防风多糖的研究
作者：李 江* 陆蕴如 张桂燕
单位：李 江* 北京联合大学中医药学院中药系 100013；陆蕴如 张桂燕 北京中医药大学
关键词：防风；多糖；生理活性
中草药990906 摘 要 从防风水提液中得到2种酸性杂多糖XC-1，XC-2，其平均分子量为13 100和73 500。通过TLC和GC确定了糖的组成和摩尔比，应用IR，1H和13CNMR谱对多糖进行了初步结构研究。初步药理实验证明，防风多糖XC-2具有显著增强机体免疫功能的作用。
防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.未抽花茎植株的干燥根，因其功善走表祛邪并御风，故名防风[1]。它为中医临床常用中药。现代研究表明防风水提液具有增强机体免疫功能、解热、镇痛、镇静、抗炎等作用。Simizu等人曾报道，防风多糖具有RES激活活性[2，3]。
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在药理实验的配合下，我们对防风水提液的化学成分进行研究，发现多糖部分为增强机体免疫功能的活性成分，对其进行分离纯化，得到防风多糖XC-1，XC-2。其中XC-2能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。2种防风多糖的糖残基组成、分子量均与文献报道不同[2，3]。
1 材料与仪器
防风由唐山市药检所姚绍柱代购，并鉴定为Sa?oshnikovia divaricata (Turcz.) Schishk.的未抽花茎植株干燥根，产于河北唐山地区(野生)。Dextran系列标准品、Sephadex G-75均为Pharmacia公司产品，各种单糖、糖醛酸标准品及所有其它试剂均为分析纯。HP 5890 Seriex Ⅱ型毛细管气相色谱仪，Waters 244型高效液相色谱仪，ECP 3000 型电泳仪，日本岛津U-2000型紫外分光光度计，Nicolet 20XBS型红外光谱仪，JEOL GX 400型核磁共振仪。
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2 多糖的分离纯化
防风1kg，粉碎，热水提取，水提液减压浓缩，乙醇沉淀得粗多糖。粗多糖经Sevag法除蛋白20 次，再醇沉，丙酮、乙醚依次洗涤，干燥得防风总多糖。将总多糖溶于水，以氯型DE-52纤维素柱(60cm×2.6cm)色谱分离，依次用水、0.05～0.5mol/L NaCl洗脱，苯酚硫酸法[4]测定流出液，合并糖反应阳性高峰部分。取0.1mol/L NaCl洗脱部分，蒸馏水透析2 d，减压浓缩。浓缩液经Sephadex G-75柱层析(100cm×2.6cm)，蒸馏水洗脱，同上法检测，合并糖反应阳性高峰部分，减压浓缩，冷冻干燥，得防风多糖XC-1，XC-2。
3 纯度及分子量测定
高效液相凝胶色谱[5]：色谱柱为Shodex Ionpak S-803糖分析柱。样品浓度0.5%(w/v)，进样量51μL，流动相为0.2mol/L硫酸钠溶液，流速0.8mL/min。XC-1，XC-2均为单一色谱峰。
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标准分子量系列Dextran(4.01×104，1.05×104，400×103)绘制标准曲线，求得XC-1、XC-2的平均分子量为13 100和73 500。
醋酸纤维素薄膜电泳[6]：薄膜(2cm×8cm)，缓冲液0.125mol/L硼酸：0.1mol/L NaOH(8∶1) pH0.3，电压250V，电泳30min。1%阿利新蓝染色，95%乙醇漂洗，结果均为一向阳性移动的区带。
4 含量测定
防风多糖XC-1，XC-2以半乳糖为标准品，苯酚-硫酸法测定总糖的含量为93.8%和96.0%。以半乳糖醛酸为标准品，硫酸咔唑法[7]测定糖醛酸含量为8.3%和19.3%。
5 糖残基的组成及摩尔比测定
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5.1 薄层层析：取XC-1，XC-2各5mg，加1mol/L H2SO4 1 mL置安瓶中，封管。100℃水解4h时，碳酸钡中和，离心，上清液浓缩后，点样。层析板为自制含0.3% NaH2PO4、0.5% CMC的硅胶G板。展开剂为丙酮-水(96∶4)。苯胺邻苯二甲酸显色。层析结果为：XC-1示有7个斑点，与标准单糖对照，含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖，其Rf值的相对比为(甘露糖Rf=1)0.13∶0.36∶0.63∶1.00∶1.67∶2.07∶3.60。XC-2示有6个斑点，与标准品对照，含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖，其Rf值的相对比为(甘露糖Rf=1)0.13∶0.36∶0.63∶1.00∶2.07∶3.60。
5.2 气相层析
5.2.1 单糖组成分析：称取XC-1，XC-2各10mg，同上法水解，按文献[8]方法制备糖腈乙酸酯衍生物，配成氯仿溶液。
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层析柱为弹性石英毛细管柱OV-1(12m×0.2mm×0.3mm)，柱温，程序升温165℃至210℃，每分钟上升7℃。气化250℃，检测280 ℃。
气相层析结果XC-2与薄层层析一致。XC-1较薄层层析多出一个木糖的峰。
5.2.2 组成单糖摩尔比测定：以肌醇六乙酸酯为内氇，测定了上述各标准单糖的定量校正因子。配比各单糖与内标的重量比在0.5～2.6范围内的5个不同浓度，依上法制备糖腈乙酸酯衍生物，进行气相层析，求出各单糖的斜率b，即定量较正因子(f=Wi/Ws/Ai/As)。XC-1，XC-2的摩尔比测定条件与测定定量校正因子条件相同。根据各单峰的峰面积和内标的峰面积比乘以f/M(定量校正因子/分子量)所得值比之比即为摩尔比。XC-1，XC-2的半乳糖醛酸的含量分别为8.3%和19.3%，按其含量比换算成摩尔比。测定结果为XC-1，鼠李糖-阿拉伯糖-木糖-岩藻糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖醛酸=10.0∶7.26∶0.25∶2.13∶0.52∶3.23∶7.20∶2.97；XC-2，鼠李糖-阿拉伯糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖醛酸=1.05∶7.01∶0.16∶0.79∶10.0∶4.69。
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6 波谱分析
XC-1，XC-2的紫外光谱在280nm处均无吸收峰，且茚三酮反应为阴性，说明2种多糖不含氨基酸或蛋白质。红外光谱中(KBr压片)，XC-2在897cm-1的吸收峰，示分子中有β-型糖苷键[9]。XC-2的1HNMR(δ，ppm)谱中，在5左右有多重峰。1.12和1.06为鼠李糖上的甲基质子信号。XC-2的13CNMR(δ，ppm)谱中，在高场区有2个鼠李糖的C6共振信号18.4和18.1。在端基碳99～112范围内，呈现10个共振信号，可推测分子的重复片断至少由10个糖残基组成。
7 讨论
从防风中分离得到2个多糖XC-1，XC-2均为白色粉末状固体，可溶于水。分子中含有半乳糖醛酸，属于酸性杂多糖。通过其组成分析和摩尔比测定，结果表明两者有很大的差异。
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Shimizu等人从防风中分离得到3种多糖saponikovan A，B，C，糖残基组成分别为A：半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸；B：半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、乙酰基和甲氧基；C：半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸。因而作者所得多糖XC-1，XC-2均不同于已报道的多糖。
多糖XC-1的气相分析结果较薄层层析多出一个木糖，这可能是由于木糖含量少而薄层层析灵敏度低的缘故。
致谢：军事医学科学院王友茹、王作华、黄荣清等同志协作完成高效液相及气相色谱分析。
参考文献
1 冉先德主编.中华药海.上册.哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：35
2 Shimizu N, et al. Chem Pharm Bull，1989, 37:1329
, 百拇医药
3 Shimizu N, et al. Chem Pharm Bull, 1989, 37:3054
4 Dubois M, et al. Analytical Chemistry，1956, 28:350
5 方积年，等.化学学报，1988，46：1101
6 黄乔书，等.药学学报，1982，17(3)：200
7 李向高，等.中药通报，1987，12(6)：40
8 李铁林，等.分析化学，1982，10(2)：272
9 方积年.药物研究，1979，29：36
收稿日期：1998-05-22, http://www.100md.com(李 江* 陆蕴如 张桂燕)
单位：李 江* 北京联合大学中医药学院中药系 100013；陆蕴如 张桂燕 北京中医药大学
关键词：防风；多糖；生理活性
中草药990906 摘 要 从防风水提液中得到2种酸性杂多糖XC-1，XC-2，其平均分子量为13 100和73 500。通过TLC和GC确定了糖的组成和摩尔比，应用IR，1H和13CNMR谱对多糖进行了初步结构研究。初步药理实验证明，防风多糖XC-2具有显著增强机体免疫功能的作用。
防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.未抽花茎植株的干燥根，因其功善走表祛邪并御风，故名防风[1]。它为中医临床常用中药。现代研究表明防风水提液具有增强机体免疫功能、解热、镇痛、镇静、抗炎等作用。Simizu等人曾报道，防风多糖具有RES激活活性[2，3]。
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在药理实验的配合下，我们对防风水提液的化学成分进行研究，发现多糖部分为增强机体免疫功能的活性成分，对其进行分离纯化，得到防风多糖XC-1，XC-2。其中XC-2能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。2种防风多糖的糖残基组成、分子量均与文献报道不同[2，3]。
1 材料与仪器
防风由唐山市药检所姚绍柱代购，并鉴定为Sa?oshnikovia divaricata (Turcz.) Schishk.的未抽花茎植株干燥根，产于河北唐山地区(野生)。Dextran系列标准品、Sephadex G-75均为Pharmacia公司产品，各种单糖、糖醛酸标准品及所有其它试剂均为分析纯。HP 5890 Seriex Ⅱ型毛细管气相色谱仪，Waters 244型高效液相色谱仪，ECP 3000 型电泳仪，日本岛津U-2000型紫外分光光度计，Nicolet 20XBS型红外光谱仪，JEOL GX 400型核磁共振仪。
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2 多糖的分离纯化
防风1kg，粉碎，热水提取，水提液减压浓缩，乙醇沉淀得粗多糖。粗多糖经Sevag法除蛋白20 次，再醇沉，丙酮、乙醚依次洗涤，干燥得防风总多糖。将总多糖溶于水，以氯型DE-52纤维素柱(60cm×2.6cm)色谱分离，依次用水、0.05～0.5mol/L NaCl洗脱，苯酚硫酸法[4]测定流出液，合并糖反应阳性高峰部分。取0.1mol/L NaCl洗脱部分，蒸馏水透析2 d，减压浓缩。浓缩液经Sephadex G-75柱层析(100cm×2.6cm)，蒸馏水洗脱，同上法检测，合并糖反应阳性高峰部分，减压浓缩，冷冻干燥，得防风多糖XC-1，XC-2。
3 纯度及分子量测定
高效液相凝胶色谱[5]：色谱柱为Shodex Ionpak S-803糖分析柱。样品浓度0.5%(w/v)，进样量51μL，流动相为0.2mol/L硫酸钠溶液，流速0.8mL/min。XC-1，XC-2均为单一色谱峰。
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标准分子量系列Dextran(4.01×104，1.05×104，400×103)绘制标准曲线，求得XC-1、XC-2的平均分子量为13 100和73 500。
醋酸纤维素薄膜电泳[6]：薄膜(2cm×8cm)，缓冲液0.125mol/L硼酸：0.1mol/L NaOH(8∶1) pH0.3，电压250V，电泳30min。1%阿利新蓝染色，95%乙醇漂洗，结果均为一向阳性移动的区带。
4 含量测定
防风多糖XC-1，XC-2以半乳糖为标准品，苯酚-硫酸法测定总糖的含量为93.8%和96.0%。以半乳糖醛酸为标准品，硫酸咔唑法[7]测定糖醛酸含量为8.3%和19.3%。
5 糖残基的组成及摩尔比测定
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5.1 薄层层析：取XC-1，XC-2各5mg，加1mol/L H2SO4 1 mL置安瓶中，封管。100℃水解4h时，碳酸钡中和，离心，上清液浓缩后，点样。层析板为自制含0.3% NaH2PO4、0.5% CMC的硅胶G板。展开剂为丙酮-水(96∶4)。苯胺邻苯二甲酸显色。层析结果为：XC-1示有7个斑点，与标准单糖对照，含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖，其Rf值的相对比为(甘露糖Rf=1)0.13∶0.36∶0.63∶1.00∶1.67∶2.07∶3.60。XC-2示有6个斑点，与标准品对照，含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖，其Rf值的相对比为(甘露糖Rf=1)0.13∶0.36∶0.63∶1.00∶2.07∶3.60。
5.2 气相层析
5.2.1 单糖组成分析：称取XC-1，XC-2各10mg，同上法水解，按文献[8]方法制备糖腈乙酸酯衍生物，配成氯仿溶液。
, 百拇医药
层析柱为弹性石英毛细管柱OV-1(12m×0.2mm×0.3mm)，柱温，程序升温165℃至210℃，每分钟上升7℃。气化250℃，检测280 ℃。
气相层析结果XC-2与薄层层析一致。XC-1较薄层层析多出一个木糖的峰。
5.2.2 组成单糖摩尔比测定：以肌醇六乙酸酯为内氇，测定了上述各标准单糖的定量校正因子。配比各单糖与内标的重量比在0.5～2.6范围内的5个不同浓度，依上法制备糖腈乙酸酯衍生物，进行气相层析，求出各单糖的斜率b，即定量较正因子(f=Wi/Ws/Ai/As)。XC-1，XC-2的摩尔比测定条件与测定定量校正因子条件相同。根据各单峰的峰面积和内标的峰面积比乘以f/M(定量校正因子/分子量)所得值比之比即为摩尔比。XC-1，XC-2的半乳糖醛酸的含量分别为8.3%和19.3%，按其含量比换算成摩尔比。测定结果为XC-1，鼠李糖-阿拉伯糖-木糖-岩藻糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖醛酸=10.0∶7.26∶0.25∶2.13∶0.52∶3.23∶7.20∶2.97；XC-2，鼠李糖-阿拉伯糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖醛酸=1.05∶7.01∶0.16∶0.79∶10.0∶4.69。
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6 波谱分析
XC-1，XC-2的紫外光谱在280nm处均无吸收峰，且茚三酮反应为阴性，说明2种多糖不含氨基酸或蛋白质。红外光谱中(KBr压片)，XC-2在897cm-1的吸收峰，示分子中有β-型糖苷键[9]。XC-2的1HNMR(δ，ppm)谱中，在5左右有多重峰。1.12和1.06为鼠李糖上的甲基质子信号。XC-2的13CNMR(δ，ppm)谱中，在高场区有2个鼠李糖的C6共振信号18.4和18.1。在端基碳99～112范围内，呈现10个共振信号，可推测分子的重复片断至少由10个糖残基组成。
7 讨论
从防风中分离得到2个多糖XC-1，XC-2均为白色粉末状固体，可溶于水。分子中含有半乳糖醛酸，属于酸性杂多糖。通过其组成分析和摩尔比测定，结果表明两者有很大的差异。
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Shimizu等人从防风中分离得到3种多糖saponikovan A，B，C，糖残基组成分别为A：半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸；B：半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、乙酰基和甲氧基；C：半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸。因而作者所得多糖XC-1，XC-2均不同于已报道的多糖。
多糖XC-1的气相分析结果较薄层层析多出一个木糖，这可能是由于木糖含量少而薄层层析灵敏度低的缘故。
致谢：军事医学科学院王友茹、王作华、黄荣清等同志协作完成高效液相及气相色谱分析。
参考文献
1 冉先德主编.中华药海.上册.哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：35
2 Shimizu N, et al. Chem Pharm Bull，1989, 37:1329
, 百拇医药
3 Shimizu N, et al. Chem Pharm Bull, 1989, 37:3054
4 Dubois M, et al. Analytical Chemistry，1956, 28:350
5 方积年，等.化学学报，1988，46：1101
6 黄乔书，等.药学学报，1982，17(3)：200
7 李向高，等.中药通报，1987，12(6)：40
8 李铁林，等.分析化学，1982，10(2)：272
9 方积年.药物研究，1979，29：36
收稿日期：1998-05-22, http://www.100md.com(李 江* 陆蕴如 张桂燕)