子宫内膜异位症患者腹腔液体外对NK细胞活性的影响
作者：李 文 杨 帆 金志军 杨云纺
单位：第二军医大学长征医院妇产科，上海，200003
关键词：子宫内膜异位症；自然杀伤细胞；腹腔液
第二军医大学学报991031 摘要 目的：探讨子宫内膜异位症(EM)患者的腹腔液(PF)对自然杀伤(NK)细胞的作用。方法：以Hela细胞作为靶细胞，采用LDH释放法测定与EM患者PF共同孵育后正常人血NK细胞活性的变化。结果：在作用2 h时，非EM患者和EM患者PF对正常人外周血NK细胞活性的抑制率分别为(37.1±18.9)%和(65.2±21.8)%，两者相差非常显著(P<0.01)。抑制率与EM临床分期呈显著正相关(r=0.602 3, P<0.05)。延长PF与淋巴细胞的作用时间，则PF对NK细胞活性的抑制率也随之升高。结论：EM患者的PF对NK细胞活性具有明显的抑制作用。
, 百拇医药 中图分类号 R 711.71 文献标识码：A
Effect of peritoneal fluid of women with endometriosis on the natural killer cell activity in vitro
Li Wen, Yang Fan, Jin Zhijun, Yang Yunfang
(Department of Obstetrics and Gynecology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of the peritoneal fluid (PF) of women with endometriosis(EM) on the natural killer (NK) cell activity. Methods: Hela cells being target cell, the LDH releasing assay was applied for measurement of the change of NK cell activity after preincubation with PF of EM. Results: After incubated with PF of women with and without EM for two hours, the inhibition percentages of NK cell activity was decreased by (37.1±18.9)% and (65.2±21.8)% ,respectively. Their difference was significant statistically (P<0.01). The inhibition percentage was correlated with the severity of EM (r=0.602 3, P<0.05). Prolonged the incubation time, the NK cell activity was decreased more significantly. Conclusion: PF of EM can significantly decrease NK cell activity in vitro.
, 百拇医药
KEY WORDS endometriosis; natural killer cell; peritoneal fluid
很多研究表明，子宫内膜异位症(EM)患者外周血及腹腔液(PF)自然杀伤(NK)细胞活性明显降低，特别以PF中NK细胞活性下降为显著，推测可能是促使子宫内膜细胞在盆腔内种植的原因之一。本研究通过将EM患者的PF在体外与正常人的外周血淋巴细胞共同孵育后，观察其中NK细胞活性变化，以探讨EM患者的PF对NK细胞的作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象 1995年10月至 1996年10月，因不孕、盆腔疼痛或输卵管绝育在我院行腹腔镜检查的患者中，术前 3个月未行内分泌治疗且为非血性PF者共51例，年龄为26～38岁，平均 (28.3±4.5)岁，其中40例诊断为EM。根据 1985 年美国生育协会(AFS)的诊断标准：Ⅰ期12例， Ⅱ期13例， Ⅲ期 9例，Ⅳ期 6例；另11例无EM证据的患者作为对照组。腹腔镜检查时，抽取子宫直肠陷凹的PF，收集在无菌肝素试管中，3 000 r/min离心 8 min，上清液置-20℃保存，底部细胞留作他用。
, 百拇医药
1.2 材 料 效应细胞和靶细胞：淋巴细胞取自 5名健康志愿女性的外周血。清晨抽血，肝素化。Hela细胞为我院临床免疫中心传代细胞。主要试剂：淋巴细胞分离液(上海第一试剂厂)，Hank液(上海第二试剂厂)，RPMI 1640(日本制药株式会社)。主要器材：Σ960型自动酶标分析仪。
1.3 LDH释放法测定NK细胞活性[1] 效应细胞的制备：用淋巴细胞分离液分离肝素抗凝静脉血，Hank液洗涤2次后用培养液(含10%小牛血清的RPMI 1640)调节至 2×106个/ml。效应细胞的处理：取1 ml效应细胞加1 ml PF(空白对照组用培养液)，置于37℃，5% CO2培养箱中培养2，12，24 h，3 000 r/min离心 5 min，去上清。Hank液2 ml洗涤，重复 4次。用含10%小牛血清 RPMI 1640制成 2×106个/ml的细胞悬液。靶细胞的制备：培养24～48 h对数生长期的Hela细胞，Hank液洗涤 2次，用培养液调节细胞密度至 1×105个/ml；在40孔板中，每孔加靶细胞100 μl，效应细胞100 μl，每个标本均设 3复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养4 h后1 500 r/min离心5 min；各孔取上清液100 μl置于另一40孔板的对应孔，37℃保温 5 min，加底物液100 μl/孔，室温孵育10 min后加0.1 mol/L柠檬酸30 μl/孔终止酶促反应。在570 nm波长下测定各孔光密度(D)值，计算NK细胞活性的抑制率。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 数据均以
表示，两样本间行t检验；等级相关分析。
2 结 果
在作用 2 h时，非EM患者和EM患者PF对正常人外周血NK细胞活性的抑制率分别为 (37.1±18.9)%和( 65.2±21.8)%，两者相差非常显著(P<0.01)。随着EM AFS临床分期的加重，其PF对NK细胞活性的抑制率亦增高， Ⅰ～Ⅳ期EM患者PF对NK细胞活性的抑制率分别为(50.3±31.2)%，(67.5±34.0)%，(78.2±35.9)%和(88.4±36.3)%，等级相关分析显示二者呈正相关(r=0.602 3, P<0.05)。如果延长PF与淋巴细胞的作用时间，则PF对NK细胞活性的抑制率也随之升高。在作用时间为12和24 h时，EM组PF对NK细胞活性的抑制率分别为 (73.0±29.7)%和 (78.3±36.2)%，均明显高于作用2 h时的抑制率(P<0.05)；对照组各时间点的抑制率则无显著性差异，见图1。
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图1 腹腔液不同作用时间对NK
细胞活性的抑制
Fig 1 The inhibitory effect on NK cells by PF
in different time
○:EM patients; ■:non-EM patients
3 讨 论
早在1924年Sampson就提出了经血返流，在腹腔内种植形成EM的学说。众所周知，行经妇女子宫内膜细胞随经血返流的发生率很高，但并非所有这些妇女都发生EM。这提示EM患者在发病以前腹腔内微环境可能已发生了某些病理改变，而这些改变使得返流的子宫内膜细胞易于在腹腔内种植。
, http://www.100md.com
NK细胞作为人体内的第一道防御细胞在清除盆腔中返流的子宫内膜细胞中起重要的作用。有研究显示，EM患者外周血及PF中NK细胞活性下降，而且以PF中的NK细胞活性下降较为明显[2～4]。推测由于NK细胞活性的下降，导致随经血返流的子宫内膜细胞不能被NK细胞完全清除，而在腹腔内种植。这可能是EM的发病机制之一。
本研究将正常人外周血淋巴细胞与EM患者PF共同孵育，测定其中NK细胞活性，显示与空白对照相比，正常对照组妇女和EM患者PF均可使正常人外周血NK细胞活性明显下降，这种抑制作用随着EM的严重程度而加重。说明无论是正常人群还是EM患者的PF中，均可能存在着影响NK细胞活性的成分。推测在生理情况下，这种或这些成分对NK细胞活性的抑制，尚不能影响NK细胞清除返流的子宫内膜细胞；而当这种或这些成分的质或量发生改变时，NK细胞的活性受到明显的抑制，清除返流的子宫内膜细胞的能力下降，而发生EM。
Somigliana等[5]将提取的NK细胞与培养和未培养过子宫内膜细胞的培养基上清液共同孵育，然后测定NK细胞的细胞毒性。结果显示培养子宫内膜细胞的培养基上清液对NK细胞介导的细胞毒性具有明显的抑制作用。而且，培养EM患者子宫内膜细胞的培养基对NK细胞的细胞毒性的抑制程度明显高于非EM患者子宫内膜细胞的培养基。提示人子宫内膜细胞能释放可溶性非特异成分干扰NK细胞的活性。这可以解释Oosterlynck等[6]观察到的PF NK细胞活性与EM分期呈负相关。推测由于PF微环境的改变，使NK细胞活性受到抑制，返流的子宫内膜细胞易于种植形成EM；而种植的异位内膜能释放可溶性非特异成分进一步干扰NK细胞的活性，使EM患者症状加重，临床分期偏重。
, http://www.100md.com
文章编号：0258-879X(1999)10-0804-03
参考文献
1 王红蓓，孔宪涛，张玲珍. 硫酸软骨素A对正常人及乙肝患者NK，ADCC活性的影响[J]. 中国免疫学杂志, 1993, 9(6): 361
2 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis[J]. Fertil Steril, 1992, 58(2): 290
3 Wilson TJ, Munnery L, Hertzog PJ, et al. Decreased natural killer cell activity in endometriosis patients: relationship to diseased pathogenesis[J]. Fertil Steril, 1994,62(5):1086
, 百拇医药
4 Garzetti GG, Ciavattini A, Proviniciali M, et al. Natural killer cell activity in endometriosis: correlation between serum estradiol levels and cytotoxicity[J]. Obstet Gynecol, 1993, 81[5 (pt1)]: 665
5 Somigliana E, Vigano P, Gaffuri B, et al. Modulation of NK cell lytic function by endometrial secretory factors: potential role in endometriosis[J]. Am J Reprod Immunol, 1996, 36(5):295
6 Oosterlynck DJ, Cornillie FJ, Waer M, et al. Women with endometriosis show a defect in natural killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to autologous endometrium[J]. Fertil Steril, 1991, 56(1):45
(1999-01-21收稿，1999-08-23修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院妇产科，上海，200003
关键词：子宫内膜异位症；自然杀伤细胞；腹腔液
第二军医大学学报991031 摘要 目的：探讨子宫内膜异位症(EM)患者的腹腔液(PF)对自然杀伤(NK)细胞的作用。方法：以Hela细胞作为靶细胞，采用LDH释放法测定与EM患者PF共同孵育后正常人血NK细胞活性的变化。结果：在作用2 h时，非EM患者和EM患者PF对正常人外周血NK细胞活性的抑制率分别为(37.1±18.9)%和(65.2±21.8)%，两者相差非常显著(P<0.01)。抑制率与EM临床分期呈显著正相关(r=0.602 3, P<0.05)。延长PF与淋巴细胞的作用时间，则PF对NK细胞活性的抑制率也随之升高。结论：EM患者的PF对NK细胞活性具有明显的抑制作用。
, 百拇医药 中图分类号 R 711.71 文献标识码：A
Effect of peritoneal fluid of women with endometriosis on the natural killer cell activity in vitro
Li Wen, Yang Fan, Jin Zhijun, Yang Yunfang
(Department of Obstetrics and Gynecology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of the peritoneal fluid (PF) of women with endometriosis(EM) on the natural killer (NK) cell activity. Methods: Hela cells being target cell, the LDH releasing assay was applied for measurement of the change of NK cell activity after preincubation with PF of EM. Results: After incubated with PF of women with and without EM for two hours, the inhibition percentages of NK cell activity was decreased by (37.1±18.9)% and (65.2±21.8)% ,respectively. Their difference was significant statistically (P<0.01). The inhibition percentage was correlated with the severity of EM (r=0.602 3, P<0.05). Prolonged the incubation time, the NK cell activity was decreased more significantly. Conclusion: PF of EM can significantly decrease NK cell activity in vitro.
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KEY WORDS endometriosis; natural killer cell; peritoneal fluid
很多研究表明，子宫内膜异位症(EM)患者外周血及腹腔液(PF)自然杀伤(NK)细胞活性明显降低，特别以PF中NK细胞活性下降为显著，推测可能是促使子宫内膜细胞在盆腔内种植的原因之一。本研究通过将EM患者的PF在体外与正常人的外周血淋巴细胞共同孵育后，观察其中NK细胞活性变化，以探讨EM患者的PF对NK细胞的作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象 1995年10月至 1996年10月，因不孕、盆腔疼痛或输卵管绝育在我院行腹腔镜检查的患者中，术前 3个月未行内分泌治疗且为非血性PF者共51例，年龄为26～38岁，平均 (28.3±4.5)岁，其中40例诊断为EM。根据 1985 年美国生育协会(AFS)的诊断标准：Ⅰ期12例， Ⅱ期13例， Ⅲ期 9例，Ⅳ期 6例；另11例无EM证据的患者作为对照组。腹腔镜检查时，抽取子宫直肠陷凹的PF，收集在无菌肝素试管中，3 000 r/min离心 8 min，上清液置-20℃保存，底部细胞留作他用。
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1.2 材 料 效应细胞和靶细胞：淋巴细胞取自 5名健康志愿女性的外周血。清晨抽血，肝素化。Hela细胞为我院临床免疫中心传代细胞。主要试剂：淋巴细胞分离液(上海第一试剂厂)，Hank液(上海第二试剂厂)，RPMI 1640(日本制药株式会社)。主要器材：Σ960型自动酶标分析仪。
1.3 LDH释放法测定NK细胞活性[1] 效应细胞的制备：用淋巴细胞分离液分离肝素抗凝静脉血，Hank液洗涤2次后用培养液(含10%小牛血清的RPMI 1640)调节至 2×106个/ml。效应细胞的处理：取1 ml效应细胞加1 ml PF(空白对照组用培养液)，置于37℃，5% CO2培养箱中培养2，12，24 h，3 000 r/min离心 5 min，去上清。Hank液2 ml洗涤，重复 4次。用含10%小牛血清 RPMI 1640制成 2×106个/ml的细胞悬液。靶细胞的制备：培养24～48 h对数生长期的Hela细胞，Hank液洗涤 2次，用培养液调节细胞密度至 1×105个/ml；在40孔板中，每孔加靶细胞100 μl，效应细胞100 μl，每个标本均设 3复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养4 h后1 500 r/min离心5 min；各孔取上清液100 μl置于另一40孔板的对应孔，37℃保温 5 min，加底物液100 μl/孔，室温孵育10 min后加0.1 mol/L柠檬酸30 μl/孔终止酶促反应。在570 nm波长下测定各孔光密度(D)值，计算NK细胞活性的抑制率。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 数据均以
表示，两样本间行t检验；等级相关分析。2 结 果
在作用 2 h时，非EM患者和EM患者PF对正常人外周血NK细胞活性的抑制率分别为 (37.1±18.9)%和( 65.2±21.8)%，两者相差非常显著(P<0.01)。随着EM AFS临床分期的加重，其PF对NK细胞活性的抑制率亦增高， Ⅰ～Ⅳ期EM患者PF对NK细胞活性的抑制率分别为(50.3±31.2)%，(67.5±34.0)%，(78.2±35.9)%和(88.4±36.3)%，等级相关分析显示二者呈正相关(r=0.602 3, P<0.05)。如果延长PF与淋巴细胞的作用时间，则PF对NK细胞活性的抑制率也随之升高。在作用时间为12和24 h时，EM组PF对NK细胞活性的抑制率分别为 (73.0±29.7)%和 (78.3±36.2)%，均明显高于作用2 h时的抑制率(P<0.05)；对照组各时间点的抑制率则无显著性差异，见图1。
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图1 腹腔液不同作用时间对NK
细胞活性的抑制
Fig 1 The inhibitory effect on NK cells by PF
in different time
○:EM patients; ■:non-EM patients
3 讨 论
早在1924年Sampson就提出了经血返流，在腹腔内种植形成EM的学说。众所周知，行经妇女子宫内膜细胞随经血返流的发生率很高，但并非所有这些妇女都发生EM。这提示EM患者在发病以前腹腔内微环境可能已发生了某些病理改变，而这些改变使得返流的子宫内膜细胞易于在腹腔内种植。
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NK细胞作为人体内的第一道防御细胞在清除盆腔中返流的子宫内膜细胞中起重要的作用。有研究显示，EM患者外周血及PF中NK细胞活性下降，而且以PF中的NK细胞活性下降较为明显[2～4]。推测由于NK细胞活性的下降，导致随经血返流的子宫内膜细胞不能被NK细胞完全清除，而在腹腔内种植。这可能是EM的发病机制之一。
本研究将正常人外周血淋巴细胞与EM患者PF共同孵育，测定其中NK细胞活性，显示与空白对照相比，正常对照组妇女和EM患者PF均可使正常人外周血NK细胞活性明显下降，这种抑制作用随着EM的严重程度而加重。说明无论是正常人群还是EM患者的PF中，均可能存在着影响NK细胞活性的成分。推测在生理情况下，这种或这些成分对NK细胞活性的抑制，尚不能影响NK细胞清除返流的子宫内膜细胞；而当这种或这些成分的质或量发生改变时，NK细胞的活性受到明显的抑制，清除返流的子宫内膜细胞的能力下降，而发生EM。
Somigliana等[5]将提取的NK细胞与培养和未培养过子宫内膜细胞的培养基上清液共同孵育，然后测定NK细胞的细胞毒性。结果显示培养子宫内膜细胞的培养基上清液对NK细胞介导的细胞毒性具有明显的抑制作用。而且，培养EM患者子宫内膜细胞的培养基对NK细胞的细胞毒性的抑制程度明显高于非EM患者子宫内膜细胞的培养基。提示人子宫内膜细胞能释放可溶性非特异成分干扰NK细胞的活性。这可以解释Oosterlynck等[6]观察到的PF NK细胞活性与EM分期呈负相关。推测由于PF微环境的改变，使NK细胞活性受到抑制，返流的子宫内膜细胞易于种植形成EM；而种植的异位内膜能释放可溶性非特异成分进一步干扰NK细胞的活性，使EM患者症状加重，临床分期偏重。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0804-03
参考文献
1 王红蓓，孔宪涛，张玲珍. 硫酸软骨素A对正常人及乙肝患者NK，ADCC活性的影响[J]. 中国免疫学杂志, 1993, 9(6): 361
2 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis[J]. Fertil Steril, 1992, 58(2): 290
3 Wilson TJ, Munnery L, Hertzog PJ, et al. Decreased natural killer cell activity in endometriosis patients: relationship to diseased pathogenesis[J]. Fertil Steril, 1994,62(5):1086
, 百拇医药
4 Garzetti GG, Ciavattini A, Proviniciali M, et al. Natural killer cell activity in endometriosis: correlation between serum estradiol levels and cytotoxicity[J]. Obstet Gynecol, 1993, 81[5 (pt1)]: 665
5 Somigliana E, Vigano P, Gaffuri B, et al. Modulation of NK cell lytic function by endometrial secretory factors: potential role in endometriosis[J]. Am J Reprod Immunol, 1996, 36(5):295
6 Oosterlynck DJ, Cornillie FJ, Waer M, et al. Women with endometriosis show a defect in natural killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to autologous endometrium[J]. Fertil Steril, 1991, 56(1):45
(1999-01-21收稿，1999-08-23修回), 百拇医药