稳态层流下的内皮细胞形态特征变化
作者：韩 林 张宝仁 柳兆荣 朱家麟 郝家骅 徐志云 李惜惜
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433；柳兆荣 李惜惜:复旦大学应用力学系
关键词：内皮细胞；切应力；细胞骨架
第二军医大学学报991030 摘要 目的：探讨稳态层流下的内皮细胞特征变化规律和血流切应力改变对血管内膜结构的影响。方法：采用胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞(PAEC)，模拟体内流动环境，建立平行平板流动腔模型。利用细胞定量图像分析系统和FITC-若丹明-次毒蕈环肽标记法，观察内皮细胞在稳态层流下形态与排列变化。结果：内皮细胞在1.0×10-5，2.5×10-5 kPa剪切18 h后，细胞趋于切应力作用方向排列，与静息态的细胞相比，长短轴比值变化显著[(1.20±0.10) vs (1.12±0.08)，(1.38±0.15) vs (1.12±0.08)，P<0.01)]，细胞面积无显著变化；在2.5×10-5 kPa剪切作用6 h后，细胞面积和长短轴比值无显著变化，而细胞内骨架沿切应力方向重组；在2.5×10-5 kPa剪切作用后的PAEC再次处于静息培养24 h后，细胞向静息态细胞转变。结论：血流动力学特性中切应力是引起血管内皮细胞形态发生变化的主要原因，细胞形态的改变是细胞胞质内骨架蛋白分子重组的表现；同时，切应力引起内皮细胞的应变是可逆的，当切应力撤除后，细胞亦趋于低切应力下的形态特征。
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中图分类号 R 331.32 文献标识码：A
Changes in the morphometric feature of endothelial cells under steady flow state
Han Lin, Zhang Baoren, Liu Zhaorong, Zhu Jialin, Hao Jiahua, Xu Zhiyun, Li Xixi
(Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To study the regular rule of changes in endothelial cells morphometric feature under steady flow state, and to investigate the effects of shear stress on the structure of vascular intima. Methods: Bovine pulmonary arterial endothelial cells(PAEC) were isolated and cultured with collagenase digestion. The parallel-plated flow chamber device was established to simulate blood flow environment in vitro. Changes in the cell morphometric parameters were analyzed quantitatively before and after shear flow exposure. The patterns of microfilament distribution in cells were observed by stained with rhodamine-phalloidin. Results: After 1.0×10-5 and 2.5×10-5 kPa shear flow exposure, PAEC were elongated and oriented to the direction of the flow, although there were no changes of cell area, the axis ratio(ratio of major axis and minor axis) changed significantly [(1.20±0.10) vs (1.12±0.08), (1.38±0.15) vs (1.12±0.08), P<0.01]. After 2.5×10-5 kPa shear flow exposure for 6 h the microfilaments were oriented to the direction of flow with no changes of the cell shapes. PAEC which exposed 2.5×10-5 kPa shear flow for 18 h were cultured under no-flow condition for 24 h again, the axis ratio decreased significantly[(1.12±0.11) vs (1.38±0.15), P<0.05].Conclusion:Shear stress,one of the flow mechanical characters,is major factor which affects vascular endothelial cell morphometric.The changes of cells morphometric is a manifestation of cytoskeleton protein remodeling.It is reversion after withdrawn shear force.
, 百拇医药
KEY WORDS endothelial cell; shear stress; cytoskeleton
内皮细胞不仅是构成血液与血管平滑肌之间的生理屏障，而且是一高度活跃的代谢和内分泌细胞，其细胞膜上存在大量的受体和生物感受器，感知循环系统内环境的细微变化，通过合成和分泌这些活性物质，直接参与对平滑肌的调节，在维持循环内环境稳定中起着十分重要的作用，在心血管疾病的发生和发展过程中也有独特的作用[1,2]。
血流是机体循环系统的一种物理现象，它包括机械应力，层流、湍流，定常、脉动，分离、附着等流动特性，是调节内皮细胞结构和功能的自身机制之一；血流动力学环境的紊乱参与多种心血管疾病的病理生理过程。本实验研究稳态层流下的内皮细胞形态特征变化的规律，以期了解血流切应力改变对血管结构的影响。
1 材料和方法
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1.1 小牛肺动脉内皮细胞的培养和鉴定[3] 用0.1%胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞(PAEC)，根据相差显微镜下观察细胞形态及凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测结果鉴定培养的细胞。用于本实验为第4～7代，PAEC接种于 110 mm×70 mm×10 mm玻璃平板，细胞长满后2 d用于剪切实验。
1.2 平行平板流动腔的建立和使用[4] 本实验装置由流室、灌流辅助系统、混合气体供应部分和恒温生化培养箱组成；流室是由聚碳酸脂平板附以厚为0.2 mm矩形硅胶垫圈，通过真空吸附铺有培养PAEC的玻璃平板组成， 80.0 mm×45.0 mm×0.2 mm；灌流辅助系统由上、下两只特制的玻璃贮液瓶、硅胶管和恒流泵组成，上、下贮液瓶之间的高度差(H)决定通过流室内的流量(Q)，恒流泵维持灌流液循环，灌流液为无血清DMEM培养液，总量为25 ml；混合气为95%空气+5% CO2。流室内PAEC所受切应力根据如下公式计算:
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τ=ρvhH/2 L
其中:ρ为灌流液密度；v为加速度，h为流室高度；L为流室腔长度。流室、灌注管道和贮液槽预先经高压灭菌，于37℃ SHH 生化培养箱内无菌条件下进行装配、使用。
1.3 内皮细胞形态学检查
1.3.1 内皮细胞形态参数分析 剪切作用后的内皮细胞用PBS漂洗3次，在室温下用2%甲醛和1%戊二醛混合液(pH 7.3)固定1 h，PBS液冲洗2次，再在0.5%醇溶伊红Y和0.125%考马斯亮蓝R-250混合液(体积分数为6/4)，染色过夜，蒸馏水彻底冲洗后晾干，利用通用颗粒图像分析系统(中科院自动化研究所)，选取约50个细胞分别测量细胞面积、长、短轴及它们的比例等形态参数。
1.3.2 内皮细胞骨架观察 剪切作用后的内皮细胞用PBS漂洗2次，室温下用3.7%甲醛固定液固定5 min，PBS漂2 min，在-20℃丙酮脱水4 min，37℃水浴中1% Triton X-100 抽提15 min，PBS冲洗后凉干，用含1%二甲基亚砜的0.05 mg/ml FITC-标记若丹明-次毒蕈环肽标记40 min，PBS漂洗30 min，于荧光显微镜下观察摄像。
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1.4 统计学处理 结果均以
表示，采用未配对资料的t检验。
2 结 果
2.1 PAEC 培养和鉴定 光镜下见培养的PAEC呈多角形，单层生长达到融合后，呈鹅卵石样排列(图1A)；凝血Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ R∶Ag)检测见PAEC核周胞质呈紫褐色颗粒分布。
2.2 切应力对内皮细胞形态的影响 PAEC在2.5×10-5 kPa作用6,12,18 h后细胞由近似圆形向长梭形变化，细胞排列方向趋向于切应力作用的方向规则分布(图1B，C，D)；细胞在1.0×10-5 kPa作用18 h后，细胞同样趋于长梭形变化(图1E)；细胞在2.5×10-5 kPa作用18 h后，再重新处于静息态培养24 h，形态和排列又重新趋向静息态细胞特征(图1F)。
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图1 PAEC形态特征变化(10×40)
Fig 1 Changes of PAEC morphometric feature (10×40)
A: Static condition; B: After 6 h application of a 2.5×10-5 kPa shear stress; C: After 12 h application of a 2.5×10-5 kPa shear
stress; D: After 18 h application of a 2.5×10-5 kPa shear stress; E: After 18 h application of a 1.0×10-5 kPa shear stress;
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F: After 2.5×10-5 kPa shear flow exposure 18 h recultured in static condition for 24 h
2.3 切应力对内皮细胞形态因子的影响 PAEC在10，2.5×10-5 kPa剪切18 h后，与静息态细胞相比，长短轴比值显著增大；细胞在2.5×10-5 kPa作用18 h后，再重新处于静息态培养24 h后，长短轴比值显著减小[(1.38±0.15) vs (1.21±0.11)， P<0.05]。然而各种剪切状态下，细胞面积无显著变化(表1)。
表1 切应力作用下PAEC 形态因子的变化
Tab 1 Effect of shear stress on endothelial cell
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morphometric parameters (n=50,) Condition
Cell area (A/μm2)
Axis ratio (%)
Static condition
827±202
1.12±0.08
1.0×10-5 kPa×18 h
843±259
1.29±0.14
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2.5×10-5 kPa× 6 h
821±204
1.11±0.11
2.5×10-5 kPa×12 h
863±190
1.20±0.10
2.5×10-5 kPa×18 h
855±209
1.38±0.15
3 讨 论
以往的在体观察发现血管内皮细胞的形态特征与其所处的血流流动的环境密切相关，体内循环系统中不同部位的血管内皮细胞的形态排列迥异。血流速度和方向改变都能导致细胞排列和形态的变化。Flaherty等[5]曾切除狗主动脉片段，旋转90度，原位移植10 d后，发现细胞的长轴与排列方向均按血流方向重新定向，这体现了细胞对流动力学环境的适应。本实验应用流动腔技术定量地分析了内皮细胞在不同切应力作用下，细胞形态因子的变化规律，结果显示细胞的圆度、长轴的方向均发生了明显的变化，并呈现量效和时效关系，这表明血流力学特性中切应力是引起血管内皮细胞形态发生变化的主要原因。
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细胞形态的改变是细胞胞质内骨架蛋白分子重组的表现，本实验结果显示细胞沿剪切方向一致排列和伸长与细胞内骨架蛋白取向相同，并在形态变化之前，细胞内的骨架就发生重组。切应力引起骨架蛋白排列变化并不是简单的外力对构形的改建，而是一个复杂的生理适应过程，其机制尚不清楚。目前认为可能与细胞内的信号系统有关，当在切应力作用下,细胞膜上的离子通道开放,细胞内磷酸肌醇信号系统激活,细胞内第二信使,如肌醇三磷酸、Ca2+，H+浓度的变化影响肌动蛋白的聚合，而肌醇三磷酸使细胞内激酶激活，使与骨架蛋白结合的调节蛋白gelsolin，α-actinin和粘着斑vinculin和VNRS等磷酸化，引起细胞骨架的重组。血流环境改变引起细胞形状和排列的变化是由于细胞内骨架对应力的应变的一种表现形式[6]。
内皮细胞在血流环境中的形态学变化是由于细胞在外界应力作用下的应变，是自身适应过程，具有重要的病理生理意义。循环血管中血流的减慢和增速都能影响内膜层的结构，如高动力性肺动脉高压的晚期，内膜受侵蚀，内皮出现葱皮样病理改变，而被动性肺动脉高压也伴有内膜及内膜下基膜增厚。同时本实验发现切应力对内皮细胞的形态学影响是可逆的，当切应力撤除后，细胞亦趋于低切应力下的形态特征，说明当体内异常血流改善后，异常结构的内膜有可能恢复正常。(本文图1见封四)。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0801-03
参考文献
1 Peiro C, Redondo J, Rodriguez-Martinez MA, et al. Influence of endothelium on cultured vascular smooth muscle cell proliferation[J]. Hypertension,1995,25(4 pt 2):748
2 Schiffrin EL. Endothelin: potential role in hypertension and vascular hypertrophy[J]. Hypertension, 1995,25(6):1135
3 Ryan US, Clements E, Habliston D, et al, Isolation and culture of pulmonary artery endothelial cells[J]. Tissue cell,1978,10(3):535
, 百拇医药
4 Frangos JA, Eskin SG, McIntire LV, et al. Flow effects on prostacyclin production by cultured human endothelial cells[J]. Science,1985,277(4693):1477
5 Flaherty JT, Pierce JE, Ferrans VJ, et al. Endothelial nuclear patterns in the canine arterial tree with particular reference to hemodynamic event[J]. Circ Res，1972,30(1):23
6 Davies PF. Flow-mediated endothelial mechanotransduction[J]. Physiol Rev, 1995,75(2):519 (1999-03-08收稿，1999-07-21修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长海医院胸心外科，上海，200433；柳兆荣 李惜惜:复旦大学应用力学系
关键词：内皮细胞；切应力；细胞骨架
第二军医大学学报991030 摘要 目的：探讨稳态层流下的内皮细胞特征变化规律和血流切应力改变对血管内膜结构的影响。方法：采用胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞(PAEC)，模拟体内流动环境，建立平行平板流动腔模型。利用细胞定量图像分析系统和FITC-若丹明-次毒蕈环肽标记法，观察内皮细胞在稳态层流下形态与排列变化。结果：内皮细胞在1.0×10-5，2.5×10-5 kPa剪切18 h后，细胞趋于切应力作用方向排列，与静息态的细胞相比，长短轴比值变化显著[(1.20±0.10) vs (1.12±0.08)，(1.38±0.15) vs (1.12±0.08)，P<0.01)]，细胞面积无显著变化；在2.5×10-5 kPa剪切作用6 h后，细胞面积和长短轴比值无显著变化，而细胞内骨架沿切应力方向重组；在2.5×10-5 kPa剪切作用后的PAEC再次处于静息培养24 h后，细胞向静息态细胞转变。结论：血流动力学特性中切应力是引起血管内皮细胞形态发生变化的主要原因，细胞形态的改变是细胞胞质内骨架蛋白分子重组的表现；同时，切应力引起内皮细胞的应变是可逆的，当切应力撤除后，细胞亦趋于低切应力下的形态特征。
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中图分类号 R 331.32 文献标识码：A
Changes in the morphometric feature of endothelial cells under steady flow state
Han Lin, Zhang Baoren, Liu Zhaorong, Zhu Jialin, Hao Jiahua, Xu Zhiyun, Li Xixi
(Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To study the regular rule of changes in endothelial cells morphometric feature under steady flow state, and to investigate the effects of shear stress on the structure of vascular intima. Methods: Bovine pulmonary arterial endothelial cells(PAEC) were isolated and cultured with collagenase digestion. The parallel-plated flow chamber device was established to simulate blood flow environment in vitro. Changes in the cell morphometric parameters were analyzed quantitatively before and after shear flow exposure. The patterns of microfilament distribution in cells were observed by stained with rhodamine-phalloidin. Results: After 1.0×10-5 and 2.5×10-5 kPa shear flow exposure, PAEC were elongated and oriented to the direction of the flow, although there were no changes of cell area, the axis ratio(ratio of major axis and minor axis) changed significantly [(1.20±0.10) vs (1.12±0.08), (1.38±0.15) vs (1.12±0.08), P<0.01]. After 2.5×10-5 kPa shear flow exposure for 6 h the microfilaments were oriented to the direction of flow with no changes of the cell shapes. PAEC which exposed 2.5×10-5 kPa shear flow for 18 h were cultured under no-flow condition for 24 h again, the axis ratio decreased significantly[(1.12±0.11) vs (1.38±0.15), P<0.05].Conclusion:Shear stress,one of the flow mechanical characters,is major factor which affects vascular endothelial cell morphometric.The changes of cells morphometric is a manifestation of cytoskeleton protein remodeling.It is reversion after withdrawn shear force.
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KEY WORDS endothelial cell; shear stress; cytoskeleton
内皮细胞不仅是构成血液与血管平滑肌之间的生理屏障，而且是一高度活跃的代谢和内分泌细胞，其细胞膜上存在大量的受体和生物感受器，感知循环系统内环境的细微变化，通过合成和分泌这些活性物质，直接参与对平滑肌的调节，在维持循环内环境稳定中起着十分重要的作用，在心血管疾病的发生和发展过程中也有独特的作用[1,2]。
血流是机体循环系统的一种物理现象，它包括机械应力，层流、湍流，定常、脉动，分离、附着等流动特性，是调节内皮细胞结构和功能的自身机制之一；血流动力学环境的紊乱参与多种心血管疾病的病理生理过程。本实验研究稳态层流下的内皮细胞形态特征变化的规律，以期了解血流切应力改变对血管结构的影响。
1 材料和方法
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1.1 小牛肺动脉内皮细胞的培养和鉴定[3] 用0.1%胶原酶消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞(PAEC)，根据相差显微镜下观察细胞形态及凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测结果鉴定培养的细胞。用于本实验为第4～7代，PAEC接种于 110 mm×70 mm×10 mm玻璃平板，细胞长满后2 d用于剪切实验。
1.2 平行平板流动腔的建立和使用[4] 本实验装置由流室、灌流辅助系统、混合气体供应部分和恒温生化培养箱组成；流室是由聚碳酸脂平板附以厚为0.2 mm矩形硅胶垫圈，通过真空吸附铺有培养PAEC的玻璃平板组成， 80.0 mm×45.0 mm×0.2 mm；灌流辅助系统由上、下两只特制的玻璃贮液瓶、硅胶管和恒流泵组成，上、下贮液瓶之间的高度差(H)决定通过流室内的流量(Q)，恒流泵维持灌流液循环，灌流液为无血清DMEM培养液，总量为25 ml；混合气为95%空气+5% CO2。流室内PAEC所受切应力根据如下公式计算:
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τ=ρvhH/2 L
其中:ρ为灌流液密度；v为加速度，h为流室高度；L为流室腔长度。流室、灌注管道和贮液槽预先经高压灭菌，于37℃ SHH 生化培养箱内无菌条件下进行装配、使用。
1.3 内皮细胞形态学检查
1.3.1 内皮细胞形态参数分析 剪切作用后的内皮细胞用PBS漂洗3次，在室温下用2%甲醛和1%戊二醛混合液(pH 7.3)固定1 h，PBS液冲洗2次，再在0.5%醇溶伊红Y和0.125%考马斯亮蓝R-250混合液(体积分数为6/4)，染色过夜，蒸馏水彻底冲洗后晾干，利用通用颗粒图像分析系统(中科院自动化研究所)，选取约50个细胞分别测量细胞面积、长、短轴及它们的比例等形态参数。
1.3.2 内皮细胞骨架观察 剪切作用后的内皮细胞用PBS漂洗2次，室温下用3.7%甲醛固定液固定5 min，PBS漂2 min，在-20℃丙酮脱水4 min，37℃水浴中1% Triton X-100 抽提15 min，PBS冲洗后凉干，用含1%二甲基亚砜的0.05 mg/ml FITC-标记若丹明-次毒蕈环肽标记40 min，PBS漂洗30 min，于荧光显微镜下观察摄像。
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1.4 统计学处理 结果均以
表示，采用未配对资料的t检验。2 结 果
2.1 PAEC 培养和鉴定 光镜下见培养的PAEC呈多角形，单层生长达到融合后，呈鹅卵石样排列(图1A)；凝血Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ R∶Ag)检测见PAEC核周胞质呈紫褐色颗粒分布。
2.2 切应力对内皮细胞形态的影响 PAEC在2.5×10-5 kPa作用6,12,18 h后细胞由近似圆形向长梭形变化，细胞排列方向趋向于切应力作用的方向规则分布(图1B，C，D)；细胞在1.0×10-5 kPa作用18 h后，细胞同样趋于长梭形变化(图1E)；细胞在2.5×10-5 kPa作用18 h后，再重新处于静息态培养24 h，形态和排列又重新趋向静息态细胞特征(图1F)。
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图1 PAEC形态特征变化(10×40)
Fig 1 Changes of PAEC morphometric feature (10×40)
A: Static condition; B: After 6 h application of a 2.5×10-5 kPa shear stress; C: After 12 h application of a 2.5×10-5 kPa shear
stress; D: After 18 h application of a 2.5×10-5 kPa shear stress; E: After 18 h application of a 1.0×10-5 kPa shear stress;
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F: After 2.5×10-5 kPa shear flow exposure 18 h recultured in static condition for 24 h
2.3 切应力对内皮细胞形态因子的影响 PAEC在10，2.5×10-5 kPa剪切18 h后，与静息态细胞相比，长短轴比值显著增大；细胞在2.5×10-5 kPa作用18 h后，再重新处于静息态培养24 h后，长短轴比值显著减小[(1.38±0.15) vs (1.21±0.11)， P<0.05]。然而各种剪切状态下，细胞面积无显著变化(表1)。
表1 切应力作用下PAEC 形态因子的变化
Tab 1 Effect of shear stress on endothelial cell
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morphometric parameters (n=50,
) ConditionCell area (A/μm2)
Axis ratio (%)
Static condition
827±202
1.12±0.08
1.0×10-5 kPa×18 h
843±259
1.29±0.14
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2.5×10-5 kPa× 6 h
821±204
1.11±0.11
2.5×10-5 kPa×12 h
863±190
1.20±0.10
2.5×10-5 kPa×18 h
855±209
1.38±0.15
3 讨 论
以往的在体观察发现血管内皮细胞的形态特征与其所处的血流流动的环境密切相关，体内循环系统中不同部位的血管内皮细胞的形态排列迥异。血流速度和方向改变都能导致细胞排列和形态的变化。Flaherty等[5]曾切除狗主动脉片段，旋转90度，原位移植10 d后，发现细胞的长轴与排列方向均按血流方向重新定向，这体现了细胞对流动力学环境的适应。本实验应用流动腔技术定量地分析了内皮细胞在不同切应力作用下，细胞形态因子的变化规律，结果显示细胞的圆度、长轴的方向均发生了明显的变化，并呈现量效和时效关系，这表明血流力学特性中切应力是引起血管内皮细胞形态发生变化的主要原因。
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细胞形态的改变是细胞胞质内骨架蛋白分子重组的表现，本实验结果显示细胞沿剪切方向一致排列和伸长与细胞内骨架蛋白取向相同，并在形态变化之前，细胞内的骨架就发生重组。切应力引起骨架蛋白排列变化并不是简单的外力对构形的改建，而是一个复杂的生理适应过程，其机制尚不清楚。目前认为可能与细胞内的信号系统有关，当在切应力作用下,细胞膜上的离子通道开放,细胞内磷酸肌醇信号系统激活,细胞内第二信使,如肌醇三磷酸、Ca2+，H+浓度的变化影响肌动蛋白的聚合，而肌醇三磷酸使细胞内激酶激活，使与骨架蛋白结合的调节蛋白gelsolin，α-actinin和粘着斑vinculin和VNRS等磷酸化，引起细胞骨架的重组。血流环境改变引起细胞形状和排列的变化是由于细胞内骨架对应力的应变的一种表现形式[6]。
内皮细胞在血流环境中的形态学变化是由于细胞在外界应力作用下的应变，是自身适应过程，具有重要的病理生理意义。循环血管中血流的减慢和增速都能影响内膜层的结构，如高动力性肺动脉高压的晚期，内膜受侵蚀，内皮出现葱皮样病理改变，而被动性肺动脉高压也伴有内膜及内膜下基膜增厚。同时本实验发现切应力对内皮细胞的形态学影响是可逆的，当切应力撤除后，细胞亦趋于低切应力下的形态特征，说明当体内异常血流改善后，异常结构的内膜有可能恢复正常。(本文图1见封四)。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0801-03
参考文献
1 Peiro C, Redondo J, Rodriguez-Martinez MA, et al. Influence of endothelium on cultured vascular smooth muscle cell proliferation[J]. Hypertension,1995,25(4 pt 2):748
2 Schiffrin EL. Endothelin: potential role in hypertension and vascular hypertrophy[J]. Hypertension, 1995,25(6):1135
3 Ryan US, Clements E, Habliston D, et al, Isolation and culture of pulmonary artery endothelial cells[J]. Tissue cell,1978,10(3):535
, 百拇医药
4 Frangos JA, Eskin SG, McIntire LV, et al. Flow effects on prostacyclin production by cultured human endothelial cells[J]. Science,1985,277(4693):1477
5 Flaherty JT, Pierce JE, Ferrans VJ, et al. Endothelial nuclear patterns in the canine arterial tree with particular reference to hemodynamic event[J]. Circ Res，1972,30(1):23
6 Davies PF. Flow-mediated endothelial mechanotransduction[J]. Physiol Rev, 1995,75(2):519 (1999-03-08收稿，1999-07-21修回), http://www.100md.com