中心血站献血员细小病毒B19>/sub>感染状况*
作者：蔡定邦 郭亮 冼炳培 陈享 文忠 梅敏 周丹
单位：蔡定邦 陈享 文忠 梅敏 周丹 肇庆市第一人民医院(526021)；郭亮 青岛市人民医院(266001)；冼炳培 肇庆市中心血站(526000)
关键词：细小病毒B19；巢式聚合酶链反应；献血员
广东医学990903 【摘要】 目的 人类细小病毒B19与人类疾病密切相关，为确保输血安全，防止病毒传递，而探讨献血员B19感染状况。方法 采用巢式聚合酶链反应(PCR)技术分别对肇庆市中心血站374例献血员，肇庆市411例正常新生儿，186例正常婴幼儿，以及691例正常孕妇静脉血检测B19DNA。结果 献血员组静脉血中B19DNA阳性19例，阳性检出率为5.08%。其中，A型93例阳性率为6/93，即6.45%；B型58例阳性率为2/58，即3.45%；AB型44例阳性率为6/44，即13.64%；O型179例阳性率为5/179，即2.79%。正常新生儿B19阳性44例，阳性检出率为10.70%；正常婴幼儿阳性11例，阳性检出率为5.91%；正常孕妇阳性71例，阳性检出率为10.27%。结论 中心血站献血员正常状态下B19感染低于正常孕妇和小儿，但仍有5.08%检出B19病毒DNA，所以为确保输血安全，建议应在输血前筛查检除含有B19的血液。不同血型其B19阳性检出率有显著差别，初步认为与含红细胞抗原的不同及与抗A抗体有一定关连，尚需待进一步探索。
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Human parvovirus B19 infection in blood donors
Cai Dingbang， Guo Liang， Xian Bingpei, et al. The First people′s Hospital of Zhaoqing, Zhaoqing 526021
【Abstract】 Objective To investigate human parvovirus B19 infection in blood donors, newborns, children and pregnant women, in order to prevent the virus from transmission during blood transfusion.Methods Serum B19 DNA was detected by nested polymerase chain reaction in 374 blood donors, 411 normal newborns, 186 normal children and 691 normal pregnant women. Results The positive rates of parvovirus B19 DNA infection was 5.08% in blood donors, 6.45% (6/93) in A type blood, 3.45%(2/58) in B type blood, 13.64%(6/44) in AB type blood, 2.79%(5/179) in O type blood, 10.70% in normal newborns, 5.91% in normal children, 10.27% in normal pregnant women respectively. Conclusion Although the positive rate of human parvovirus B19 infection in blood donors (5.08%) is lower than that in normal newborns, children and pregnant women, it is still necessary to detect serum B19 DNA of donors before blood transfusion. The infection rate of parvovirus B19 is different from each blood type. This is probably related to RBC antigen and anti-A antibody.
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【Key words】 Parvovirus B19 Nested polymerase chain reaction Blood donor
人类细小病毒B19(human parvovirus B19 ，B19)与人类疾病密切相关，可引起传染性红斑、再生障碍性贫血危象、慢性纯红细胞再生障碍性贫血、关节炎、紫癜等多种儿童疾病；近年来与B19感染有关的疾病谱还在不断扩大，如过敏性紫癜、粒细胞减少症、噬血细胞综合征等，严重的儿童疾病，尤其是溶血性贫血、再障危象等[1] 。输血是常采取的治疗应急措施，献血员血液中B19感染状况，值得探讨研究。我们采用巢式PCR方法检测374例肇庆中心血站献血员B19感染状况，现报道如下。
1 对象与方法
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1.1 对象 献血员组：共374例，为1996年11月～1997年12月肇庆市中心血站献血员，男340例，女34例。年龄18～50岁，平均36.0±8.0岁。所有献血员均为正常的成人，采血前例行体检及血常规、血生化检测(包括谷丙转氨酶、乙肝表面抗原、丙肝抗体、爱滋病抗体、梅毒抗体)无异常且符合献血条件者。血型类别：为ABO体系血型，其中A型血93例，B型血58例，O型血179例，AB型血44例。正常新生儿组：共411例，为同期肇庆市足月顺产正常新生儿，男231例，女180例。正常婴幼儿童组：共186例，为同期肇庆市体检正常婴幼儿童，男96例，女90例。年龄1个月～15岁，平均7.8±3.6岁。正常孕妇组691例，为同期肇庆市产前检查无异常的孕妇，年龄20～38岁，平均27.0±3.0岁。胎龄26～39周，平均31.0±2.5周。
1.2 方法 巢式PCR法。
1.2.1 标本采集 取指端或肘静脉血、置于干净密封小容器Eppendof管中，采血过程注意消毒及防止污染。
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1.2.2 检测方法 ①材料Taq-DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液，MgCl2等，试剂均购自Promega公司，引物亦由上海Promega公司合成，序列如下：
A1 ：5′AATGAAAACTTTCCATTTAATGA 3′，B1 ：5′TCCTGAACTGGTCCCGGGGATGG 3′，A2 ：5′GCGTGGAAGTGTAGCTGTGCC 3′，B2 ：5′CAGAGCTTTCACCACCACTGC 3′。
1.2.3 标本处理 无菌采取标本的制备及DNA抽提采用Chelex裂解煮沸法进行。
1.2.4 巢式PCR反应过程 反应体积为50 μL，内含1×PCR缓冲液，1.25 mmol MgCl2 ，200 μmol dNTP；第1次PCR过程的引物为A1、 B1量为100 ng，2.5 u Taq-DNA聚合酶及5 μL处理后的标本DNA。PCR反应条件为热起动5 min后转入循环，循环参数为93℃ 1 min，56℃ 45 s，72℃ 20 s；共35个循环。第2次PCR过程的反应条件同第1次，但引物为A2、B2，模板为5 μL第1次PCR的产物。第1次PCR反应的产物长度为590 bp，第2次PCR反应的产物长度为355 bp，第2次PCR反应结束后取反应产物20 μL，进行琼脂糖电泳，同时做PCR Marker电泳，标本有355 bp左右产物者视为阳性结果。
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2 结果
2.1 献血员B19检测结果 见表1。
表1 374例献血员静脉血B19DNA检测结果 组别
红细胞抗原
血清中抗体
例数
B19DNA阳性
例
%*
A型
A
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抗B
93
6
6.45
B型
B
抗A
58
2
3.45
AB型
A，B
无
44
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6
13.64
O型
无A，无B
抗A+B
179
5
2.79
合计
374
19
5.08
*df=3,χ2＝9.447,P<0.05
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2.2 献血员、正常新生儿、婴幼儿、孕妇组B19阳性率比较 见表2。献血员组B19阳性率检出率非常显著低于新生儿(χ2＝8.30，P<0.01)，亦非常显著低于正常孕妇组(χ2＝8.45，P<0.01)。表2 肇庆地区正常人1 662例B19检测阳性率比较 组别
例数
B19DNA阳性例数
阳性检出率(%)
新生儿
411
44
10.70
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婴幼儿
186
11
5.91
孕妇
691
71
10.27
献血员
374
19
5.08
3 讨论
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3.1 检测献血员中B19的意义 自1900年Landsteiner发现ABO血型系统，1916年Rous等创立血液抗凝保存液以来，输血已成为临床治疗的一种技术。到了70年代，进入了成分输血的新时代，输血应用广泛，较之以往疗效更高，不良反应减少而血液各种组成得以综合利用。而输血所引起的不良反应，细菌与病毒污染血液而传递疾病则引起人们高度关注，并采取了许多有力的防治措施。对献血员进行了严格的体检与一系列检测及筛查，如肝炎病毒、梅毒、爱滋病等的检查清除，以确保输血安全。近年来，人类细小病毒B19与疾病的密切关系日益受到重视，并发现B19所致之疾病谱在不断扩大之中。而如果输血员血液中含有B19，则对于患有血液病的患者、抵抗力弱的新生儿、婴幼儿或老人，若输入含有B19病毒的血液将引起溶血危象或造成B19传播感染。在本研究中，我们采用敏感性高、特异性强的巢式PCR法[2]检测出中心血站常规检测合格之献血员血中B19 DNA阳性率为5.08%，虽与正常新生儿、婴幼儿及孕妇相比，B19阳性检出率处于最低水平(表2)，但说明了仍需检除5.08%带B19病毒的血液，这对于防止B19传递，预防溶血危象或其他严重合并症是有重要临床意义的，尤其是对小儿及老年人，意义更加重大。
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3.2 ABO血型与B19DNA阳性检出率的关系 本研究中献血员血型不同，B19DNA阳性检出率亦不同。以AB型献血员B19DNA阳性最高，A型献血员次之，B型献血员及O型献血员较少(表1)。据此，从ABO血型系统的抗原、抗体分析可知，含红细胞A抗原的AB型及A型献血员B19DNA阳性率高，而不含红细胞A抗原的O型及B型献血员其B19DNA阳性率低，所以O型及B型血清中所含抗A抗体是否对B19有天然拮抗作用，值得重视探讨。
综上所述，正常的献血员B19阳性检出率为5.08%，所以为确保输血安全，建议应在输血前筛查清除含B19的血液。为新生儿、婴幼儿血液病溶血患者及老年、体弱者输血亦应检除B19阳性血液，以免发生急性溶血危象或造成B19传递感染，血型不同其B19阳性检出率亦有不同，初步认为与含红细胞抗原的不同和抗A抗体有一定关系，但需待进一步探索。并提示临床上对AB或A型献血员更应注意B19阳性的检除。
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*本课题为广东省卫生厅“五个一”科教兴医重点研究项目
4 参考文献
1 钱新宏，焦富勇.细小病毒与B19儿童疾病.中华儿科杂志，1997，35:107
2 Carriere C，BouLanger P，Delsert CA. Rapid method of sample preparation for detection of DNA viruses in human serum by polymerase chain reaction.J Virol Methods,1993,44(2～3):221, 百拇医药
单位：蔡定邦 陈享 文忠 梅敏 周丹 肇庆市第一人民医院(526021)；郭亮 青岛市人民医院(266001)；冼炳培 肇庆市中心血站(526000)
关键词：细小病毒B19；巢式聚合酶链反应；献血员
广东医学990903 【摘要】 目的 人类细小病毒B19与人类疾病密切相关，为确保输血安全，防止病毒传递，而探讨献血员B19感染状况。方法 采用巢式聚合酶链反应(PCR)技术分别对肇庆市中心血站374例献血员，肇庆市411例正常新生儿，186例正常婴幼儿，以及691例正常孕妇静脉血检测B19DNA。结果 献血员组静脉血中B19DNA阳性19例，阳性检出率为5.08%。其中，A型93例阳性率为6/93，即6.45%；B型58例阳性率为2/58，即3.45%；AB型44例阳性率为6/44，即13.64%；O型179例阳性率为5/179，即2.79%。正常新生儿B19阳性44例，阳性检出率为10.70%；正常婴幼儿阳性11例，阳性检出率为5.91%；正常孕妇阳性71例，阳性检出率为10.27%。结论 中心血站献血员正常状态下B19感染低于正常孕妇和小儿，但仍有5.08%检出B19病毒DNA，所以为确保输血安全，建议应在输血前筛查检除含有B19的血液。不同血型其B19阳性检出率有显著差别，初步认为与含红细胞抗原的不同及与抗A抗体有一定关连，尚需待进一步探索。
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Human parvovirus B19 infection in blood donors
Cai Dingbang， Guo Liang， Xian Bingpei, et al. The First people′s Hospital of Zhaoqing, Zhaoqing 526021
【Abstract】 Objective To investigate human parvovirus B19 infection in blood donors, newborns, children and pregnant women, in order to prevent the virus from transmission during blood transfusion.Methods Serum B19 DNA was detected by nested polymerase chain reaction in 374 blood donors, 411 normal newborns, 186 normal children and 691 normal pregnant women. Results The positive rates of parvovirus B19 DNA infection was 5.08% in blood donors, 6.45% (6/93) in A type blood, 3.45%(2/58) in B type blood, 13.64%(6/44) in AB type blood, 2.79%(5/179) in O type blood, 10.70% in normal newborns, 5.91% in normal children, 10.27% in normal pregnant women respectively. Conclusion Although the positive rate of human parvovirus B19 infection in blood donors (5.08%) is lower than that in normal newborns, children and pregnant women, it is still necessary to detect serum B19 DNA of donors before blood transfusion. The infection rate of parvovirus B19 is different from each blood type. This is probably related to RBC antigen and anti-A antibody.
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【Key words】 Parvovirus B19 Nested polymerase chain reaction Blood donor
人类细小病毒B19(human parvovirus B19 ，B19)与人类疾病密切相关，可引起传染性红斑、再生障碍性贫血危象、慢性纯红细胞再生障碍性贫血、关节炎、紫癜等多种儿童疾病；近年来与B19感染有关的疾病谱还在不断扩大，如过敏性紫癜、粒细胞减少症、噬血细胞综合征等，严重的儿童疾病，尤其是溶血性贫血、再障危象等[1] 。输血是常采取的治疗应急措施，献血员血液中B19感染状况，值得探讨研究。我们采用巢式PCR方法检测374例肇庆中心血站献血员B19感染状况，现报道如下。
1 对象与方法
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1.1 对象 献血员组：共374例，为1996年11月～1997年12月肇庆市中心血站献血员，男340例，女34例。年龄18～50岁，平均36.0±8.0岁。所有献血员均为正常的成人，采血前例行体检及血常规、血生化检测(包括谷丙转氨酶、乙肝表面抗原、丙肝抗体、爱滋病抗体、梅毒抗体)无异常且符合献血条件者。血型类别：为ABO体系血型，其中A型血93例，B型血58例，O型血179例，AB型血44例。正常新生儿组：共411例，为同期肇庆市足月顺产正常新生儿，男231例，女180例。正常婴幼儿童组：共186例，为同期肇庆市体检正常婴幼儿童，男96例，女90例。年龄1个月～15岁，平均7.8±3.6岁。正常孕妇组691例，为同期肇庆市产前检查无异常的孕妇，年龄20～38岁，平均27.0±3.0岁。胎龄26～39周，平均31.0±2.5周。
1.2 方法 巢式PCR法。
1.2.1 标本采集 取指端或肘静脉血、置于干净密封小容器Eppendof管中，采血过程注意消毒及防止污染。
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1.2.2 检测方法 ①材料Taq-DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液，MgCl2等，试剂均购自Promega公司，引物亦由上海Promega公司合成，序列如下：
A1 ：5′AATGAAAACTTTCCATTTAATGA 3′，B1 ：5′TCCTGAACTGGTCCCGGGGATGG 3′，A2 ：5′GCGTGGAAGTGTAGCTGTGCC 3′，B2 ：5′CAGAGCTTTCACCACCACTGC 3′。
1.2.3 标本处理 无菌采取标本的制备及DNA抽提采用Chelex裂解煮沸法进行。
1.2.4 巢式PCR反应过程 反应体积为50 μL，内含1×PCR缓冲液，1.25 mmol MgCl2 ，200 μmol dNTP；第1次PCR过程的引物为A1、 B1量为100 ng，2.5 u Taq-DNA聚合酶及5 μL处理后的标本DNA。PCR反应条件为热起动5 min后转入循环，循环参数为93℃ 1 min，56℃ 45 s，72℃ 20 s；共35个循环。第2次PCR过程的反应条件同第1次，但引物为A2、B2，模板为5 μL第1次PCR的产物。第1次PCR反应的产物长度为590 bp，第2次PCR反应的产物长度为355 bp，第2次PCR反应结束后取反应产物20 μL，进行琼脂糖电泳，同时做PCR Marker电泳，标本有355 bp左右产物者视为阳性结果。
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2 结果
2.1 献血员B19检测结果 见表1。
表1 374例献血员静脉血B19DNA检测结果 组别
红细胞抗原
血清中抗体
例数
B19DNA阳性
例
%*
A型
A
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抗B
93
6
6.45
B型
B
抗A
58
2
3.45
AB型
A，B
无
44
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6
13.64
O型
无A，无B
抗A+B
179
5
2.79
合计
374
19
5.08
*df=3,χ2＝9.447,P<0.05
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2.2 献血员、正常新生儿、婴幼儿、孕妇组B19阳性率比较 见表2。献血员组B19阳性率检出率非常显著低于新生儿(χ2＝8.30，P<0.01)，亦非常显著低于正常孕妇组(χ2＝8.45，P<0.01)。表2 肇庆地区正常人1 662例B19检测阳性率比较 组别
例数
B19DNA阳性例数
阳性检出率(%)
新生儿
411
44
10.70
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婴幼儿
186
11
5.91
孕妇
691
71
10.27
献血员
374
19
5.08
3 讨论
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3.1 检测献血员中B19的意义 自1900年Landsteiner发现ABO血型系统，1916年Rous等创立血液抗凝保存液以来，输血已成为临床治疗的一种技术。到了70年代，进入了成分输血的新时代，输血应用广泛，较之以往疗效更高，不良反应减少而血液各种组成得以综合利用。而输血所引起的不良反应，细菌与病毒污染血液而传递疾病则引起人们高度关注，并采取了许多有力的防治措施。对献血员进行了严格的体检与一系列检测及筛查，如肝炎病毒、梅毒、爱滋病等的检查清除，以确保输血安全。近年来，人类细小病毒B19与疾病的密切关系日益受到重视，并发现B19所致之疾病谱在不断扩大之中。而如果输血员血液中含有B19，则对于患有血液病的患者、抵抗力弱的新生儿、婴幼儿或老人，若输入含有B19病毒的血液将引起溶血危象或造成B19传播感染。在本研究中，我们采用敏感性高、特异性强的巢式PCR法[2]检测出中心血站常规检测合格之献血员血中B19 DNA阳性率为5.08%，虽与正常新生儿、婴幼儿及孕妇相比，B19阳性检出率处于最低水平(表2)，但说明了仍需检除5.08%带B19病毒的血液，这对于防止B19传递，预防溶血危象或其他严重合并症是有重要临床意义的，尤其是对小儿及老年人，意义更加重大。
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3.2 ABO血型与B19DNA阳性检出率的关系 本研究中献血员血型不同，B19DNA阳性检出率亦不同。以AB型献血员B19DNA阳性最高，A型献血员次之，B型献血员及O型献血员较少(表1)。据此，从ABO血型系统的抗原、抗体分析可知，含红细胞A抗原的AB型及A型献血员B19DNA阳性率高，而不含红细胞A抗原的O型及B型献血员其B19DNA阳性率低，所以O型及B型血清中所含抗A抗体是否对B19有天然拮抗作用，值得重视探讨。
综上所述，正常的献血员B19阳性检出率为5.08%，所以为确保输血安全，建议应在输血前筛查清除含B19的血液。为新生儿、婴幼儿血液病溶血患者及老年、体弱者输血亦应检除B19阳性血液，以免发生急性溶血危象或造成B19传递感染，血型不同其B19阳性检出率亦有不同，初步认为与含红细胞抗原的不同和抗A抗体有一定关系，但需待进一步探索。并提示临床上对AB或A型献血员更应注意B19阳性的检除。
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*本课题为广东省卫生厅“五个一”科教兴医重点研究项目
4 参考文献
1 钱新宏，焦富勇.细小病毒与B19儿童疾病.中华儿科杂志，1997，35:107
2 Carriere C，BouLanger P，Delsert CA. Rapid method of sample preparation for detection of DNA viruses in human serum by polymerase chain reaction.J Virol Methods,1993,44(2～3):221, 百拇医药