HSS介导依托泊甙对人肝细胞癌裸鼠移植瘤的抑制作用
作者：杨秀疆 宝建中 王 一 陈士葆 张兴荣
单位：第二军医大学长征医院消化内科，上海，200003；宝建中:第二军医大学基础医学部病理解剖学教研室；王 一:第二军医大学东方肝胆外科医院
关键词：肝细胞癌；肝细胞生长刺激物质；依托泊甙
第二军医大学学报991029 摘要 目的：了解肝细胞生长刺激物质(HSS)介导依托泊甙(VP-16)对肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法：建立人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型，对荷瘤小鼠腹腔内注射不同剂量VP-16及HSS治疗 2周；治疗结束后，于不同时间处死动物，进行病理学检查，并计算肿瘤生长抑制率。结果：与对照组相比，中、大剂量VP-16(0.75，1.5 μg/g)联合HSS(1 μg/g)组肿瘤生长明显受抑，抑瘤率分别为71%和69%(P<0.01)，但中、小剂量组之间差异无显著性(P>0.05)；而小剂量联合(VP-16 0.38 μg/g)组及单用HSS(1 μg/g)组较对照组无明显差异(P>0.05)，抑瘤率分别为23%和5%。单用大剂量VP-16副作用明显。中、大剂量VP-16联合HSS均可显著延长小鼠存活期。结论：HSS介导大、中剂量VP-16具有明显抑瘤效应，以中剂量为佳。
, http://www.100md.com
中图分类号 R 735.705 文献标识码：A
Inhibitory effect of HSS-mediated etoposide on xenograft hepatocellular carcinoma in nude mice
Yang Xiujiang, Bao Jianzhong, Wang Yi，Chen Shibao,Zhang Xingrong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To observe the inhibitory effect of hepatocyte-stimulating substance(HSS)-mediated etoposide(VP-16)on xenograft hepatocellular carcinoma in nude mice. Methods: VP-16 + HSS was injected into the peritoneal cavity of nude mice with xenograft hepatocellular carcinoma. The pathological changes were observed, and tumor growth inhibitory rate was calculated. Results: The tumor growth inhibitory rate in middle and large dosage of VP-16(0.75, 1.5 μg/g)+HSS(1 μg/g) group were 71% and 69%,respectively(P<0.01). Small dosage combined group(VP-16 0.38 μg/g) and single HSS group were 23% and 5%(P>0.05), respectively. Large dosage of VP-16(1.5 μg/g) resulted in side effect severely. The combination of VP-16 with HSS in middle dose had longer survival time. Conclusion: The effect of VP-16 in combination with HSS might improve the tumor inhibitory effect significantly.
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KEY WORDS hepatocelluar carcinoma; hepatocyte-stimulating substance; etoposide
肝细胞癌化疗之所以有效率低(多在20%左右)、存活率低，全身用药后易激活多药耐药基因为其根本原因[1]。在我国，肝细胞癌大多与肝硬化合并存在，肝功能差、合并门脉癌栓血循环差是其疗效不佳的重要原因。我们在细胞水平已证实肝细胞生长因子(HGF)介导极小剂量化疗药物明显诱导肝癌细胞形成凋亡[2]，但在整体水平是否有疗效值得进一步探讨。
本实验在建立人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型的基础上，用肝细胞生长刺激物质(HSS)联合化疗药物依托泊甙(VP-16)治疗，着重探讨中、小剂量VP-16联合HSS对人肝癌裸鼠移植瘤的作用。
1 材料和方法
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1.1 材料 4～6周龄裸小鼠43只，体质量(20±1.3)g, 中科院上海实验动物中心提供，雌雄兼用。SMMC 7721人肝癌细胞系由本校病理解剖学教研室建系并提供。VP-16购自上海医药工业研究院浦东药厂，批号96100。小牛血清、RPMI培养基(上海华美生物制品公司，Sigma); HSS:本校生物高分子实验室提供。
1.2 人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型的建立 参照文献[3]方法进行。取对数生长期SMMC 7721细胞，调整为5×107个/ml后，于每只裸鼠臀部两腿间皮下接种。
1.3 实验分组 待肿瘤长至0.8 cm左右(2周时间)，随机分成以下各组(联合用药者每组9只裸鼠、单用者每组8只)：(1) 生理盐水对照组，用同等剂量之生理盐水腹腔内注射；(2) 单用VP-16 (1.5 μg/g)组；(3) 单用HSS(1 μg/g)组；(4) 联合用药组， 大、中、小剂量VP-16 (1.5, 0.75, 0.38 μg/g)+HSS(1 μg/g)。每天用药1次，连续2周。
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1.4 裸鼠体质量、活动变化及饮食情况 实验前、实验过程中定期测量肿瘤三维直径。用药2周后处死裸鼠(每组均留3只用于观察存活时间)，剥离肿瘤，称取各组瘤质量，计算肿瘤大小及生长抑制率：
肿瘤体积V=1/6 π× D3 (D为三维直径的平均值)
1.5 病理学检查 包括巨检及镜检。取肿瘤及部分重要脏器的组织用10%甲醛固定、石蜡切片、HE染色、光镜下观察。
1.6 统计学处理 结果以
表示，采用t检验。
2 结 果
2.1 单一处理对移植瘤的影响 图1示各组肿瘤生长情况。单用大剂量VP-16者肿瘤生长速度明显变慢(P<0.01)，但副反应明显。单用HSS(1 μg/g )对肿瘤生长速度影响不大(P>0.05) 。
, 百拇医药
图1 肿瘤生长曲线
Fig 1 The growth curve of tumor
○: Control; △: HSS (1 μg/g); □: VP-16(1.5 μg/g); ●: HSS+VP-16 (0.38 μg/g); ▲: HSS+VP-16 (0.75
μg/g); ■: HSS+VP-16(1.5 μg/g)
2.2 HSS联合VP-16对移植瘤的影响 由表1可见，VP-16+HSS中剂量组与对照组相比，肿瘤生长受到明显抑制(P<0.01)，与大剂量者相比则无显著差异(P>0.05)，小剂量组者与对照相比差异不明显(P>0.05)。大剂量联合用药组裸鼠毒副反应明显，其中2只用药后12 d因出血死亡，余者均明显消瘦，呈现恶病质状态。
, 百拇医药
表1 不同处理组实验4周对肿瘤的抑制作用
Tab 1 The inhibiting effect on tumor in different
treated group after 4 weeks () Group
n
Tumor mass
(m/g)
Tumor inhibiting
ratio(%)
Normal saline
, 百拇医药
5
2.92±0.94
-
VP-16(1.5 μg/g)
5
1.48±0.21
49.29±2.13*
HSS(1 μg/g)
5
2.76±0.21
5.48±0.23
VP-16+HSS(1 μg/g)
, 百拇医药
1.5 μg/g
6
0.90±0.13
69.06±2.52**
0.75 μg/g
6
0.50±0.11
71.02±1.98**
0.38 μg/g
6
2.23±0.62
23.51±2.14
, 百拇医药
*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group
2.3 荷瘤小鼠体内肿瘤生长情况及小鼠存活期的观察 大、中剂量VP-16+HSS组小鼠存活时间分别为(51.20±1.27) d和(55.21±2.31) d，较单独大剂量化疗用药者、生理盐水对照组及单用HSS组小鼠存活期显著延长(P<0.01)。单用大剂量化疗药物者平均存活(38.62±1.54) d死亡，死于恶病质或出血、腹水；生理盐水对照组及单用HSS组小鼠平均存活(48.00±1.20) d和(47.00±2.12) d，两者无明显差异(P>0.05)。
3 讨 论
本实验结果表明，采用大、中剂量化疗药物VP-16(1.5, 0.75 μg/g)联合 HSS(1 μg/g)引起裸鼠移植瘤生长变慢或肿瘤缩小；单独用化疗药副作用明显，疗效差；单用HSS无治疗效果。提示HSS具有介导化疗药物促进抑瘤的作用。
, 百拇医药
临床上对肝细胞癌全身化疗一直持保留态度，单一用药的作用有限，只有少数药物反应率超过10%，联合化疗也未取得令人信服的进展[1]。对VP-16的前瞻性研究结果表明，该药有较强的抗癌活性，对许多难治性肿瘤有效。VP-16可与DNA链形成复合物，引起DNA双链短暂断裂，导致基因表达改变。有研究用他莫昔芬联合VP-16治疗肝癌可取得25%的良效[4]。HGF是迄今为止体内所见的最强的肝细胞有丝分裂原，但对包括肝癌细胞的多种癌细胞有抑制作用。体外实验表明HSS也有类似作用[5]。Shiota等[6]用HGF构建表达及体外培养肝细胞的方法均证实，HGF抑制肝癌细胞的活力，最大抑制率达80%。HGF对相同起源的正常和恶性肿瘤细胞为何表现出相反的作用，其机制仍不清楚。我们在细胞水平证实，HSS能抑制肝癌细胞活力，但无明显形态学损害的表现[2]，表明HSS联合中、小剂量化疗药物能诱导癌细胞凋亡，而对裸鼠移植瘤表现抑瘤作用，但其在整体条件下是否犹如HGF一样经过受体介导引起作用增强有待进一步证实。VP-16单独大剂量给药不及联合用药者效果显著，可能是我们在细胞水平采用每日用HSS、化疗药物为一次性用药，而在整体水平，由于肿瘤组织局部血供存在差异，瘤组织中细胞接触药物不会像细胞水平那样均匀一致[7]，所以我们用每天给化疗药物的方法以达到细胞水平时的药物作用效果。但每天用药增加了全身的毒副作用，致使大剂量者难以表现抑瘤作用。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0798-03
参考文献
1 Chearanai O, Plengvanit U, Asavanivh C，et al. Spontaneous rupture of primary hepatoma[J]. Cancer, 1983, 51(11):1532
2 杨秀疆，宝建中，陈士葆,等. HGF介导DXR诱导肝癌细胞凋亡的作用[J]. 肿瘤防治研究, 1998, 25(5):332
3 陶文照，何德华，康俊生, 等. 裸小鼠人肝癌组织模型的建立及其病理研究[J]. 第二军医大学学报，1989,10(增刊)：5
4 Cheng AL, Cheng YC, Yeh KH ，et al. Chronic oral etoposide and tamoxifen in the treatment of far-advanced hepatocellular carcinoma[J]. Cancer, 1996, 77(5): 872
, 百拇医药
5 Makowka L, Falk RE, Falk JA ，et al. The effect of liver cytosol on hepatic regeneration and tumor growth[J]. Cancer, 1983, 51(12):2181
6 Shiota G,Rhoads DB,Wang TC， et al. Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(1):373
7 Liu ML, Mars WM, Zamegar R，et al. Uptake and distribution of hepatocyte growth factor in normal and regenerating adult rat liver[J]. Am J Pathol, 1994, 144(1):129
(1999-02-27收稿，1999-07-28修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长征医院消化内科，上海，200003；宝建中:第二军医大学基础医学部病理解剖学教研室；王 一:第二军医大学东方肝胆外科医院
关键词：肝细胞癌；肝细胞生长刺激物质；依托泊甙
第二军医大学学报991029 摘要 目的：了解肝细胞生长刺激物质(HSS)介导依托泊甙(VP-16)对肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法：建立人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型，对荷瘤小鼠腹腔内注射不同剂量VP-16及HSS治疗 2周；治疗结束后，于不同时间处死动物，进行病理学检查，并计算肿瘤生长抑制率。结果：与对照组相比，中、大剂量VP-16(0.75，1.5 μg/g)联合HSS(1 μg/g)组肿瘤生长明显受抑，抑瘤率分别为71%和69%(P<0.01)，但中、小剂量组之间差异无显著性(P>0.05)；而小剂量联合(VP-16 0.38 μg/g)组及单用HSS(1 μg/g)组较对照组无明显差异(P>0.05)，抑瘤率分别为23%和5%。单用大剂量VP-16副作用明显。中、大剂量VP-16联合HSS均可显著延长小鼠存活期。结论：HSS介导大、中剂量VP-16具有明显抑瘤效应，以中剂量为佳。
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中图分类号 R 735.705 文献标识码：A
Inhibitory effect of HSS-mediated etoposide on xenograft hepatocellular carcinoma in nude mice
Yang Xiujiang, Bao Jianzhong, Wang Yi，Chen Shibao,Zhang Xingrong
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To observe the inhibitory effect of hepatocyte-stimulating substance(HSS)-mediated etoposide(VP-16)on xenograft hepatocellular carcinoma in nude mice. Methods: VP-16 + HSS was injected into the peritoneal cavity of nude mice with xenograft hepatocellular carcinoma. The pathological changes were observed, and tumor growth inhibitory rate was calculated. Results: The tumor growth inhibitory rate in middle and large dosage of VP-16(0.75, 1.5 μg/g)+HSS(1 μg/g) group were 71% and 69%,respectively(P<0.01). Small dosage combined group(VP-16 0.38 μg/g) and single HSS group were 23% and 5%(P>0.05), respectively. Large dosage of VP-16(1.5 μg/g) resulted in side effect severely. The combination of VP-16 with HSS in middle dose had longer survival time. Conclusion: The effect of VP-16 in combination with HSS might improve the tumor inhibitory effect significantly.
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KEY WORDS hepatocelluar carcinoma; hepatocyte-stimulating substance; etoposide
肝细胞癌化疗之所以有效率低(多在20%左右)、存活率低，全身用药后易激活多药耐药基因为其根本原因[1]。在我国，肝细胞癌大多与肝硬化合并存在，肝功能差、合并门脉癌栓血循环差是其疗效不佳的重要原因。我们在细胞水平已证实肝细胞生长因子(HGF)介导极小剂量化疗药物明显诱导肝癌细胞形成凋亡[2]，但在整体水平是否有疗效值得进一步探讨。
本实验在建立人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型的基础上，用肝细胞生长刺激物质(HSS)联合化疗药物依托泊甙(VP-16)治疗，着重探讨中、小剂量VP-16联合HSS对人肝癌裸鼠移植瘤的作用。
1 材料和方法
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1.1 材料 4～6周龄裸小鼠43只，体质量(20±1.3)g, 中科院上海实验动物中心提供，雌雄兼用。SMMC 7721人肝癌细胞系由本校病理解剖学教研室建系并提供。VP-16购自上海医药工业研究院浦东药厂，批号96100。小牛血清、RPMI培养基(上海华美生物制品公司，Sigma); HSS:本校生物高分子实验室提供。
1.2 人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型的建立 参照文献[3]方法进行。取对数生长期SMMC 7721细胞，调整为5×107个/ml后，于每只裸鼠臀部两腿间皮下接种。
1.3 实验分组 待肿瘤长至0.8 cm左右(2周时间)，随机分成以下各组(联合用药者每组9只裸鼠、单用者每组8只)：(1) 生理盐水对照组，用同等剂量之生理盐水腹腔内注射；(2) 单用VP-16 (1.5 μg/g)组；(3) 单用HSS(1 μg/g)组；(4) 联合用药组， 大、中、小剂量VP-16 (1.5, 0.75, 0.38 μg/g)+HSS(1 μg/g)。每天用药1次，连续2周。
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1.4 裸鼠体质量、活动变化及饮食情况 实验前、实验过程中定期测量肿瘤三维直径。用药2周后处死裸鼠(每组均留3只用于观察存活时间)，剥离肿瘤，称取各组瘤质量，计算肿瘤大小及生长抑制率：
肿瘤体积V=1/6 π× D3 (D为三维直径的平均值)
1.5 病理学检查 包括巨检及镜检。取肿瘤及部分重要脏器的组织用10%甲醛固定、石蜡切片、HE染色、光镜下观察。
1.6 统计学处理 结果以
表示，采用t检验。2 结 果
2.1 单一处理对移植瘤的影响 图1示各组肿瘤生长情况。单用大剂量VP-16者肿瘤生长速度明显变慢(P<0.01)，但副反应明显。单用HSS(1 μg/g )对肿瘤生长速度影响不大(P>0.05) 。
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图1 肿瘤生长曲线
Fig 1 The growth curve of tumor
○: Control; △: HSS (1 μg/g); □: VP-16(1.5 μg/g); ●: HSS+VP-16 (0.38 μg/g); ▲: HSS+VP-16 (0.75
μg/g); ■: HSS+VP-16(1.5 μg/g)
2.2 HSS联合VP-16对移植瘤的影响 由表1可见，VP-16+HSS中剂量组与对照组相比，肿瘤生长受到明显抑制(P<0.01)，与大剂量者相比则无显著差异(P>0.05)，小剂量组者与对照相比差异不明显(P>0.05)。大剂量联合用药组裸鼠毒副反应明显，其中2只用药后12 d因出血死亡，余者均明显消瘦，呈现恶病质状态。
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表1 不同处理组实验4周对肿瘤的抑制作用
Tab 1 The inhibiting effect on tumor in different
treated group after 4 weeks (
) Groupn
Tumor mass
(m/g)
Tumor inhibiting
ratio(%)
Normal saline
, 百拇医药
5
2.92±0.94
-
VP-16(1.5 μg/g)
5
1.48±0.21
49.29±2.13*
HSS(1 μg/g)
5
2.76±0.21
5.48±0.23
VP-16+HSS(1 μg/g)
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1.5 μg/g
6
0.90±0.13
69.06±2.52**
0.75 μg/g
6
0.50±0.11
71.02±1.98**
0.38 μg/g
6
2.23±0.62
23.51±2.14
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*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group
2.3 荷瘤小鼠体内肿瘤生长情况及小鼠存活期的观察 大、中剂量VP-16+HSS组小鼠存活时间分别为(51.20±1.27) d和(55.21±2.31) d，较单独大剂量化疗用药者、生理盐水对照组及单用HSS组小鼠存活期显著延长(P<0.01)。单用大剂量化疗药物者平均存活(38.62±1.54) d死亡，死于恶病质或出血、腹水；生理盐水对照组及单用HSS组小鼠平均存活(48.00±1.20) d和(47.00±2.12) d，两者无明显差异(P>0.05)。
3 讨 论
本实验结果表明，采用大、中剂量化疗药物VP-16(1.5, 0.75 μg/g)联合 HSS(1 μg/g)引起裸鼠移植瘤生长变慢或肿瘤缩小；单独用化疗药副作用明显，疗效差；单用HSS无治疗效果。提示HSS具有介导化疗药物促进抑瘤的作用。
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临床上对肝细胞癌全身化疗一直持保留态度，单一用药的作用有限，只有少数药物反应率超过10%，联合化疗也未取得令人信服的进展[1]。对VP-16的前瞻性研究结果表明，该药有较强的抗癌活性，对许多难治性肿瘤有效。VP-16可与DNA链形成复合物，引起DNA双链短暂断裂，导致基因表达改变。有研究用他莫昔芬联合VP-16治疗肝癌可取得25%的良效[4]。HGF是迄今为止体内所见的最强的肝细胞有丝分裂原，但对包括肝癌细胞的多种癌细胞有抑制作用。体外实验表明HSS也有类似作用[5]。Shiota等[6]用HGF构建表达及体外培养肝细胞的方法均证实，HGF抑制肝癌细胞的活力，最大抑制率达80%。HGF对相同起源的正常和恶性肿瘤细胞为何表现出相反的作用，其机制仍不清楚。我们在细胞水平证实，HSS能抑制肝癌细胞活力，但无明显形态学损害的表现[2]，表明HSS联合中、小剂量化疗药物能诱导癌细胞凋亡，而对裸鼠移植瘤表现抑瘤作用，但其在整体条件下是否犹如HGF一样经过受体介导引起作用增强有待进一步证实。VP-16单独大剂量给药不及联合用药者效果显著，可能是我们在细胞水平采用每日用HSS、化疗药物为一次性用药，而在整体水平，由于肿瘤组织局部血供存在差异，瘤组织中细胞接触药物不会像细胞水平那样均匀一致[7]，所以我们用每天给化疗药物的方法以达到细胞水平时的药物作用效果。但每天用药增加了全身的毒副作用，致使大剂量者难以表现抑瘤作用。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0798-03
参考文献
1 Chearanai O, Plengvanit U, Asavanivh C，et al. Spontaneous rupture of primary hepatoma[J]. Cancer, 1983, 51(11):1532
2 杨秀疆，宝建中，陈士葆,等. HGF介导DXR诱导肝癌细胞凋亡的作用[J]. 肿瘤防治研究, 1998, 25(5):332
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4 Cheng AL, Cheng YC, Yeh KH ，et al. Chronic oral etoposide and tamoxifen in the treatment of far-advanced hepatocellular carcinoma[J]. Cancer, 1996, 77(5): 872
, 百拇医药
5 Makowka L, Falk RE, Falk JA ，et al. The effect of liver cytosol on hepatic regeneration and tumor growth[J]. Cancer, 1983, 51(12):2181
6 Shiota G,Rhoads DB,Wang TC， et al. Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(1):373
7 Liu ML, Mars WM, Zamegar R，et al. Uptake and distribution of hepatocyte growth factor in normal and regenerating adult rat liver[J]. Am J Pathol, 1994, 144(1):129
(1999-02-27收稿，1999-07-28修回), http://www.100md.com