究的结论是中国山东汉族人常见的2型糖尿病与GCK等位基因5关联。
, 百拇医药
疾病与标志性状关联的强度一般用相对风险率(relative risk，RR)表示，即具某种标志性状的人患某种疾病的风险率是无此标志性状者的多少倍。本组资料按Haldane提出的估计RR值的修正公式计算等位基因5与糖尿病的关联强度RR＝15.70，经显著性检验P<0.001，说明这种关联强度有价值。关联强度表明具有等位基因5的人患2型糖尿病的可能性是没有等位基因5人的15.7倍。等位基因1、3与疾病组成负关联，表明等位基因1、3对2型糖尿病具有保护作用。而在台湾人的研究中[6]，等位基因4是2型糖尿病的保护因子，说明存在着民族与地区的差异。
具有GCK基因突变的MODY病人，以发病年龄早，轻度高血糖，葡萄糖激酶不足，而糖尿病的慢性并发症少见为临床特征[2，7]。而在常见的2型糖尿病中表现则不明显，本实验结果亦表明具有或不具有等位基因5的糖尿病患者的临床特征无差别。
2型糖尿病是一种多基因遗传病，其遗传模式复杂，在不同的糖尿病个体可能有不同的基因变异所致，而单个基因变异在糖尿病发病过程中只起微小效应，发病原因并不能用上述发现加以完全解释，只能说明GCK基因与中国人常见的2型糖尿病相关联。故寻找2型糖尿病致病基因是一项艰巨的工作，需要各国学者、医生不懈的努力与研究的积累。
, 百拇医药
此外，本研究得出了一个中国人群的GCK等位基因分布频率(PIC＝66.9%)，与欧洲人、北美人群的分布比较存在着明显的种族差异。中国人群与其它种族人群相比存在着异质性，对大量中国人群样本的收集和基因分析，不仅对医学生物学的研究(致病基因和疾病易感基因分离、鉴定及其在基因诊断和治疗中的应用)有重大意义，而且对人类学和社会学的研究也具有特殊意义。
△ 本课题为国家自然科学基金资助项目(3950072)
参考文献
?[1] Velho G, et al. Eur J Endocrinal 1998；138：233.
?[2] Velho G, et al. Diabetologia 1997；40：217.
?[3] Chiu KC, et al. Diabetes 1992；41：843.
?[4] Noda K, et al. Diabetes 1993；42：1147.
?[5] McCarthy MI, et al. Diabetologia 1993；36：633.
?[6] Wu HP, et al. Diabetes Res Chin Pract 1995；30：21.
?[7] Tappy L, et al. Diabetes 1997；46：204.
(1998年12月28日收稿 1999年3月30日修回), 百拇医药