琼脂糖凝胶电泳检测尿粘多糖方法的建立
作者：林群娣 光炜 蒋玮莹
单位：中山医科大学遗传学教研室(510089)
关键词：粘多糖贮积症；溶酶体病；临床检验
广东医学990919 【摘要】 目的 建立一种简便、快速、准确、易于推广应用的粘多糖贮积症的诊断方法。方法 采用琼脂糖凝胶电泳，以硫酸皮肤素(DS)及硫酸软骨素(CS)为标准对照，检出患者尿中的粘多糖。结果 在323名疑诊病人中检出阳性者96例，与临床相符合。结论 本法可作为临床上粘多糖贮积症的初步诊断及初步分型的方法。
粘多糖贮积症(简称MPS)是一组属于溶酶体病的遗传代谢病。该症由于体内催化粘多糖(GAG)降解的特异性溶酶体水解酶的缺乏或失活，导致分解不完全的粘多糖逐渐贮存在的各组织细胞体内，造成多器官多组织的功能损害。临床特征主要为生长发育迟缓、骨骼畸形和进行性智力障碍。MPS的诊断主要依赖于临床表现、X线检查、病理改变并结合实验室检查。实验室检查中尿粘多糖检测是最常用的简便方法。作者在以Rufini等[1]检测尿粘多糖方法的基础上，加以修改，建立了我室尿粘多糖的检测方法，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 临床疑是MPS的患儿，留晨新鲜中段尿于消毒试管中，离心5 min(3 000 r/min)，取上清30 μL供点样用。
1.2 试剂 磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，琼脂糖，甲苯胺蓝，醋酸等试剂，均为国产分析纯，硫酸皮肤素(DS)及硫酸软骨素(CS)标准参照品均购自Sigma公司。
1.3 方法 0.06 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7):取Na2HPO4 21.5 g,KH2PO4 8.16 g，蒸馏水溶解至1 000 mL。染色液：甲苯胺蓝0.5 g,用20 mL甲醇研磨，溶解后，加5%醋酸至100 mL备用。0.6%琼脂糖凝胶：称取0.6 g琼脂糖加0.06 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7) 100 mL，微波炉2 min煮沸溶解。电泳：用有机玻璃板，制成约2 mm厚的胶，依次加入病人标本及硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)标准对照物各30 μL，点样，用三层纱布搭桥，点样处为负极，电压：15 V/cm，电泳2 h，取胶用甲苯胺蓝染色5 min，H2O漂洗，再用5%醋酸漂洗至区带清晰为止。根据标准参照物泳动位置确定尿粘多糖性质，根据区带与标准参照物间着色深浅判断尿粘多糖多少：如无区带为(-)，区带色浅于标准为(±)，相等为(+)，色深于标准为(++)。
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2 结果
自1995年1月～1998年6月，我们检测了中山医科大学附属第一医院儿科门诊MPS疑诊病人共99个家系323人，其中少儿135人。结果检出尿GAG(+ +)20例，(+)64例，(±)12例，(-)227例。
3 讨论
MPS现分为6型，除Ⅱ型为X连锁隐性遗传外，余各型均为常染色体隐性遗传。其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅶ型，尿GAG为DS+HS，Ⅲ型为HS，Ⅳ型为KS，Ⅵ型为DS[2]。由于正常情况下，粘多糖可被相应的水解酶降解，故尿中粘多糖检测为阴性。只有当相应酶缺陷或活性下降，以致不完全降解的粘多糖在体内贮积，最终从尿中排出，致尿中粘多糖检测阳性。因此，如尿GAG阳性，则间接反应粘多糖水解酶缺乏或活性下降。由于不同酶缺陷导致降解产物不同，故可根据尿中GAG的不同，进行初步分型及诊断[3]。根据作者检测结果，初步认为广东省MPS以Ⅰ型、Ⅱ型为多。
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MPS病实验室诊断方法有：酶活性检测、35S掺入法、尿粘多糖检测及基因诊断。其中前两者可确定诊断，但检测方法繁杂，试剂昂贵，仪器设备要求高，难以在基层实验室推广应用。基因诊断的方法国内尚未建立。尿粘多糖检测，取材方便，操作简单，灵敏度高，可协助临床进行分型及诊断，便于推广应用，亦可作为基因诊断前的常规检查[4，5]。
4 参考文献
1 Rufini S, Ghebregzabher M, Castellucci G, et al. A new screening test for the diagnosis of mucopolysaccharidoses. Clin Chim Acta, 1979, 95(3):443
2 杜传书，刘祖洞，主编.医学遗传学.第2版.北京：人民卫生出版社，1992.475～479
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3 Engle J, Safi HJ, Abbassi O, et al. Mucopolysaccharidosis presenting as pediatric multiple aortic aneurysm: first reported case. J Vasc Surg, 1997, 26(4):704
4 Levin TL, Berdon WE, Lachman RS, et al. Lurmbar gibbus in storage diseases and bone dysplasias. Pediatr Radiol, 1997, 27(4):289
5 Stone JE. Urine analysis in the diagnosis of mucopolysaccharide disorders. Ann Clin Biochem, 1998, 35(Pt 2):207, 百拇医药
单位：中山医科大学遗传学教研室(510089)
关键词：粘多糖贮积症；溶酶体病；临床检验
广东医学990919 【摘要】 目的 建立一种简便、快速、准确、易于推广应用的粘多糖贮积症的诊断方法。方法 采用琼脂糖凝胶电泳，以硫酸皮肤素(DS)及硫酸软骨素(CS)为标准对照，检出患者尿中的粘多糖。结果 在323名疑诊病人中检出阳性者96例，与临床相符合。结论 本法可作为临床上粘多糖贮积症的初步诊断及初步分型的方法。
粘多糖贮积症(简称MPS)是一组属于溶酶体病的遗传代谢病。该症由于体内催化粘多糖(GAG)降解的特异性溶酶体水解酶的缺乏或失活，导致分解不完全的粘多糖逐渐贮存在的各组织细胞体内，造成多器官多组织的功能损害。临床特征主要为生长发育迟缓、骨骼畸形和进行性智力障碍。MPS的诊断主要依赖于临床表现、X线检查、病理改变并结合实验室检查。实验室检查中尿粘多糖检测是最常用的简便方法。作者在以Rufini等[1]检测尿粘多糖方法的基础上，加以修改，建立了我室尿粘多糖的检测方法，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 临床疑是MPS的患儿，留晨新鲜中段尿于消毒试管中，离心5 min(3 000 r/min)，取上清30 μL供点样用。
1.2 试剂 磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，琼脂糖，甲苯胺蓝，醋酸等试剂，均为国产分析纯，硫酸皮肤素(DS)及硫酸软骨素(CS)标准参照品均购自Sigma公司。
1.3 方法 0.06 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7):取Na2HPO4 21.5 g,KH2PO4 8.16 g，蒸馏水溶解至1 000 mL。染色液：甲苯胺蓝0.5 g,用20 mL甲醇研磨，溶解后，加5%醋酸至100 mL备用。0.6%琼脂糖凝胶：称取0.6 g琼脂糖加0.06 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7) 100 mL，微波炉2 min煮沸溶解。电泳：用有机玻璃板，制成约2 mm厚的胶，依次加入病人标本及硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)标准对照物各30 μL，点样，用三层纱布搭桥，点样处为负极，电压：15 V/cm，电泳2 h，取胶用甲苯胺蓝染色5 min，H2O漂洗，再用5%醋酸漂洗至区带清晰为止。根据标准参照物泳动位置确定尿粘多糖性质，根据区带与标准参照物间着色深浅判断尿粘多糖多少：如无区带为(-)，区带色浅于标准为(±)，相等为(+)，色深于标准为(++)。
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2 结果
自1995年1月～1998年6月，我们检测了中山医科大学附属第一医院儿科门诊MPS疑诊病人共99个家系323人，其中少儿135人。结果检出尿GAG(+ +)20例，(+)64例，(±)12例，(-)227例。
3 讨论
MPS现分为6型，除Ⅱ型为X连锁隐性遗传外，余各型均为常染色体隐性遗传。其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅶ型，尿GAG为DS+HS，Ⅲ型为HS，Ⅳ型为KS，Ⅵ型为DS[2]。由于正常情况下，粘多糖可被相应的水解酶降解，故尿中粘多糖检测为阴性。只有当相应酶缺陷或活性下降，以致不完全降解的粘多糖在体内贮积，最终从尿中排出，致尿中粘多糖检测阳性。因此，如尿GAG阳性，则间接反应粘多糖水解酶缺乏或活性下降。由于不同酶缺陷导致降解产物不同，故可根据尿中GAG的不同，进行初步分型及诊断[3]。根据作者检测结果，初步认为广东省MPS以Ⅰ型、Ⅱ型为多。
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MPS病实验室诊断方法有：酶活性检测、35S掺入法、尿粘多糖检测及基因诊断。其中前两者可确定诊断，但检测方法繁杂，试剂昂贵，仪器设备要求高，难以在基层实验室推广应用。基因诊断的方法国内尚未建立。尿粘多糖检测，取材方便，操作简单，灵敏度高，可协助临床进行分型及诊断，便于推广应用，亦可作为基因诊断前的常规检查[4，5]。
4 参考文献
1 Rufini S, Ghebregzabher M, Castellucci G, et al. A new screening test for the diagnosis of mucopolysaccharidoses. Clin Chim Acta, 1979, 95(3):443
2 杜传书，刘祖洞，主编.医学遗传学.第2版.北京：人民卫生出版社，1992.475～479
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3 Engle J, Safi HJ, Abbassi O, et al. Mucopolysaccharidosis presenting as pediatric multiple aortic aneurysm: first reported case. J Vasc Surg, 1997, 26(4):704
4 Levin TL, Berdon WE, Lachman RS, et al. Lurmbar gibbus in storage diseases and bone dysplasias. Pediatr Radiol, 1997, 27(4):289
5 Stone JE. Urine analysis in the diagnosis of mucopolysaccharide disorders. Ann Clin Biochem, 1998, 35(Pt 2):207, 百拇医药