裸鼠脑内接种U-251MG细胞建立脑胶质瘤的模型
作者：王建军 祝 峙 高 莉 陶文照 肖 农 颜永碧 刘建涌
单位：第二军医大学基础医学部病理解剖学教研室，上海，200433；颜永碧：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室；刘建涌：第二军医大学长海医院感染科
关键词：脑肿瘤；动物模型；胶质细胞瘤
第二军医大学学报991026 摘要 目的：建立裸鼠脑内人胶质瘤模型。方法：应用自制的脑内注射细胞装置，将人的U-251MG细胞接种于9只裸鼠脑中。分别于接种后10，20，30，40和77 d处死动物并行病理解剖、GFAP免疫组化及电镜检查。结果：我们建立的模型，肿瘤在脑内生长稳定，其特性同于人脑胶质瘤。结论：接种后20 d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。
中图分类号 R 73-35 文献标识码：A
, http://www.100md.com Construction of glioma animal model by implantation of U-251MG into nude mice brain
Wang Jianjun, Zhu Zhi, Gao Li, Tao Wenzhao, Xiao Nong, Yan Yongbi, Liu Jianyong
(Department of Pathology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To set up human glioblastoma multiform model in nude mice. Methods: The U-251MG cell line was injected into 9 nude mice brains with self-prepared intracerebral injecting apparatus. These animals were killed 10, 20, 30, 40 and 77 d after injection, and pathologic analysis were made by light microscope, electron microscope and immunohistologic stain for GFAP. Results: The tumors growing stably in these nude mice brain possessed similar characteristic to human′s one. Conclusion:Twenty days after injection is the appropriate time to use the model.
, 百拇医药
KEY WORDS brain neoplasms; animal model; glioma
脑胶质细胞瘤是最常见的一种脑肿瘤。建立脑内肿瘤模型无疑是研究该肿瘤发生、发展，侵袭、转移等各种生物学行为最必要的条件。运用动物的胶质瘤细胞株接种于大鼠或小鼠的脑内，为肿瘤在脑内这一特定环境的研究提供了一定的有利条件，但动物的肿瘤与人的脑胶质细胞瘤有不完全相同之处，与人肿瘤的生物学研究尚有一定差距。为此，我们采用人的脑胶质瘤细胞株U-251MG接种于裸鼠的脑内，建立了一个脑胶质瘤脑内移植的模型。
1 材料和方法
1.1 接种细胞 人的U-251MG细胞株于10%小牛血清RP 1640完全培养液中单层细胞培养法传代生长。细胞于对数生长期时以0.25%胰酶消化液处理，收集细胞，离心计数后稀释细胞至104/μl浓度备用。接种细胞量2×104个/只。
, http://www.100md.com
1.2 实验动物 雌性BALB/c裸鼠9只，体质量17.9～23.3 g。鼠龄4～6周。
1.3 接种步骤 全部接种过程在超净台中进行。裸鼠经地西泮(安定)+氯氨酮腹腔注射麻醉(每种药剂量各0.5 μl/g)后，将动物放置于自制的脑内细胞注射装置下，消毒头颅部皮肤后，在裸鼠额部距颅中线左侧或右侧0.1 cm, 冠状缝前0.3 cm 处用装置上的微量进样器穿透皮肤和颅骨进入脑中1～2 mm，在15 min中缓慢注入U-251MG细胞悬液2 μl。除针前留针5 min，使细胞充分沉积后缓慢除针。术后无须注射抗菌素。
1.4 肿瘤生长观察指标 本实验动物分别在接种后10 d(2只)，20 d(2只)，30 d(3只)，40 d(1只)和77 d(1只)断椎活杀。然后进行以下检查：(1)解剖学和组织学检查：动物均做常规解剖，观察脑部肿瘤的部位和大小，依据公式：V(体积)=3/4πa(最长径)b2(最短径)求肿瘤的体积。留取脑组织及瘤体部以及部分主要脏器做镜检。标本用10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片HE染色。(2)电镜检查：取1例接种40 d裸鼠的脑肿瘤组织按电镜常规制片, H-800透射电镜观察。(3)免疫组化检查：以ABC法做GFAP的免疫组化染色(Daka公司产品)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 肿瘤生长与动物生存情况 肿瘤接种生长期间无1只动物死亡。1只裸鼠在接种20 d时出现跑动时身体向一侧偏斜，提起尾巴时身体快速旋转等神经症状。接种30 d以上的裸鼠可出现双眼凸起，注射侧头顶部隆起，身体消瘦等体征，但均未见明显的神经症状。
2.2 大体检查情况 所有裸鼠脑中均有肿瘤结节形成。按10 d，20 d, ≥30 d分为3组，各组肿瘤大小见表1。其中1只20 d活杀的动物除见脑组织中有肿瘤结节形成外，另在左颞枕部脑膜外见1粟粒大小的肿瘤并侵及小脑。30 d以后活杀的动物，肿瘤结节多占据脑实质的部分或大部，有的可见出血。有1例累及颅顶部骨膜，与骨膜组织粘附紧密。
表1 瘤体大小比较
Tab 1 Comparison of tumor size (
) Time(t/d)
, http://www.100md.com
n
Longest diameter
×shortest diameter
(A/mm2)
Average volume
(V/mm3)
10
2
1.5×1.0
3.5±0
20
2
, http://www.100md.com
(2.0～2.5)×(1.5～2.0)
16.0±2.8
≥30
5
(2.5～7.0)×(2.5～5.0)
251.1±172.65
2.3 组织学检查 各例均可见高度异型的星形胶质瘤细胞在脑实质内生长。 其中有3例肿瘤侵及室管膜壁。 室管膜腔内见散在瘤细胞。接种10 d的动物中， 瘤细胞呈多个小灶性分布， 有的瘤细胞团块似箭头样向周围组织中伸入(图1A)。 瘤组织中未见血管增生。 瘤细胞团块中少或无血管， 无坏死灶形成。 20 d时瘤组织中血管增多。 接种30 d以后的裸鼠，可见脑内瘤细胞团块多已融合成大的肿瘤结节， 多致脑中线轻重不等移位(图1B)。 团块周边部瘤细胞也似箭头样向周围组织伸入。 瘤组织中血管明显增生， 常有坏死灶形成。 其余脏器检查未见肿瘤转移。
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图1 U-251MG细胞移植入裸鼠脑中10 d and 77 d时的组织病理学特征
Fig 1 Histopathological features of tumors derived from the implantation of human
U-251MG cell line into the brain of nude mice day 10, 77 postimplantation
A: The tumor exhibits infiltrative growth. No vascular preliferation was observed within the transplant (HE×198);
B: The tumor tissue compress adjacent brain, resulting in migration of the brain tissue (HE×20)
, 百拇医药
2.4 电镜观察 瘤细胞系胶质细胞来源。瘤细胞突起内可见胶质丝，但较正常少。胶质细胞核不规则，胞质较少，核内常染色质较多，可见核内包含物。血管数目较多，血管周围间隙较宽，未见瘤细胞侵及血管。
2.5 免疫组化染色 GFAP免疫组化染色为阳性。
3 讨 论
为了研究肿瘤在体内的各种生物学特性，建立一个可靠的动物模型十分重要。1977年Rana等[1]成功地将人的胶质细胞瘤移植进入3只裸鼠体内。此后国外即建立了不少裸鼠脑内接种人脑肿瘤的模型。但由于建立此模型时的操作及对肿瘤生长的观察有一定困难，因此国内报道建立的模型多是将人脑肿瘤细胞接种于裸鼠皮下组织中。人脑肿瘤移植到裸鼠皮下组织中尽管可生长出形态及生物学行为与原来人肿瘤相似的肿瘤，但由于脑存在于一个相对独立的颅腔环境中，它有着与其他组织不太相同的微环境。正如有学者指出：胶质肿瘤细胞的生存需要特殊的代谢环境，这个环境只能在中枢神经系统中提供[2]。Jaworski等[3]的研究工作发现，将胶质瘤细胞株注入脑组织中，其生长的肿瘤组织中有brain enriched hyaluronan binding (BEHAB)的表达，而将相同的细胞株植入腹腔中，其生长出的肿瘤中却不表达BEHAB。由此也可看出，将人的脑肿瘤移植于裸鼠脑中较之移植于裸鼠的其他部位将更能确保模型体现原肿瘤的生物学特性。
, http://www.100md.com
脑移植瘤由于其所处环境的特殊，使得实验者难以对肿瘤生长情况进行观察。有作者报道，在脑内接种瘤细胞后13～16 d，大鼠即出现某些神经症状[4]。Finkelstein等[5]接种人胶质瘤细胞到裸鼠，宿主均在14～37 d中由于肿瘤生长，颅内压增高及脑疝形成，自发性死亡。而我们的观察发现除1只因肿瘤累及小脑的裸鼠外，其余裸鼠均未出现明显的神经症状和体征。即使接种后70余天活杀的裸鼠，肿瘤大小为7 mm×5.5 mm，体积已达498.7 mm3，裸鼠也并不因颅内压增高致死。其原因可能是由于裸鼠的颅骨很薄，给肿瘤的生长造成一定的缓冲空间，故可见双眼凸出，注射部位头颅部隆起。上述症状加上极度消瘦，这是肿瘤生长已较大的明显征象。
王伟民等[6]将C6细胞株接种于SD大鼠脑中，经MRI影像及病理检查发现：接种细胞2.0×106个/只1周时，肿瘤已基本形成，在2～3周间生长速度最快，3周以后其生长速度减慢。因而认为接种后1～2周为最佳利用模型时机。本实验在接种后10 d活杀动物，见肿瘤体积为3.5 mm3，显微镜下见肿瘤呈多个小灶性生长；到接种后20 d时，肿瘤平均体积增加4.6倍，无明显坏死；而到接种30 d后，平均瘤体积增至251.1 mm3，是20 d时的15.7倍，瘤组织中有较多坏死灶形成。上述情况表明，接种20 d后肿瘤进入增殖期，细胞数量明显增多，瘤体积明显增大，血管也随之增生；30 d以后肿瘤进入衰退期，瘤组织出现明显坏死。因此我们认为裸鼠接种20 d左右是利用该模型进行各种生物学和治疗实验的最佳时机。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0789-03
参考文献
1 Rana MW, Pinkerton H, Thornton H, et al. Heterotransplantation of human glioblastoma multiforme and meningioma to nude mice[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1977,155(1):85
2 Newton HB, Rosenblum MK, Walker RW. Extraneural metastasis of infratentorial glioblastoma multiforme to the peritoneal cavity[J]. Cancer, 1992,69(8):2149
, 百拇医药 3 Jaworski DM, Kelly GM, Piepmeier JM, et al. BEHAB (brain enriched hyalronan binding)is expressed in surgical samples of glioma and in intracranial grafts of invasive glioma cell lines[J]. Cancer Res, 1996,56(10):2293
4 Edvardsen K, Pedersen PH, Bjerkvig R, et al. Transfection of glioma cells with the neural cell adhesion molecule NCAM: effect on glioma cell invasion and growth in vivo[J]. Int J Cancer, 1994,58(1):116
5 Finkelstein SD, Black P, Nowak TP, et al. Histological characteristics and expression of acidic and basic fibroblast growth factor genes in intracerebral xenogeneic transplants of human glioma cells[J]. Neurosurgery, 1994,34(1):136
6 王伟民，朱 诚，张光霁，等. 脑立体定向接种C6细胞建立大鼠脑胶质瘤模型[J]. 中华实验外科杂志，1995，12(4):221
(1999-03-15收稿，1999-08-11修回), 百拇医药
单位：第二军医大学基础医学部病理解剖学教研室，上海，200433；颜永碧：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室；刘建涌：第二军医大学长海医院感染科
关键词：脑肿瘤；动物模型；胶质细胞瘤
第二军医大学学报991026 摘要 目的：建立裸鼠脑内人胶质瘤模型。方法：应用自制的脑内注射细胞装置，将人的U-251MG细胞接种于9只裸鼠脑中。分别于接种后10，20，30，40和77 d处死动物并行病理解剖、GFAP免疫组化及电镜检查。结果：我们建立的模型，肿瘤在脑内生长稳定，其特性同于人脑胶质瘤。结论：接种后20 d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。
中图分类号 R 73-35 文献标识码：A
, http://www.100md.com Construction of glioma animal model by implantation of U-251MG into nude mice brain
Wang Jianjun, Zhu Zhi, Gao Li, Tao Wenzhao, Xiao Nong, Yan Yongbi, Liu Jianyong
(Department of Pathology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To set up human glioblastoma multiform model in nude mice. Methods: The U-251MG cell line was injected into 9 nude mice brains with self-prepared intracerebral injecting apparatus. These animals were killed 10, 20, 30, 40 and 77 d after injection, and pathologic analysis were made by light microscope, electron microscope and immunohistologic stain for GFAP. Results: The tumors growing stably in these nude mice brain possessed similar characteristic to human′s one. Conclusion:Twenty days after injection is the appropriate time to use the model.
, 百拇医药
KEY WORDS brain neoplasms; animal model; glioma
脑胶质细胞瘤是最常见的一种脑肿瘤。建立脑内肿瘤模型无疑是研究该肿瘤发生、发展，侵袭、转移等各种生物学行为最必要的条件。运用动物的胶质瘤细胞株接种于大鼠或小鼠的脑内，为肿瘤在脑内这一特定环境的研究提供了一定的有利条件，但动物的肿瘤与人的脑胶质细胞瘤有不完全相同之处，与人肿瘤的生物学研究尚有一定差距。为此，我们采用人的脑胶质瘤细胞株U-251MG接种于裸鼠的脑内，建立了一个脑胶质瘤脑内移植的模型。
1 材料和方法
1.1 接种细胞 人的U-251MG细胞株于10%小牛血清RP 1640完全培养液中单层细胞培养法传代生长。细胞于对数生长期时以0.25%胰酶消化液处理，收集细胞，离心计数后稀释细胞至104/μl浓度备用。接种细胞量2×104个/只。
, http://www.100md.com
1.2 实验动物 雌性BALB/c裸鼠9只，体质量17.9～23.3 g。鼠龄4～6周。
1.3 接种步骤 全部接种过程在超净台中进行。裸鼠经地西泮(安定)+氯氨酮腹腔注射麻醉(每种药剂量各0.5 μl/g)后，将动物放置于自制的脑内细胞注射装置下，消毒头颅部皮肤后，在裸鼠额部距颅中线左侧或右侧0.1 cm, 冠状缝前0.3 cm 处用装置上的微量进样器穿透皮肤和颅骨进入脑中1～2 mm，在15 min中缓慢注入U-251MG细胞悬液2 μl。除针前留针5 min，使细胞充分沉积后缓慢除针。术后无须注射抗菌素。
1.4 肿瘤生长观察指标 本实验动物分别在接种后10 d(2只)，20 d(2只)，30 d(3只)，40 d(1只)和77 d(1只)断椎活杀。然后进行以下检查：(1)解剖学和组织学检查：动物均做常规解剖，观察脑部肿瘤的部位和大小，依据公式：V(体积)=3/4πa(最长径)b2(最短径)求肿瘤的体积。留取脑组织及瘤体部以及部分主要脏器做镜检。标本用10%甲醛液固定，石蜡包埋，切片HE染色。(2)电镜检查：取1例接种40 d裸鼠的脑肿瘤组织按电镜常规制片, H-800透射电镜观察。(3)免疫组化检查：以ABC法做GFAP的免疫组化染色(Daka公司产品)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 肿瘤生长与动物生存情况 肿瘤接种生长期间无1只动物死亡。1只裸鼠在接种20 d时出现跑动时身体向一侧偏斜，提起尾巴时身体快速旋转等神经症状。接种30 d以上的裸鼠可出现双眼凸起，注射侧头顶部隆起，身体消瘦等体征，但均未见明显的神经症状。
2.2 大体检查情况 所有裸鼠脑中均有肿瘤结节形成。按10 d，20 d, ≥30 d分为3组，各组肿瘤大小见表1。其中1只20 d活杀的动物除见脑组织中有肿瘤结节形成外，另在左颞枕部脑膜外见1粟粒大小的肿瘤并侵及小脑。30 d以后活杀的动物，肿瘤结节多占据脑实质的部分或大部，有的可见出血。有1例累及颅顶部骨膜，与骨膜组织粘附紧密。
表1 瘤体大小比较
Tab 1 Comparison of tumor size (
) Time(t/d), http://www.100md.com
n
Longest diameter
×shortest diameter
(A/mm2)
Average volume
(V/mm3)
10
2
1.5×1.0
3.5±0
20
2
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(2.0～2.5)×(1.5～2.0)
16.0±2.8
≥30
5
(2.5～7.0)×(2.5～5.0)
251.1±172.65
2.3 组织学检查 各例均可见高度异型的星形胶质瘤细胞在脑实质内生长。 其中有3例肿瘤侵及室管膜壁。 室管膜腔内见散在瘤细胞。接种10 d的动物中， 瘤细胞呈多个小灶性分布， 有的瘤细胞团块似箭头样向周围组织中伸入(图1A)。 瘤组织中未见血管增生。 瘤细胞团块中少或无血管， 无坏死灶形成。 20 d时瘤组织中血管增多。 接种30 d以后的裸鼠，可见脑内瘤细胞团块多已融合成大的肿瘤结节， 多致脑中线轻重不等移位(图1B)。 团块周边部瘤细胞也似箭头样向周围组织伸入。 瘤组织中血管明显增生， 常有坏死灶形成。 其余脏器检查未见肿瘤转移。
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图1 U-251MG细胞移植入裸鼠脑中10 d and 77 d时的组织病理学特征
Fig 1 Histopathological features of tumors derived from the implantation of human
U-251MG cell line into the brain of nude mice day 10, 77 postimplantation
A: The tumor exhibits infiltrative growth. No vascular preliferation was observed within the transplant (HE×198);
B: The tumor tissue compress adjacent brain, resulting in migration of the brain tissue (HE×20)
, 百拇医药
2.4 电镜观察 瘤细胞系胶质细胞来源。瘤细胞突起内可见胶质丝，但较正常少。胶质细胞核不规则，胞质较少，核内常染色质较多，可见核内包含物。血管数目较多，血管周围间隙较宽，未见瘤细胞侵及血管。
2.5 免疫组化染色 GFAP免疫组化染色为阳性。
3 讨 论
为了研究肿瘤在体内的各种生物学特性，建立一个可靠的动物模型十分重要。1977年Rana等[1]成功地将人的胶质细胞瘤移植进入3只裸鼠体内。此后国外即建立了不少裸鼠脑内接种人脑肿瘤的模型。但由于建立此模型时的操作及对肿瘤生长的观察有一定困难，因此国内报道建立的模型多是将人脑肿瘤细胞接种于裸鼠皮下组织中。人脑肿瘤移植到裸鼠皮下组织中尽管可生长出形态及生物学行为与原来人肿瘤相似的肿瘤，但由于脑存在于一个相对独立的颅腔环境中，它有着与其他组织不太相同的微环境。正如有学者指出：胶质肿瘤细胞的生存需要特殊的代谢环境，这个环境只能在中枢神经系统中提供[2]。Jaworski等[3]的研究工作发现，将胶质瘤细胞株注入脑组织中，其生长的肿瘤组织中有brain enriched hyaluronan binding (BEHAB)的表达，而将相同的细胞株植入腹腔中，其生长出的肿瘤中却不表达BEHAB。由此也可看出，将人的脑肿瘤移植于裸鼠脑中较之移植于裸鼠的其他部位将更能确保模型体现原肿瘤的生物学特性。
, http://www.100md.com
脑移植瘤由于其所处环境的特殊，使得实验者难以对肿瘤生长情况进行观察。有作者报道，在脑内接种瘤细胞后13～16 d，大鼠即出现某些神经症状[4]。Finkelstein等[5]接种人胶质瘤细胞到裸鼠，宿主均在14～37 d中由于肿瘤生长，颅内压增高及脑疝形成，自发性死亡。而我们的观察发现除1只因肿瘤累及小脑的裸鼠外，其余裸鼠均未出现明显的神经症状和体征。即使接种后70余天活杀的裸鼠，肿瘤大小为7 mm×5.5 mm，体积已达498.7 mm3，裸鼠也并不因颅内压增高致死。其原因可能是由于裸鼠的颅骨很薄，给肿瘤的生长造成一定的缓冲空间，故可见双眼凸出，注射部位头颅部隆起。上述症状加上极度消瘦，这是肿瘤生长已较大的明显征象。
王伟民等[6]将C6细胞株接种于SD大鼠脑中，经MRI影像及病理检查发现：接种细胞2.0×106个/只1周时，肿瘤已基本形成，在2～3周间生长速度最快，3周以后其生长速度减慢。因而认为接种后1～2周为最佳利用模型时机。本实验在接种后10 d活杀动物，见肿瘤体积为3.5 mm3，显微镜下见肿瘤呈多个小灶性生长；到接种后20 d时，肿瘤平均体积增加4.6倍，无明显坏死；而到接种30 d后，平均瘤体积增至251.1 mm3，是20 d时的15.7倍，瘤组织中有较多坏死灶形成。上述情况表明，接种20 d后肿瘤进入增殖期，细胞数量明显增多，瘤体积明显增大，血管也随之增生；30 d以后肿瘤进入衰退期，瘤组织出现明显坏死。因此我们认为裸鼠接种20 d左右是利用该模型进行各种生物学和治疗实验的最佳时机。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0789-03
参考文献
1 Rana MW, Pinkerton H, Thornton H, et al. Heterotransplantation of human glioblastoma multiforme and meningioma to nude mice[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1977,155(1):85
2 Newton HB, Rosenblum MK, Walker RW. Extraneural metastasis of infratentorial glioblastoma multiforme to the peritoneal cavity[J]. Cancer, 1992,69(8):2149
, 百拇医药 3 Jaworski DM, Kelly GM, Piepmeier JM, et al. BEHAB (brain enriched hyalronan binding)is expressed in surgical samples of glioma and in intracranial grafts of invasive glioma cell lines[J]. Cancer Res, 1996,56(10):2293
4 Edvardsen K, Pedersen PH, Bjerkvig R, et al. Transfection of glioma cells with the neural cell adhesion molecule NCAM: effect on glioma cell invasion and growth in vivo[J]. Int J Cancer, 1994,58(1):116
5 Finkelstein SD, Black P, Nowak TP, et al. Histological characteristics and expression of acidic and basic fibroblast growth factor genes in intracerebral xenogeneic transplants of human glioma cells[J]. Neurosurgery, 1994,34(1):136
6 王伟民，朱 诚，张光霁，等. 脑立体定向接种C6细胞建立大鼠脑胶质瘤模型[J]. 中华实验外科杂志，1995，12(4):221
(1999-03-15收稿，1999-08-11修回), 百拇医药