冬虫夏草多糖脂质体抗肝纤维化的实验研究
作者：马 雄，邱德凯，徐 军，李 海，曾民德
单位：上海第二医科大学附属仁济医院，上海市消化疾病研究所，上海 200001
关键词：肝纤维化；冬虫夏草多糖脂质体；Ⅰ、Ⅲ型胶原；基因
中国中医基础医学杂志990911 摘 要 目的 探讨冬虫夏草多糖脂质体(CPL)抗肝纤维化的作用及机制。方法 动物分为肝纤维化模型组、CPL治疗组和正常对照组，采用免疫组化和Northern杂交技术检测肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达。结果 CPL治疗组大鼠肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白较模型对照组明显减少(P值分别<0.01)；CPL治疗组大鼠肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达量明显下降，与模型组大鼠比较差异有显著性(P值分别<0.05)。结论 冬虫夏草多糖脂质体能明显减少肝脏的胶原沉积，并能抑制Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达。
肝纤维化是各种慢性肝损伤向肝硬化发展的共同途径，设法阻止或减慢肝纤维化的发展是治疗肝硬化的关键。有研究表明，人工虫草菌丝可明显减少大鼠肝内总胶原和I型、Ⅲ型胶原在肝内的沉积，对已形成的胶原也有一定程度的溶解和吸收攻效[1]本文从分子水平研究虫草多糖脂质体对实验性大鼠肝纤维化Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响，进一步揭示其抗肝纤维化机制。
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材料与方法
1 材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠60只，体重250g左右，购于中国科学院上海实验动物中心，清洁级。
1.2 主要试剂
兔抗人Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体(工作浓度1：80)由上海医科大学病理教研室提供；免疫组化试剂盒(ABC法)购自上海华美公司；含前胶原α2(I)cDNA和α2(Ⅲ)cDNA探针片段的质粒由上海医科大学王吉耀教授惠赠；限制性内切酶PstI,EcoRI,HindⅢ购自Promega公司；RNA抽提试剂盒(Trizol)购自GIBCOL公司；DNA片回收试剂盒购自QIEGEN公司，地高辛标记及检测试剂盒和尼龙膜购自Boehringer-Mannheim公司。
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2 方法
2.1 冬虫夏草多糖脂质体(CPL)的制备
冬虫夏草菌丝干粉(浙江长兴制药厂)经热水抽提成浓缩水溶性浸出液，反复两次乙醇沉淀得到冬虫夏草多糖，再与脂质体(磷脂酰胆碱：胆固醇：油酸为10∶1∶1，日本进口，上海分装)经超声粉碎及逆相蒸馏法制成冬虫夏草多糖脂质体溶液，每毫升含冬虫夏草多糖9mg及脂质体6.15mg，包埋率为40%左右。
2.2 大鼠肝硬化模型的建立及标本采集
大鼠随机分为3组：正常对照组(A)：10只，正常饮食饮水，皮下注射中性茶油，每周2次；模型对照组(B)：25只，10%乙醇水为惟一饮用水，40%四氯化碳茶油溶液0.3ml/100g皮下注射，每周2次，首剂加倍；虫草多糖脂质体治疗组(C)：25只，造模处理同B组，第6周起每天以虫草多糖脂质体溶液3ml/只灌胃。于造模第12周腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液3ml麻醉，打开腹腔，取肝脏方叶小块组织置10%中性甲醛固定留作病理检查；另取0.2g组织加入Trizol(GIBCOBRL公司)1ml中抽提总RNA。
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2.3 Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化染色
新鲜大鼠肝组织，10%中性甲醛固定24h以上，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋4μm连续切片，脱蜡至水，0.6%H2O2-甲醇，阻断内源性过氧化物酶，1%与二抗同源的正常动物血清封闭，以阻断非特异性结合。加特异性抗体，37℃孵育60min，然后置4℃过夜，加生物素化二抗，37℃孵育60min，各加A、B试剂一份混匀，放置30分钟以上，然后加此AB混合液37℃孵育60min,加DAB溶液，光镜下控制显色时间，镜下观察，棕褐色为阳性，每组各任选5张切片作图像分析。
2.4 质粒酶切与探针标记
用限制性内切酶(PHCAUIU：PstI,EcoRI;pHFS3:HindⅢ,EcoRI)对质粒DNA进行酶切，等酶切完全，将其余酶切产物电泳，当目的DNA与载体DNA分开后，切下目的DNA所在凝胶，按DNA片段回收试剂盒说明，过柱回收探针模板片段。用地高辛标记试剂盒自由引物法进行探针标记，再对所得的Ⅰ、Ⅲ型前胶原探针进行标记效率检测，结果满意后备用。
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2.5 Northern杂交
各取总RNA20μg经变性电泳后，进行Northern转移至尼龙膜上，80℃烘烤固定2h，经预杂交1h，再将膜封入含特异探针杂交液的塑料袋，42℃振荡过夜，经过严格漂洗，封闭，抗地高辛抗体孵育后，放入显色液中在暗处显色。
3 图像分析与数据处理
免疫组化及杂交结果经计算机图像灰度扫描数字转换后，进行统计数字处理，各组间行t检验，以P值<0.05判断有显著性差异。
结果
1 肝脏病理变化
肉眼观察：正常大鼠肝脏颜色鲜红，表面光滑，质脆柔软。肝纤维化模型组大鼠肝脏呈暗红色，表面粗糙有小结节，质地较韧体积缩小。CPL治疗组大鼠肝脏在色泽、质地、大小及表面光滑度方面较模型组均有明显改善。
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光镜检查：模型组大鼠肝脏组织内肝细胞坏死明显，纤维组织大量增生，肝小叶结构紊乱，可见假小叶形成，纤维隔内可见大量炎性细胞浸润，间质细胞增多；CPL治疗组大鼠肝脏组织内炎性细胞浸润，肝细胞坏死和纤维组织增生等方面均较模型组大鼠为轻，纤维隔较薄，假小叶形成不完全。
2 Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化
正常肝脏I型胶原阳性染色只见于汇管区和中央静脉管壁，Ⅲ型胶原主要存在于大血管周围；模型对照组肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原广泛存在于纤维间隔，包绕肝细胞形成明显的假小叶；CPL治疗组肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原明显减少，纤维间隔较薄，假小叶形成不完全。将胶原免疫组化结果进行图像分析，表明CPL治疗组肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原较模型对照组明显减少(P<0.01)(如表1)。
3 杂交结果(照片)及经计算机图像灰度扫描数字转换值(如表2)
表1 各组Ⅰ、Ⅲ型胶原占肝组织面积比值(%) 分 组
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n
I型胶原
Ⅲ型胶原
正常组
6
1.06±0.31
1.11±0.32
CPL治疗组
10
6.26±1.39☆
5.15±1.28☆
模型对照组
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10
9.19±1.55
8.89±1.71
注：☆与CPL治疗组比较：P<0.05。
表2 各组大鼠肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达量(灰度扫描数字转换值) 分 组 (n)
I型前胶原mRNA
Ⅲ型前胶原mRNA
正常对照组 8
245.57± 88.65
228.26± 57.46
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CPL治疗组 8
917.91±209.93
1050.90±271.39
模型对照组 8
1217.25±202.93☆
1484.45±249.08☆
注：☆与CPL治疗组比较：P<0.05。
CPL治疗组大鼠肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达量明显下降，与模型组大鼠比较差异有显著性(P<0.05)。讨论
肝纤维化组织的形成是由于胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖等细胞外基质的沉积。胶原在正常肝组织中只占蛋白成分的5～10%，但在肝硬化组织中可增高到50%以上，而I型胶原可占硬化肝脏胶原总量的60%～70%，Ⅲ型胶原可占硬化肝脏胶原总量的20%～30%[2]，因而Ⅰ、Ⅲ型胶原可作为反应胶原代谢的重要参数，观察Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的多少，可以判断抗纤维化药物的疗效。
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照片 Ⅰ型、Ⅲ型前胶原的基因表达
1：为模型对照组，2：为正常对照组，3：为冬虫夏草多糖脂质体治疗组。
肝纤维化的形成过程中，前胶原mRNA的增高先于或同步于胶原的增加，前胶原的转录过程是胶原合成的限速步骤[3]。与组织学检测相比，前胶原mRNA的测定能更好地反映当时肝脏胶原合成的状况，并可提示肝纤维化的发展趋势[4]。
本研究采用冬虫夏草多糖并以脂质体包裹，制成冬虫夏草多糖脂质体，用以治疗大鼠肝纤维化。结果表明CPL可以减少大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原的累积；Northern杂交结果表明，CPL可以降低肝纤维化大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRAN的表达，因而推测CPL的抗纤维化作用可能是通过抑制肝脏胶原合成而实现的。
冬虫夏草多糖抗纤维化作用可能与其免疫调节作用有关。有实验表明，冬虫夏草多糖能使大鼠胸腺中不成熟的CD4、CD8双阳性细胞发育为成熟的单阳性细胞，使大鼠脾脏组织中CD3、CD4、CD8阳性细胞非常显著地提高，因而冬虫夏草多糖可增强大鼠T细胞功能[5]。脂质体除作为载体包裹药物外，对肝细胞具有导向性，并具有免疫佐剂功能和肝细胞营养作用，可增强冬虫夏草多糖的免疫调节和改善肝功能作用[6]。
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冬虫夏草多糖脂质体可能通过提高吞噬细胞或枯否细胞的吞噬活性，从而增加毒性物质的清除，抑制了致纤维化细胞因子的释放，最终抑制了胶原的合成。
作者简介：马雄(1968— )，男(汉族)，博士生，主治医师。主要从事慢性肝炎和肝纤维化的研究。发表论著5篇，参编专著2部。
参考文献
[1] 朱家璇，王宝恩，王泰玲.冬虫夏草对实验性大鼠肝纤维化的预防和治疗作用的研究.中华消化杂志，1994，14(6)：333-335.
[2] Schppan D.Structure of the extracellular matrix in normal and fibrotic liver:collagen and glycoproteins. Semin liver Dis, 1990，10(1):1-10.
, 百拇医药
[3] Piece RA, Glaug MR, Greco RS, et al. Increased procollagen mRNA levis in carbon tetrachloride induced liver fibrosis in rats. J Biol Chem, 1987, 262:1652-1658.
[4] Goddard CRJ, Smith A, Hoyland JA, et al. Localization and semiquatitative assessment of hepatic procollangen mRNA in primary biliary cirrhosis. Gut, 1998, 43:433-440.
[5] 沈敏，邱德凯，黄少羽，等.冬虫夏草多糖及脂质体包埋冬虫夏草多糖对大鼠淋巴细胞表面分子的影响.上海免疫杂志，1991，11：200-203.
[6] 邱德凯，靖大道，萧树东，等. 冬虫夏草多糖脂质体对肝炎后肝硬化患者T细胞免疫调节作用的研究.中华消化杂志，1995，15：265-267.
(收稿日期 1999-08-11 修回日期 1999-09-12), 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属仁济医院，上海市消化疾病研究所，上海 200001
关键词：肝纤维化；冬虫夏草多糖脂质体；Ⅰ、Ⅲ型胶原；基因
中国中医基础医学杂志990911 摘 要 目的 探讨冬虫夏草多糖脂质体(CPL)抗肝纤维化的作用及机制。方法 动物分为肝纤维化模型组、CPL治疗组和正常对照组，采用免疫组化和Northern杂交技术检测肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达。结果 CPL治疗组大鼠肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白较模型对照组明显减少(P值分别<0.01)；CPL治疗组大鼠肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达量明显下降，与模型组大鼠比较差异有显著性(P值分别<0.05)。结论 冬虫夏草多糖脂质体能明显减少肝脏的胶原沉积，并能抑制Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达。
肝纤维化是各种慢性肝损伤向肝硬化发展的共同途径，设法阻止或减慢肝纤维化的发展是治疗肝硬化的关键。有研究表明，人工虫草菌丝可明显减少大鼠肝内总胶原和I型、Ⅲ型胶原在肝内的沉积，对已形成的胶原也有一定程度的溶解和吸收攻效[1]本文从分子水平研究虫草多糖脂质体对实验性大鼠肝纤维化Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响，进一步揭示其抗肝纤维化机制。
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材料与方法
1 材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠60只，体重250g左右，购于中国科学院上海实验动物中心，清洁级。
1.2 主要试剂
兔抗人Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体(工作浓度1：80)由上海医科大学病理教研室提供；免疫组化试剂盒(ABC法)购自上海华美公司；含前胶原α2(I)cDNA和α2(Ⅲ)cDNA探针片段的质粒由上海医科大学王吉耀教授惠赠；限制性内切酶PstI,EcoRI,HindⅢ购自Promega公司；RNA抽提试剂盒(Trizol)购自GIBCOL公司；DNA片回收试剂盒购自QIEGEN公司，地高辛标记及检测试剂盒和尼龙膜购自Boehringer-Mannheim公司。
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2 方法
2.1 冬虫夏草多糖脂质体(CPL)的制备
冬虫夏草菌丝干粉(浙江长兴制药厂)经热水抽提成浓缩水溶性浸出液，反复两次乙醇沉淀得到冬虫夏草多糖，再与脂质体(磷脂酰胆碱：胆固醇：油酸为10∶1∶1，日本进口，上海分装)经超声粉碎及逆相蒸馏法制成冬虫夏草多糖脂质体溶液，每毫升含冬虫夏草多糖9mg及脂质体6.15mg，包埋率为40%左右。
2.2 大鼠肝硬化模型的建立及标本采集
大鼠随机分为3组：正常对照组(A)：10只，正常饮食饮水，皮下注射中性茶油，每周2次；模型对照组(B)：25只，10%乙醇水为惟一饮用水，40%四氯化碳茶油溶液0.3ml/100g皮下注射，每周2次，首剂加倍；虫草多糖脂质体治疗组(C)：25只，造模处理同B组，第6周起每天以虫草多糖脂质体溶液3ml/只灌胃。于造模第12周腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液3ml麻醉，打开腹腔，取肝脏方叶小块组织置10%中性甲醛固定留作病理检查；另取0.2g组织加入Trizol(GIBCOBRL公司)1ml中抽提总RNA。
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2.3 Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化染色
新鲜大鼠肝组织，10%中性甲醛固定24h以上，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋4μm连续切片，脱蜡至水，0.6%H2O2-甲醇，阻断内源性过氧化物酶，1%与二抗同源的正常动物血清封闭，以阻断非特异性结合。加特异性抗体，37℃孵育60min，然后置4℃过夜，加生物素化二抗，37℃孵育60min，各加A、B试剂一份混匀，放置30分钟以上，然后加此AB混合液37℃孵育60min,加DAB溶液，光镜下控制显色时间，镜下观察，棕褐色为阳性，每组各任选5张切片作图像分析。
2.4 质粒酶切与探针标记
用限制性内切酶(PHCAUIU：PstI,EcoRI;pHFS3:HindⅢ,EcoRI)对质粒DNA进行酶切，等酶切完全，将其余酶切产物电泳，当目的DNA与载体DNA分开后，切下目的DNA所在凝胶，按DNA片段回收试剂盒说明，过柱回收探针模板片段。用地高辛标记试剂盒自由引物法进行探针标记，再对所得的Ⅰ、Ⅲ型前胶原探针进行标记效率检测，结果满意后备用。
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2.5 Northern杂交
各取总RNA20μg经变性电泳后，进行Northern转移至尼龙膜上，80℃烘烤固定2h，经预杂交1h，再将膜封入含特异探针杂交液的塑料袋，42℃振荡过夜，经过严格漂洗，封闭，抗地高辛抗体孵育后，放入显色液中在暗处显色。
3 图像分析与数据处理
免疫组化及杂交结果经计算机图像灰度扫描数字转换后，进行统计数字处理，各组间行t检验，以P值<0.05判断有显著性差异。
结果
1 肝脏病理变化
肉眼观察：正常大鼠肝脏颜色鲜红，表面光滑，质脆柔软。肝纤维化模型组大鼠肝脏呈暗红色，表面粗糙有小结节，质地较韧体积缩小。CPL治疗组大鼠肝脏在色泽、质地、大小及表面光滑度方面较模型组均有明显改善。
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光镜检查：模型组大鼠肝脏组织内肝细胞坏死明显，纤维组织大量增生，肝小叶结构紊乱，可见假小叶形成，纤维隔内可见大量炎性细胞浸润，间质细胞增多；CPL治疗组大鼠肝脏组织内炎性细胞浸润，肝细胞坏死和纤维组织增生等方面均较模型组大鼠为轻，纤维隔较薄，假小叶形成不完全。
2 Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化
正常肝脏I型胶原阳性染色只见于汇管区和中央静脉管壁，Ⅲ型胶原主要存在于大血管周围；模型对照组肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原广泛存在于纤维间隔，包绕肝细胞形成明显的假小叶；CPL治疗组肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原明显减少，纤维间隔较薄，假小叶形成不完全。将胶原免疫组化结果进行图像分析，表明CPL治疗组肝脏中Ⅰ、Ⅲ型胶原较模型对照组明显减少(P<0.01)(如表1)。
3 杂交结果(照片)及经计算机图像灰度扫描数字转换值(如表2)
表1 各组Ⅰ、Ⅲ型胶原占肝组织面积比值(%) 分 组
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n
I型胶原
Ⅲ型胶原
正常组
6
1.06±0.31
1.11±0.32
CPL治疗组
10
6.26±1.39☆
5.15±1.28☆
模型对照组
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10
9.19±1.55
8.89±1.71
注：☆与CPL治疗组比较：P<0.05。
表2 各组大鼠肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达量(灰度扫描数字转换值) 分 组 (n)
I型前胶原mRNA
Ⅲ型前胶原mRNA
正常对照组 8
245.57± 88.65
228.26± 57.46
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CPL治疗组 8
917.91±209.93
1050.90±271.39
模型对照组 8
1217.25±202.93☆
1484.45±249.08☆
注：☆与CPL治疗组比较：P<0.05。
CPL治疗组大鼠肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达量明显下降，与模型组大鼠比较差异有显著性(P<0.05)。讨论
肝纤维化组织的形成是由于胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖等细胞外基质的沉积。胶原在正常肝组织中只占蛋白成分的5～10%，但在肝硬化组织中可增高到50%以上，而I型胶原可占硬化肝脏胶原总量的60%～70%，Ⅲ型胶原可占硬化肝脏胶原总量的20%～30%[2]，因而Ⅰ、Ⅲ型胶原可作为反应胶原代谢的重要参数，观察Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的多少，可以判断抗纤维化药物的疗效。
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照片 Ⅰ型、Ⅲ型前胶原的基因表达
1：为模型对照组，2：为正常对照组，3：为冬虫夏草多糖脂质体治疗组。
肝纤维化的形成过程中，前胶原mRNA的增高先于或同步于胶原的增加，前胶原的转录过程是胶原合成的限速步骤[3]。与组织学检测相比，前胶原mRNA的测定能更好地反映当时肝脏胶原合成的状况，并可提示肝纤维化的发展趋势[4]。
本研究采用冬虫夏草多糖并以脂质体包裹，制成冬虫夏草多糖脂质体，用以治疗大鼠肝纤维化。结果表明CPL可以减少大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原的累积；Northern杂交结果表明，CPL可以降低肝纤维化大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRAN的表达，因而推测CPL的抗纤维化作用可能是通过抑制肝脏胶原合成而实现的。
冬虫夏草多糖抗纤维化作用可能与其免疫调节作用有关。有实验表明，冬虫夏草多糖能使大鼠胸腺中不成熟的CD4、CD8双阳性细胞发育为成熟的单阳性细胞，使大鼠脾脏组织中CD3、CD4、CD8阳性细胞非常显著地提高，因而冬虫夏草多糖可增强大鼠T细胞功能[5]。脂质体除作为载体包裹药物外，对肝细胞具有导向性，并具有免疫佐剂功能和肝细胞营养作用，可增强冬虫夏草多糖的免疫调节和改善肝功能作用[6]。
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冬虫夏草多糖脂质体可能通过提高吞噬细胞或枯否细胞的吞噬活性，从而增加毒性物质的清除，抑制了致纤维化细胞因子的释放，最终抑制了胶原的合成。
作者简介：马雄(1968— )，男(汉族)，博士生，主治医师。主要从事慢性肝炎和肝纤维化的研究。发表论著5篇，参编专著2部。
参考文献
[1] 朱家璇，王宝恩，王泰玲.冬虫夏草对实验性大鼠肝纤维化的预防和治疗作用的研究.中华消化杂志，1994，14(6)：333-335.
[2] Schppan D.Structure of the extracellular matrix in normal and fibrotic liver:collagen and glycoproteins. Semin liver Dis, 1990，10(1):1-10.
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[3] Piece RA, Glaug MR, Greco RS, et al. Increased procollagen mRNA levis in carbon tetrachloride induced liver fibrosis in rats. J Biol Chem, 1987, 262:1652-1658.
[4] Goddard CRJ, Smith A, Hoyland JA, et al. Localization and semiquatitative assessment of hepatic procollangen mRNA in primary biliary cirrhosis. Gut, 1998, 43:433-440.
[5] 沈敏，邱德凯，黄少羽，等.冬虫夏草多糖及脂质体包埋冬虫夏草多糖对大鼠淋巴细胞表面分子的影响.上海免疫杂志，1991，11：200-203.
[6] 邱德凯，靖大道，萧树东，等. 冬虫夏草多糖脂质体对肝炎后肝硬化患者T细胞免疫调节作用的研究.中华消化杂志，1995，15：265-267.
(收稿日期 1999-08-11 修回日期 1999-09-12), 百拇医药