良恶性肝病C-erbB-2和p53基因表达比较
作者：申延琴 黄致治 吴贤英 孙晞
单位：申延琴 黄致治 吴贤英 汕头大学医学院 病理教研室 广东省汕头市 515031；孙晞 汕头大学医学院 预防医学教研室 广东省汕头市 515031
关键词：肝疾病；肝肿瘤；癌基因；肿瘤抑制基因；基因表达
世界华人消化杂志990905 摘要 目的 了解癌基因C-erbB-2和P53在良恶性肝病中的表达情况，分析其在肝细胞癌癌变过程中发生的作用. 方法 用cDNA-mRNA原位杂交技术和免疫组化对22例肝硬变，11例癌前病变、即肝小细胞非典型增生，35例肝癌及5例正常肝组织进行检测. 结果 C-erbB-2 mRNA的杂交阳性率在正常肝、肝小细胞非典型增生、肝硬变、分化较好肝癌组和分化较差肝癌组分别为0，73%，64%，37%和25%；C-erbB-2蛋白阳性率分别为0，100%，82%，45%和29%. P53 mRNA的杂交阳性率在正常肝、肝小细胞非典型增生(SLCD)、肝硬变、分化较好肝癌组和分化较差肝癌组分别为0，73%，68%，36%和25%；P53蛋白阳性率分别为0，0，0，27%和42%. 蛋白阳性物只见于肝癌细胞. 结论 C-erbB-2癌基因可能在肝癌癌变的早期阶段起作用，主要作用于SLCD、胆管细胞、增生肝细胞. 野生型P53有抗癌作用，突变型P53致癌作用可能发生于肝癌癌变较晚阶段.
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中国图书馆分类号 R 735.7
C-erbB-2 and p53 expressions in benign and malignant liver diseases
SHEN Yan-Qin1, HUANG Zhi-Zhi1, WU Xian-Ying1 and SUN Xi2
1Department of Pathology, and2Department of Preventive Medicine, Shantou University Medical College, Shantou 515031, Guangdong Province, China
Abstract AIM To study the expression of oncogene C-erbB-2 and tumor suppressor gene p53 and their relationship with benign and malignant liver diseases. METHODS In situ hybridization (ISH) and Immunohistochemistry (IHC) were performed in subjects with 5 normal liver, 11 of small liver cell dysplasia (SLCD), 22 liver cirrhosis and 11 well-differenciated hepatocellular carcinoma (HCC) and 24 cases of poorly-differenciated HCC with the cDNA probes and specific antibodies respectively. RESULTS The expression rates of C-erbB-2 mRNA in normal liver, SLCD, liver cirrohosis, well-differenciated HCC and poorly-differenciated HCC were 0, 73%, 64%, 37% and 25% respectively, those of C-erbB-2 protein in these five types of tissues were 0, 100%, 82%, 45% and 29% respectively. The expression rates of P53 mRNA in normal liver, SLCD, liver cirrohosis, well-differenciated HCC and poorly_differenciated HCC were 0, 73%, 68%, 36% and 25% respectively while that of p53 protein in these five types of tissues were 0, 0, 0, 27% and 42% respectively. CONCLUSION C-erbB-2 may play a role in the initial stage of hepatocarcinogenesis. Key points are SLCD proliferate liver cells and bile duct cell. Wild type p53 has antitumor effect whereas mutant p53 play a role in the later stage of hepatocarcinogenesis.
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Subject headings liver diseases; liver neoplasms; oncogene; tumor suppressor gene
0 引言
检测癌基因在良性病变、癌前病变和癌组织的表达，对于了解癌基因在癌变过程中的作用机制有重要意义. 目前认为与肝癌癌变有关的癌基因有7种[1]，C-erbB-2作为一种新的癌基因在肝癌癌变中所起作用位置的确立，有一定争议. 我们选取C-erbB-2癌基因和p53抑癌基因mRNA和蛋白在肝良性病变、癌前病变和癌组织中的表达情况，试图了解它们在肝癌发生中有无作用、作用阶段以及C-erbB-2癌基因和p53基因表达有无相关性.
1 材料和方法
1.1 材料 收集本院病理室和附一院病理室1995/1997手术切除肝癌35例，术前未经任何化疗，经病理检查证实为肝细胞癌. 收集11例肝小细胞非典型增生，22例肝硬变，同时收集5例尸检正常肝组织作对照，标本均经甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片. P53蛋白单克隆抗体(1∶50，Dako公司)和C-erbB-2蛋白多克隆抗体p185(1∶50，Santa Cruz公司). 基因探针均购自北京中山生物公司，地高辛标记. 野生型P53 cDNA探针长500bp，酶切位点BamHⅠ，插入长度1.8 kb. C-erbB-2 cDNA探针，长500bp，酶切位点EcoRⅠ，插入长度1.6 kb.
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1.2 方法 ①切片HE染色，作病理组织学诊断. ②原位杂交：组织切片粘贴于氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理的载玻片上，常规脱蜡、水化、蛋白酶K消化，40 mL/ L多聚甲醛后固定，酸处理，逐级乙醇脱水，预杂交1 h，加地高辛标记的基因探针杂交液杂交，42℃，16 h～20 h，杂交后洗涤、加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，BCIP/NBT避光显色，甲基绿衬染、甘油封片. ③免疫组化：按常规ABC法、DAB显色. 染色前用缓冲液微波预处理. ④结果评定：原位杂交以胞质内出现紫蓝色颗粒为阳性；免疫组化以胞质或核内出现棕黄色颗粒为阳性；阳性物的半定量：每例观察5个有代表性高倍(40X)视野，约500个细胞的阳性细胞百分率. 阳性细胞数低于10%以下者为低度阳性(+)，占10%～30%者为中等阳性(++)，30%以上者为高度阳性(+++).
2 结果
按改良的Edmondson关于肝细胞癌的分级标准[2]和Watanabe的肝细胞非典型增生标准. 73个标本分类如下：正常肝组织5例，肝小细胞性非典型增生(SLCD)11例，肝硬变22例，分化较好肝癌(Edmondson分极Ⅰ，Ⅱ级)11例，分化较差肝癌(Edmondson分级Ⅲ，Ⅳ级)24例.
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2.1 C-erbB-2 mRNA及蛋白检测结果 C-erbB-2 mRNA原位杂交的杂交物为紫蓝色颗粒状，占据细胞全胞质或部分胞质，核阴性. 当杂交物积聚过多，则呈深蓝色. 杂交物分布于增生胆管细胞、肝硬变结节肝细胞(图1)、SLCD细胞和肝癌细胞(图2). c-erbB-2蛋白免疫组化显示的阳性物为棕黄色细颗粒状，按其分布形式可分①全浆型，棕黄色细颗粒状的阳性物充满整个胞质；②胞膜型：其胞膜呈深棕色、而胞质染色较浅，故呈蜂窝状结构(图3). c-erbB-2蛋白阳性物主要分布于SLCD细胞，肝硬变增生肝细胞、胆管细胞和肝癌细胞. 各类肝组织C-erbB-2 mRNA和蛋白的阳性率和阳性程度见表1. C-erbB-2癌基因和蛋白的表达分布规律相似，正常肝组织的均未检测到C-erbB-2 mRNA和蛋白. 在肝硬变、SLCD、分化较好肝癌和分化较差肝癌4种组织中C-erbB-2 mRNA阳性率分别为73%，64%，37%和25%，C-erbB-2蛋白阳性率分别为100%，82%，45%和29%. 这4种病变组的C-erbB-2 mRNA和蛋白的阳性率分布相似，即癌前病变组C-erbB-2 mRNA的阳性率显著高于肝癌组(χ2=9.89，P<0.01). 而癌前病变组C-erbB-2蛋白的阳性率也显著高于肝癌组(χ2=20.58，P<0.01).
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图1 癌旁肝硬变结节和周围胆管. 地高辛标记C-erbB-2 mRNA杂交阳性. 杂交物呈紫蓝色或深蓝色，分布于胆管细胞(↑)和个别肝细胞(
)胞质中原位杂交×132
图2 癌旁SLCD细胞和周围胆管. 地高辛标记C-erbB-2 mRNA杂交阳性. 部分SLCD细胞强阳性(↑)原位杂交×132
图3 癌旁SLCD细胞. C-erbB-2蛋白免疫组化阳性. 全浆型(↑)和胞膜型()ABC×66
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表1 各类肝组织C-erbB-2 mRNA和蛋白的表达 (n=73) 组织类型
n
c-erbB-2 mRNA阳性程度
c-erbB-2蛋白阳性程度
阳性例数
阳性
阳性例数
阳性
-
+
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百分率
-
+
百分率
正常肝组织
5
5
0
0
0
0
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5
0
0
0
0
SLCD
11
3
2
4
2
73
0
5
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3
3
100
肝硬变
22
8
2
6
6
64
4
5
9
4
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82
肝癌组
35
25
9
1
0
29
23
5
6
1
34
分化较好肝癌
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11
7
3
1
0
37
6
1
3
1
45
分化较差肝癌
24
18
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6
0
0
25
17
4
3
0
29
2.2 P53 mRNA和P53蛋白检测结果 P53 mRNA原位杂交物为紫蓝色粗颗粒状或团块状，分布于全胞质或部分胞质，核阴性. 按其杂交物的数量和分布，主要有3种形式：①全胞质型，整个胞质充满紫蓝色颗粒(图4). ②环状型，紫蓝色颗粒分布于胞膜下，呈环状(图5). ③月眉型，紫蓝色颗粒在胞膜下呈局灶性小片状分布，状似月眉，比环状型的颗粒更少. P53 mRNA杂交物主要分布于SLCD细胞，肝硬变增生肝细胞及少量肝癌细胞. P53蛋白免疫组化显示的阳性物为棕色或棕黄色粗颗粒状，分布于核内，胞质阴性. 它们清一色只分布于肝癌细胞中. 细胞分化越差，染色强度越强. (图6).
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图4 癌旁肝硬变结节. 地高辛标记P53 mRNA杂交阳性. 杂交物呈紫蓝色粗颗粒状，分布于肝细胞(↑)全胞质. 原位杂交×132
图5 癌旁肝硬变结节. 地高辛标记P53 mRNA杂交阳性. 呈环状(↑)及月眉状()原位杂交×66
图6 肝细胞癌Ⅲ级. P53蛋白免疫组化，癌细胞核强阳性. ABC ×132
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P53 mRNA和P53蛋白在各类肝组织中表达完全不同(表2). P53 mRNA在正常肝组织不表达，而在良性病变和癌前病变组有很高的阳性率和阳性程度，在肝癌组阳性率较低，阳性程度也较弱. 但P53蛋白在正常肝、良性病变及癌前病变组均不表达，只有在肝癌组才有阳性表达. 而且其阳性程度和癌的分化程度相关，分化越差，P53蛋白阳性程度越强. 经统计，C-erbB-2表达与P53表达之间无相关性.
表2 各类肝组织P53 mRNA和蛋白的表达 (n=73) 组织类型
n
P53 mRNA阳性程度
P53蛋白阳性程度
阳性例数
阳性
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阳性例数
阳性
-
+
百分率
-
+
百分率
正常肝组织
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5
5
0
0
0
0
5
0
0
0
0
SLCD
11
3
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1
2
5
73
11
0
0
0
0
肝硬变
22
7
1
4
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10
68
22
0
0
0
0
肝癌组
35
25
9
0
1
29
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22
4
5
4
37
分化较好肝癌
11
7
4
0
0
36
8
3
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0
0
27
分化较差肝癌
24
18
5
0
1
25
14
1
5
4
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42
3 讨论
3.1 C-erbB-2在肝癌癌变过程中的作用 Coussens et al[3]首次发现C-erbB-2癌基因，它座落在17号染色体长臂，其编码Mr 185 000蛋白产物，是一种跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性，当该蛋白受激活，传递分裂信号，使细胞生长和转化，现已证明：人类一些肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、唾液腺癌的发生，和C-erbB-2高表达有关[4]. 但是C-erbB-2与肝癌癌变发生的关系的研究，为时较晚，对其研究结果仍有争议. Collier et al[5]用Northern blot检测肝癌的C-erbB-2 mRNA， Nakopoulou et al[6]用免疫组化研究肝癌中c-erbB-2蛋白表达，均认为C-erbB-2在肝癌癌变过程中无作用. 但国内苏勤 et al[7]曾对肝细胞癌癌前病变进行研究，他们认为C-erbB-2表达与肝癌发生有关，并且讨论了可能是通过促进小多角形细胞增生向SLCD细胞演进过程中起作用. 本文用原位分子杂交和免疫组化对73个肝切片标本检测C-erbB-2 mRNA和蛋白表达，良性肝病肝硬变中C-erbB-2 mRNA和蛋白阳性率分别为64%和82%，癌前病变SLCD中C-erbB-2 mRNA和蛋白阳性率分别为73%和100%，癌组织中C-erbB-2 mRNA和蛋白阳性率分别为29%和34%.
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C-erbB-2癌基因和蛋白产物的分布，有其规律，无论是原位杂交还是免疫组化所显示的阳性率和阳性程度，都是癌前病变肝组织明显高于肝癌组织. 提示C-erbB-2的致癌作用可能发生在较早期癌的启动阶段，当癌已形成后，C-erbB-2癌基因作用便减弱. 关于C-erbB-2癌基因及其蛋白在肝癌癌变过程中的作用点(细胞)，本文发现，在肝癌癌变过程中，除了SLCD细胞有C-erbB-2 mRNA和蛋白的高表达外，还可见到增生的胆管细胞、肝硬变增生肝细胞，它们都有C-erbB-2 mRNA和蛋白的高表达，而且就其染色阳性强度而言，它们有的还较SLCD更强，因此认为在C-erbB-2致癌过程中，这些细胞可能也是C-erbB-2癌基因及其蛋白的作用点.
3.2 p53基因在肝癌癌变过程中的作用 p53基因位于17号染色体的短臂，正常时以野生型形式存在，当某种原因使p53基因发生突变后，则成为突变型. 野生型p53基因编码的蛋白具有监视细胞基因完整性的功能，能促进损伤的DNA修复，并能通过诱导细胞凋亡而清除癌变倾向的细胞故有抗癌作用[8]. 而突变型P53蛋白，却没有抑癌作用，而且有致癌作用. 现已证明很多人类肿瘤显示p53基因突变或丢失，但其突变率各种肿瘤有很大差异. 野生型P53蛋白因其T1/ 2极短(6min～20min)而无法在免疫组化中显示，突变型P53蛋白T1/ 2延长可在核内积聚而用免疫组化显示，一般认为免疫组化中显示的P53蛋白即为突变型[9]. 因此通过免疫组化检测P53蛋白积聚可间接地反映p53基因突变. 我们利用p53基因探针检测肝硬变，癌前病变SLCD P53 mRNA阳性率高达68%和73%，而且阳性程度很强，该两类肝组织P53免疫组化却为阴性，因此可以推测肝硬变和癌前病变SLCD癌旁非正常肝组织的P53 mRNA杂交物为野生型. 这些癌前病变肝组织的野生型p53基因为何高表达，其机制尚不清楚，Wilcock推测可能是细胞对致癌因子侵袭的自我保护反应[10]，野生型p53基因及其蛋白可以影响G1晚期DNA的修复、促进细胞凋亡、从而清除癌变倾向的细胞，而与致癌因素的损伤相抗衡.
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肝癌组织的P53 mRNA阳性率较低，仅为29%，和该组的免疫组化显示P53蛋白的阳性率(37%)相近，表示肝癌组中有突变型P53，但其突变率较低，推测在肝癌癌变过程中，突变型p53基因是在癌变较晚阶段起作用. 免疫组化显示P53蛋白的阳性细胞，毫无例外只见于肝癌组的癌细胞，而正常肝组织和良性肝硬变，癌前病变SLCD均为阴性，虽然P53蛋白阳性率较低，但它却专一地在肝癌细胞表达，且阳性程度和癌细胞分化相关. 因此P53蛋白可以作为判断肝癌恶性转化的一个指标.注：广东省高教厅重点学科经费资助课题，No.1993-53
通讯作者 申延琴. 515031，广东省汕头市新陵路10号，汕头大学医学院病理教研室.
作者简介：申延琴，女，1971-10-11生，陕西省延安市人，汉族. 1994年延安医学院毕业，1997年汕头大学医学院病理学硕士.
Supported by the Key Discipline of the Higher Education Office of Guangdong Province, China. No.1993-53
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Correspondence to:SHEN Yan-Qin, Department of Pathology, 10 Xinling Road, Shantou 515031. Guangdong Province, China
Tel. +86.754.8551151 Ext 2087， Fax.+86.754.8557562
Email. Yanqinshen@163.net
4 参考文献
1 Gu JR, Chen YQ, Jiang HQ, Xu GW, Liu CT, Hong WN, Zhou XM. A spectrum of activated proto -oncogenes in human primary hepatic cancer-review. Zhongliu, 1988;8:289-291
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2 Kondo F, Hirooka N, Wada K, Kondo Y. Morphological clues for the diagnosis of small hepatocellular carcinomas. Virchows Arch A, 1987;411:15-21
3 Coussens L, Teresa LY, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science, 1985;230:1132-1139
4 McCaan A, Dervan PA, Johnston PA, Gullick WJ, Carney DN. C-erbB-2 oncoprotein expression in primary human tumors. Cancer, 1990;65:88-92
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5 Collier JD, Guo K, Mathew J, May FEB, Bennett MK, Corbett IP, Bassendine MF, Burt AD. C-erbB-2 oncogene expression in hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. J-Hepatol, 1992;14:377-380
6 Nakopoulou L, Stefanaki K, Filaktopoulos D, Glannopoulou I. C-erb-B-2 oncoprotein and epidermal growth factor receptor in human hepatocellular carcinoma: an immunohistochemical study. Histol-Histopath, 1994;9:677-682
7 Su Q, Zhang SX, Yang SJ, Liu J，Liu YF. Precancerous changes in hepatitis B and liver cirrhosis: a morphological and immunohistochemical study. Disi Junyi Daxue Xuebao，1995；16：85-88
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8 Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 1991;351:453-456
9 Zheng J, Wu BQ. Advancement of p53 gene research-review. Zhonghua Binglixue Zazhi, 1997;26:251-254
10 Wilcock D, Lane DP. Localization of p53, retinoblastoma and host replication proteins at sites of viral replication in herpes-infected cells. Nature, 1991;349:429-431
收稿日期 1999-04-15 修回日期 1999-07-01, 百拇医药
单位：申延琴 黄致治 吴贤英 汕头大学医学院 病理教研室 广东省汕头市 515031；孙晞 汕头大学医学院 预防医学教研室 广东省汕头市 515031
关键词：肝疾病；肝肿瘤；癌基因；肿瘤抑制基因；基因表达
世界华人消化杂志990905 摘要 目的 了解癌基因C-erbB-2和P53在良恶性肝病中的表达情况，分析其在肝细胞癌癌变过程中发生的作用. 方法 用cDNA-mRNA原位杂交技术和免疫组化对22例肝硬变，11例癌前病变、即肝小细胞非典型增生，35例肝癌及5例正常肝组织进行检测. 结果 C-erbB-2 mRNA的杂交阳性率在正常肝、肝小细胞非典型增生、肝硬变、分化较好肝癌组和分化较差肝癌组分别为0，73%，64%，37%和25%；C-erbB-2蛋白阳性率分别为0，100%，82%，45%和29%. P53 mRNA的杂交阳性率在正常肝、肝小细胞非典型增生(SLCD)、肝硬变、分化较好肝癌组和分化较差肝癌组分别为0，73%，68%，36%和25%；P53蛋白阳性率分别为0，0，0，27%和42%. 蛋白阳性物只见于肝癌细胞. 结论 C-erbB-2癌基因可能在肝癌癌变的早期阶段起作用，主要作用于SLCD、胆管细胞、增生肝细胞. 野生型P53有抗癌作用，突变型P53致癌作用可能发生于肝癌癌变较晚阶段.
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中国图书馆分类号 R 735.7
C-erbB-2 and p53 expressions in benign and malignant liver diseases
SHEN Yan-Qin1, HUANG Zhi-Zhi1, WU Xian-Ying1 and SUN Xi2
1Department of Pathology, and2Department of Preventive Medicine, Shantou University Medical College, Shantou 515031, Guangdong Province, China
Abstract AIM To study the expression of oncogene C-erbB-2 and tumor suppressor gene p53 and their relationship with benign and malignant liver diseases. METHODS In situ hybridization (ISH) and Immunohistochemistry (IHC) were performed in subjects with 5 normal liver, 11 of small liver cell dysplasia (SLCD), 22 liver cirrhosis and 11 well-differenciated hepatocellular carcinoma (HCC) and 24 cases of poorly-differenciated HCC with the cDNA probes and specific antibodies respectively. RESULTS The expression rates of C-erbB-2 mRNA in normal liver, SLCD, liver cirrohosis, well-differenciated HCC and poorly-differenciated HCC were 0, 73%, 64%, 37% and 25% respectively, those of C-erbB-2 protein in these five types of tissues were 0, 100%, 82%, 45% and 29% respectively. The expression rates of P53 mRNA in normal liver, SLCD, liver cirrohosis, well-differenciated HCC and poorly_differenciated HCC were 0, 73%, 68%, 36% and 25% respectively while that of p53 protein in these five types of tissues were 0, 0, 0, 27% and 42% respectively. CONCLUSION C-erbB-2 may play a role in the initial stage of hepatocarcinogenesis. Key points are SLCD proliferate liver cells and bile duct cell. Wild type p53 has antitumor effect whereas mutant p53 play a role in the later stage of hepatocarcinogenesis.
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0 引言
检测癌基因在良性病变、癌前病变和癌组织的表达，对于了解癌基因在癌变过程中的作用机制有重要意义. 目前认为与肝癌癌变有关的癌基因有7种[1]，C-erbB-2作为一种新的癌基因在肝癌癌变中所起作用位置的确立，有一定争议. 我们选取C-erbB-2癌基因和p53抑癌基因mRNA和蛋白在肝良性病变、癌前病变和癌组织中的表达情况，试图了解它们在肝癌发生中有无作用、作用阶段以及C-erbB-2癌基因和p53基因表达有无相关性.
1 材料和方法
1.1 材料 收集本院病理室和附一院病理室1995/1997手术切除肝癌35例，术前未经任何化疗，经病理检查证实为肝细胞癌. 收集11例肝小细胞非典型增生，22例肝硬变，同时收集5例尸检正常肝组织作对照，标本均经甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片. P53蛋白单克隆抗体(1∶50，Dako公司)和C-erbB-2蛋白多克隆抗体p185(1∶50，Santa Cruz公司). 基因探针均购自北京中山生物公司，地高辛标记. 野生型P53 cDNA探针长500bp，酶切位点BamHⅠ，插入长度1.8 kb. C-erbB-2 cDNA探针，长500bp，酶切位点EcoRⅠ，插入长度1.6 kb.
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1.2 方法 ①切片HE染色，作病理组织学诊断. ②原位杂交：组织切片粘贴于氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理的载玻片上，常规脱蜡、水化、蛋白酶K消化，40 mL/ L多聚甲醛后固定，酸处理，逐级乙醇脱水，预杂交1 h，加地高辛标记的基因探针杂交液杂交，42℃，16 h～20 h，杂交后洗涤、加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，BCIP/NBT避光显色，甲基绿衬染、甘油封片. ③免疫组化：按常规ABC法、DAB显色. 染色前用缓冲液微波预处理. ④结果评定：原位杂交以胞质内出现紫蓝色颗粒为阳性；免疫组化以胞质或核内出现棕黄色颗粒为阳性；阳性物的半定量：每例观察5个有代表性高倍(40X)视野，约500个细胞的阳性细胞百分率. 阳性细胞数低于10%以下者为低度阳性(+)，占10%～30%者为中等阳性(++)，30%以上者为高度阳性(+++).
2 结果
按改良的Edmondson关于肝细胞癌的分级标准[2]和Watanabe的肝细胞非典型增生标准. 73个标本分类如下：正常肝组织5例，肝小细胞性非典型增生(SLCD)11例，肝硬变22例，分化较好肝癌(Edmondson分极Ⅰ，Ⅱ级)11例，分化较差肝癌(Edmondson分级Ⅲ，Ⅳ级)24例.
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2.1 C-erbB-2 mRNA及蛋白检测结果 C-erbB-2 mRNA原位杂交的杂交物为紫蓝色颗粒状，占据细胞全胞质或部分胞质，核阴性. 当杂交物积聚过多，则呈深蓝色. 杂交物分布于增生胆管细胞、肝硬变结节肝细胞(图1)、SLCD细胞和肝癌细胞(图2). c-erbB-2蛋白免疫组化显示的阳性物为棕黄色细颗粒状，按其分布形式可分①全浆型，棕黄色细颗粒状的阳性物充满整个胞质；②胞膜型：其胞膜呈深棕色、而胞质染色较浅，故呈蜂窝状结构(图3). c-erbB-2蛋白阳性物主要分布于SLCD细胞，肝硬变增生肝细胞、胆管细胞和肝癌细胞. 各类肝组织C-erbB-2 mRNA和蛋白的阳性率和阳性程度见表1. C-erbB-2癌基因和蛋白的表达分布规律相似，正常肝组织的均未检测到C-erbB-2 mRNA和蛋白. 在肝硬变、SLCD、分化较好肝癌和分化较差肝癌4种组织中C-erbB-2 mRNA阳性率分别为73%，64%，37%和25%，C-erbB-2蛋白阳性率分别为100%，82%，45%和29%. 这4种病变组的C-erbB-2 mRNA和蛋白的阳性率分布相似，即癌前病变组C-erbB-2 mRNA的阳性率显著高于肝癌组(χ2=9.89，P<0.01). 而癌前病变组C-erbB-2蛋白的阳性率也显著高于肝癌组(χ2=20.58，P<0.01).
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图1 癌旁肝硬变结节和周围胆管. 地高辛标记C-erbB-2 mRNA杂交阳性. 杂交物呈紫蓝色或深蓝色，分布于胆管细胞(↑)和个别肝细胞(
)胞质中原位杂交×132图2 癌旁SLCD细胞和周围胆管. 地高辛标记C-erbB-2 mRNA杂交阳性. 部分SLCD细胞强阳性(↑)原位杂交×132
图3 癌旁SLCD细胞. C-erbB-2蛋白免疫组化阳性. 全浆型(↑)和胞膜型(
)ABC×66, http://www.100md.com
表1 各类肝组织C-erbB-2 mRNA和蛋白的表达 (n=73) 组织类型
n
c-erbB-2 mRNA阳性程度
c-erbB-2蛋白阳性程度
阳性例数
阳性
阳性例数
阳性
-
+
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百分率
-
+
百分率
正常肝组织
5
5
0
0
0
0
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5
0
0
0
0
SLCD
11
3
2
4
2
73
0
5
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3
3
100
肝硬变
22
8
2
6
6
64
4
5
9
4
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82
肝癌组
35
25
9
1
0
29
23
5
6
1
34
分化较好肝癌
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11
7
3
1
0
37
6
1
3
1
45
分化较差肝癌
24
18
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6
0
0
25
17
4
3
0
29
2.2 P53 mRNA和P53蛋白检测结果 P53 mRNA原位杂交物为紫蓝色粗颗粒状或团块状，分布于全胞质或部分胞质，核阴性. 按其杂交物的数量和分布，主要有3种形式：①全胞质型，整个胞质充满紫蓝色颗粒(图4). ②环状型，紫蓝色颗粒分布于胞膜下，呈环状(图5). ③月眉型，紫蓝色颗粒在胞膜下呈局灶性小片状分布，状似月眉，比环状型的颗粒更少. P53 mRNA杂交物主要分布于SLCD细胞，肝硬变增生肝细胞及少量肝癌细胞. P53蛋白免疫组化显示的阳性物为棕色或棕黄色粗颗粒状，分布于核内，胞质阴性. 它们清一色只分布于肝癌细胞中. 细胞分化越差，染色强度越强. (图6).
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图4 癌旁肝硬变结节. 地高辛标记P53 mRNA杂交阳性. 杂交物呈紫蓝色粗颗粒状，分布于肝细胞(↑)全胞质. 原位杂交×132
图5 癌旁肝硬变结节. 地高辛标记P53 mRNA杂交阳性. 呈环状(↑)及月眉状(
)原位杂交×66图6 肝细胞癌Ⅲ级. P53蛋白免疫组化，癌细胞核强阳性. ABC ×132
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P53 mRNA和P53蛋白在各类肝组织中表达完全不同(表2). P53 mRNA在正常肝组织不表达，而在良性病变和癌前病变组有很高的阳性率和阳性程度，在肝癌组阳性率较低，阳性程度也较弱. 但P53蛋白在正常肝、良性病变及癌前病变组均不表达，只有在肝癌组才有阳性表达. 而且其阳性程度和癌的分化程度相关，分化越差，P53蛋白阳性程度越强. 经统计，C-erbB-2表达与P53表达之间无相关性.
表2 各类肝组织P53 mRNA和蛋白的表达 (n=73) 组织类型
n
P53 mRNA阳性程度
P53蛋白阳性程度
阳性例数
阳性
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阳性例数
阳性
-
+
百分率
-
+
百分率
正常肝组织
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5
5
0
0
0
0
5
0
0
0
0
SLCD
11
3
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1
2
5
73
11
0
0
0
0
肝硬变
22
7
1
4
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10
68
22
0
0
0
0
肝癌组
35
25
9
0
1
29
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22
4
5
4
37
分化较好肝癌
11
7
4
0
0
36
8
3
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0
0
27
分化较差肝癌
24
18
5
0
1
25
14
1
5
4
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42
3 讨论
3.1 C-erbB-2在肝癌癌变过程中的作用 Coussens et al[3]首次发现C-erbB-2癌基因，它座落在17号染色体长臂，其编码Mr 185 000蛋白产物，是一种跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性，当该蛋白受激活，传递分裂信号，使细胞生长和转化，现已证明：人类一些肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、唾液腺癌的发生，和C-erbB-2高表达有关[4]. 但是C-erbB-2与肝癌癌变发生的关系的研究，为时较晚，对其研究结果仍有争议. Collier et al[5]用Northern blot检测肝癌的C-erbB-2 mRNA， Nakopoulou et al[6]用免疫组化研究肝癌中c-erbB-2蛋白表达，均认为C-erbB-2在肝癌癌变过程中无作用. 但国内苏勤 et al[7]曾对肝细胞癌癌前病变进行研究，他们认为C-erbB-2表达与肝癌发生有关，并且讨论了可能是通过促进小多角形细胞增生向SLCD细胞演进过程中起作用. 本文用原位分子杂交和免疫组化对73个肝切片标本检测C-erbB-2 mRNA和蛋白表达，良性肝病肝硬变中C-erbB-2 mRNA和蛋白阳性率分别为64%和82%，癌前病变SLCD中C-erbB-2 mRNA和蛋白阳性率分别为73%和100%，癌组织中C-erbB-2 mRNA和蛋白阳性率分别为29%和34%.
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C-erbB-2癌基因和蛋白产物的分布，有其规律，无论是原位杂交还是免疫组化所显示的阳性率和阳性程度，都是癌前病变肝组织明显高于肝癌组织. 提示C-erbB-2的致癌作用可能发生在较早期癌的启动阶段，当癌已形成后，C-erbB-2癌基因作用便减弱. 关于C-erbB-2癌基因及其蛋白在肝癌癌变过程中的作用点(细胞)，本文发现，在肝癌癌变过程中，除了SLCD细胞有C-erbB-2 mRNA和蛋白的高表达外，还可见到增生的胆管细胞、肝硬变增生肝细胞，它们都有C-erbB-2 mRNA和蛋白的高表达，而且就其染色阳性强度而言，它们有的还较SLCD更强，因此认为在C-erbB-2致癌过程中，这些细胞可能也是C-erbB-2癌基因及其蛋白的作用点.
3.2 p53基因在肝癌癌变过程中的作用 p53基因位于17号染色体的短臂，正常时以野生型形式存在，当某种原因使p53基因发生突变后，则成为突变型. 野生型p53基因编码的蛋白具有监视细胞基因完整性的功能，能促进损伤的DNA修复，并能通过诱导细胞凋亡而清除癌变倾向的细胞故有抗癌作用[8]. 而突变型P53蛋白，却没有抑癌作用，而且有致癌作用. 现已证明很多人类肿瘤显示p53基因突变或丢失，但其突变率各种肿瘤有很大差异. 野生型P53蛋白因其T1/ 2极短(6min～20min)而无法在免疫组化中显示，突变型P53蛋白T1/ 2延长可在核内积聚而用免疫组化显示，一般认为免疫组化中显示的P53蛋白即为突变型[9]. 因此通过免疫组化检测P53蛋白积聚可间接地反映p53基因突变. 我们利用p53基因探针检测肝硬变，癌前病变SLCD P53 mRNA阳性率高达68%和73%，而且阳性程度很强，该两类肝组织P53免疫组化却为阴性，因此可以推测肝硬变和癌前病变SLCD癌旁非正常肝组织的P53 mRNA杂交物为野生型. 这些癌前病变肝组织的野生型p53基因为何高表达，其机制尚不清楚，Wilcock推测可能是细胞对致癌因子侵袭的自我保护反应[10]，野生型p53基因及其蛋白可以影响G1晚期DNA的修复、促进细胞凋亡、从而清除癌变倾向的细胞，而与致癌因素的损伤相抗衡.
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肝癌组织的P53 mRNA阳性率较低，仅为29%，和该组的免疫组化显示P53蛋白的阳性率(37%)相近，表示肝癌组中有突变型P53，但其突变率较低，推测在肝癌癌变过程中，突变型p53基因是在癌变较晚阶段起作用. 免疫组化显示P53蛋白的阳性细胞，毫无例外只见于肝癌组的癌细胞，而正常肝组织和良性肝硬变，癌前病变SLCD均为阴性，虽然P53蛋白阳性率较低，但它却专一地在肝癌细胞表达，且阳性程度和癌细胞分化相关. 因此P53蛋白可以作为判断肝癌恶性转化的一个指标.注：广东省高教厅重点学科经费资助课题，No.1993-53
通讯作者 申延琴. 515031，广东省汕头市新陵路10号，汕头大学医学院病理教研室.
作者简介：申延琴，女，1971-10-11生，陕西省延安市人，汉族. 1994年延安医学院毕业，1997年汕头大学医学院病理学硕士.
Supported by the Key Discipline of the Higher Education Office of Guangdong Province, China. No.1993-53
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Correspondence to:SHEN Yan-Qin, Department of Pathology, 10 Xinling Road, Shantou 515031. Guangdong Province, China
Tel. +86.754.8551151 Ext 2087， Fax.+86.754.8557562
Email. Yanqinshen@163.net
4 参考文献
1 Gu JR, Chen YQ, Jiang HQ, Xu GW, Liu CT, Hong WN, Zhou XM. A spectrum of activated proto -oncogenes in human primary hepatic cancer-review. Zhongliu, 1988;8:289-291
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2 Kondo F, Hirooka N, Wada K, Kondo Y. Morphological clues for the diagnosis of small hepatocellular carcinomas. Virchows Arch A, 1987;411:15-21
3 Coussens L, Teresa LY, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science, 1985;230:1132-1139
4 McCaan A, Dervan PA, Johnston PA, Gullick WJ, Carney DN. C-erbB-2 oncoprotein expression in primary human tumors. Cancer, 1990;65:88-92
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5 Collier JD, Guo K, Mathew J, May FEB, Bennett MK, Corbett IP, Bassendine MF, Burt AD. C-erbB-2 oncogene expression in hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma. J-Hepatol, 1992;14:377-380
6 Nakopoulou L, Stefanaki K, Filaktopoulos D, Glannopoulou I. C-erb-B-2 oncoprotein and epidermal growth factor receptor in human hepatocellular carcinoma: an immunohistochemical study. Histol-Histopath, 1994;9:677-682
7 Su Q, Zhang SX, Yang SJ, Liu J，Liu YF. Precancerous changes in hepatitis B and liver cirrhosis: a morphological and immunohistochemical study. Disi Junyi Daxue Xuebao，1995；16：85-88
, http://www.100md.com
8 Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 1991;351:453-456
9 Zheng J, Wu BQ. Advancement of p53 gene research-review. Zhonghua Binglixue Zazhi, 1997;26:251-254
10 Wilcock D, Lane DP. Localization of p53, retinoblastoma and host replication proteins at sites of viral replication in herpes-infected cells. Nature, 1991;349:429-431
收稿日期 1999-04-15 修回日期 1999-07-01, 百拇医药