克白酊中补骨脂素和异补骨脂素的HPLC测定
作者：方子季* 纪松岗 林 静 袁锦华 代育存
单位：海军401医院 青岛 266071
关键词：克白酊；补骨脂素；异补骨脂素；二氯乙烷萃取；HPLC法
克白酊中补骨脂素和异补骨脂素的HPLC测定 摘 要 样品水浴蒸发后以二氯乙烷萃取，采用C18键合柱反相色谱方法，以氯霉素作内标物，测定克白酊中的补骨脂素和异补骨脂素。RSD<2%，线性范围均为10～200μg/mL，补骨脂酊r=0.9999，异补骨脂酊r=0.9999。回收率分别为96.7%和100.3%。
克白酊系海军401医院自制的治疗白癜风系列制剂之一，主要含补骨脂、红花等数种中药，临床应用疗效较好。国内已有补骨脂酊含量测定方法的报道[1]，但克白酊除含补骨脂外，尚含多种其它中药。本文建立了HPLC法测定克白酊中的补骨脂素和异补骨脂素含量的方法。
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1 仪器与试剂
日本岛津公司LC-6A高效液相色谱仪。克白酊：海军401医院制剂室提供。补骨脂素和异补骨脂素对照品：中国药品生物制品检定所提供。氯霉素：青岛医药公司提供。甲醇：紫外光学纯。无水乙醇：分析纯。
对照品贮备液：精密称取105℃干燥至恒重的补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，用无水乙醇配成浓度分别为2.4和2.0mg/mL的溶液，置4℃冰箱备用。
内标贮备液：精密称取氯霉素配制成1.0mg/mL的无水乙醇溶液，置4℃冰箱备用。
2 方法和结果
2.1 色谱条件：大连依利特公司YWG色谱柱(4.6mm×250mm)，大连依利特公司C18保护柱，柱温35℃，流动相甲醇-水(4∶6)，流速1.3mL/min，检测波长295nm，量程0.04AUFS，纸速1 mm/min。
, 百拇医药
补骨脂素和异补骨脂素的保留时间分别是15min和17min，分离度1.67，理论板数分别为2 130和3 825，内标峰保留时间是5.4min。
2.2 回归方程的测定：准确配制6种不同浓度对照品无水乙醇溶液(10，20，40，80，160，200 μg/mL)，加适量内标使成80μg/mL，每次进样6μL，进样3次。记录色谱图，求得对照品峰面积为内标物峰面积的关于进样浓度的回归方程。补骨脂素回归方程：Y=2.376×10-2+3.741×10-2X,r=0.9999。异补骨脂素回归方程：Y=3.935×10-2+3.686×10-2X,r=0.9999。
2.3 加样回收率试验：取克白酊25mL 3份，分别加入对照品贮备液适量，按样品测定方法处理并加入内标物后，按样品测定项下方法3份样品各重复测定3次。计算得补骨脂素平均回收率为96.7%，RSD=1.6%，异补骨脂素平均回收率为100.3%，RSD=0.75%。
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2.4 样品测定：精密量取克白酊25mL，水浴蒸干，加水10mL使剩余物混悬，置50mL分液漏斗中，加二氯乙烷萃取，每次15mL，共萃取3次，合并萃取液，水浴蒸干，剩余物分次加入无水乙醇溶解，并移至25mL量瓶中，加入内标液适量使成80mg/mL，加无水乙醇至刻度，摇匀，以干燥滤纸过滤，弃初滤液5 mL取续滤液6μL进样，求得样品峰面积与内标峰面积的比值，代入回归方程计算样品含量。结果见表1。
表1 克白酊含量测定结果(n=3)
品名
批号
补骨脂素
RSD
异补骨脂素
RSD
, 百拇医药
(μg/mL)
(%)
(μg/mL)
(%)
补骨脂酊
941004
100.3
1.6
98.7
0.50
补骨脂酊
941004
100.2
, 百拇医药
1.8
100.1
0.81
补骨脂酊
941004
97.5
1.1
99.6
1.20
3 讨论
3.1 作者曾实验水浴蒸干，加水混悬，加氯仿提取法；以及水浴蒸干，加2.5%碳酸钠碱化，加石油醚脱脂后以盐酸中和，再以氯仿提取法[2]；水浴蒸干，以乙醇溶解经中性氧化铝柱层析等方法进行样品的前处理，但均不够理想，柱层析处理虽除去一些杂质峰，但与未经处理酊剂一样在补骨素前有一个含量大的峰，不能完全分离，影响测定结果，而上述二种氯仿提取法，因氯仿提取时易乳化，影响测定结果，测得含量仅为理论量的50%左右，而用本法处理样品含量与理论量相符，且干扰峰少，不影响测定，故选用本法。
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3.2 溶剂的比例若水的比例下降或柱温升高均会使补骨脂素与异补骨脂素的分离度降至1.5以下，影响分离效果。
A-对照品 B-经柱层析 C-经氯仿萃取 D-经二氯乙烷萃取 1-内标 2-补骨脂素 3-异补骨脂素 4-杂质峰
图1 样品HPLC图
参考文献
1 谭生建，等.中国中药杂志，1995；2(20)：99
2 阴 建，等.中药现代研究与临床应用.北京：学苑出版社，1993：382
收稿日期：1999-02-05, 百拇医药(方子季* 纪松岗 林 静 袁锦华 代育存)
单位：海军401医院 青岛 266071
关键词：克白酊；补骨脂素；异补骨脂素；二氯乙烷萃取；HPLC法
克白酊中补骨脂素和异补骨脂素的HPLC测定 摘 要 样品水浴蒸发后以二氯乙烷萃取，采用C18键合柱反相色谱方法，以氯霉素作内标物，测定克白酊中的补骨脂素和异补骨脂素。RSD<2%，线性范围均为10～200μg/mL，补骨脂酊r=0.9999，异补骨脂酊r=0.9999。回收率分别为96.7%和100.3%。
克白酊系海军401医院自制的治疗白癜风系列制剂之一，主要含补骨脂、红花等数种中药，临床应用疗效较好。国内已有补骨脂酊含量测定方法的报道[1]，但克白酊除含补骨脂外，尚含多种其它中药。本文建立了HPLC法测定克白酊中的补骨脂素和异补骨脂素含量的方法。
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1 仪器与试剂
日本岛津公司LC-6A高效液相色谱仪。克白酊：海军401医院制剂室提供。补骨脂素和异补骨脂素对照品：中国药品生物制品检定所提供。氯霉素：青岛医药公司提供。甲醇：紫外光学纯。无水乙醇：分析纯。
对照品贮备液：精密称取105℃干燥至恒重的补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，用无水乙醇配成浓度分别为2.4和2.0mg/mL的溶液，置4℃冰箱备用。
内标贮备液：精密称取氯霉素配制成1.0mg/mL的无水乙醇溶液，置4℃冰箱备用。
2 方法和结果
2.1 色谱条件：大连依利特公司YWG色谱柱(4.6mm×250mm)，大连依利特公司C18保护柱，柱温35℃，流动相甲醇-水(4∶6)，流速1.3mL/min，检测波长295nm，量程0.04AUFS，纸速1 mm/min。
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补骨脂素和异补骨脂素的保留时间分别是15min和17min，分离度1.67，理论板数分别为2 130和3 825，内标峰保留时间是5.4min。
2.2 回归方程的测定：准确配制6种不同浓度对照品无水乙醇溶液(10，20，40，80，160，200 μg/mL)，加适量内标使成80μg/mL，每次进样6μL，进样3次。记录色谱图，求得对照品峰面积为内标物峰面积的关于进样浓度的回归方程。补骨脂素回归方程：Y=2.376×10-2+3.741×10-2X,r=0.9999。异补骨脂素回归方程：Y=3.935×10-2+3.686×10-2X,r=0.9999。
2.3 加样回收率试验：取克白酊25mL 3份，分别加入对照品贮备液适量，按样品测定方法处理并加入内标物后，按样品测定项下方法3份样品各重复测定3次。计算得补骨脂素平均回收率为96.7%，RSD=1.6%，异补骨脂素平均回收率为100.3%，RSD=0.75%。
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2.4 样品测定：精密量取克白酊25mL，水浴蒸干，加水10mL使剩余物混悬，置50mL分液漏斗中，加二氯乙烷萃取，每次15mL，共萃取3次，合并萃取液，水浴蒸干，剩余物分次加入无水乙醇溶解，并移至25mL量瓶中，加入内标液适量使成80mg/mL，加无水乙醇至刻度，摇匀，以干燥滤纸过滤，弃初滤液5 mL取续滤液6μL进样，求得样品峰面积与内标峰面积的比值，代入回归方程计算样品含量。结果见表1。
表1 克白酊含量测定结果(n=3)
品名
批号
补骨脂素
RSD
异补骨脂素
RSD
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(μg/mL)
(%)
(μg/mL)
(%)
补骨脂酊
941004
100.3
1.6
98.7
0.50
补骨脂酊
941004
100.2
, 百拇医药
1.8
100.1
0.81
补骨脂酊
941004
97.5
1.1
99.6
1.20
3 讨论
3.1 作者曾实验水浴蒸干，加水混悬，加氯仿提取法；以及水浴蒸干，加2.5%碳酸钠碱化，加石油醚脱脂后以盐酸中和，再以氯仿提取法[2]；水浴蒸干，以乙醇溶解经中性氧化铝柱层析等方法进行样品的前处理，但均不够理想，柱层析处理虽除去一些杂质峰，但与未经处理酊剂一样在补骨素前有一个含量大的峰，不能完全分离，影响测定结果，而上述二种氯仿提取法，因氯仿提取时易乳化，影响测定结果，测得含量仅为理论量的50%左右，而用本法处理样品含量与理论量相符，且干扰峰少，不影响测定，故选用本法。
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3.2 溶剂的比例若水的比例下降或柱温升高均会使补骨脂素与异补骨脂素的分离度降至1.5以下，影响分离效果。
A-对照品 B-经柱层析 C-经氯仿萃取 D-经二氯乙烷萃取 1-内标 2-补骨脂素 3-异补骨脂素 4-杂质峰
图1 样品HPLC图
参考文献
1 谭生建，等.中国中药杂志，1995；2(20)：99
2 阴 建，等.中药现代研究与临床应用.北京：学苑出版社，1993：382
收稿日期：1999-02-05, 百拇医药(方子季* 纪松岗 林 静 袁锦华 代育存)
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