早期补液对烧伤大鼠心脏心肌细胞及血管内皮细胞的影响
作者：沙继宏 叶煦亭 唐洪泰 郑 尊 杨勇骥
单位：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室，上海，200433；唐洪泰：第二军医大学长海医院烧伤科
关键词：烧伤；液体复苏；心脏；血管内皮细胞
第二军医大学学报991023 摘要 目的：研究烧伤后大鼠心脏心肌细胞、血管内皮细胞(EC)的变化及早期补液对它们的影响。方法：应用了常规电镜技术及过氧化氢细胞化学方法。结果：烧伤后0.5 h血管EC肿胀，烧伤后4 h血管EC可向血管腔伸出较长突起，血管腔外有明显渗出，心肌细胞线粒体明显肿胀。过氧化氢细胞化学反应为血管EC血管腔面有较多致密沉积物。烧伤后8 h心肌细胞及血管EC损伤进一步加重。补液组烧伤后1，4，8 h，心肌细胞及血管EC损伤明显减轻，过氧化氢细胞化学反应电子致密沉积物也较少。烧伤后8 h细胞损伤开始恢复，血管EC出现大量吞饮泡，血管外液体重吸收。结论：烧伤后心肌细胞及血管EC发生损伤，早期补液对损伤有明显减轻作用。
, 百拇医药
中图分类号 R 644 文献标识码：A
Effects of early fluid resuscitation on rat myocardial cells and capillary endothelial cells after burn
Sha Jihong，Ye Xiting，Tang Hongtai，Zheng Zun， Yang Yongji
(Department of Cell Biology，Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To study the changes of rat myocardial cells and neighbour capillary endothelial cells(EC) after burn and the effects of early fluid resuscitation.Methods: Routine electron microscopic technique and cytochemical methods of hydrogen peroxide were performed. Results: Thirty min after burn, EC swelling was observed. Four hours after burn, projections of EC were observed. Mitochondria in myocardial cells swelled evidently. There were evident oozes outside blood vessels. In hydrogen peroxide cytochemistry group, there were electron dense materials on the luminal face of the EC. Eight hours after burn，the myocardial cells and capillary EC were more severely injured. In 1，4，8 h groups with fluid resuscitation, the injury degree of myocardial cells and EC were lower than that in the groups without fluid resuscitation. In hydrogen peroxide cytochemistry group, the electron dense materials on the luminal face of the EC decreased. Furthermore at 8 h after burn, there were a lot of pinocytosis in EC. Oozes outside blood vessels were absorbed. Conclusion: After burn, rat myocardial cells and EC are injured. Early fluid resuscitation can reduce the injury.
, 百拇医药
KEY WORDS burns; fluid resuscitation; heart; capilary endothelial cells
烧伤早期心脏即发生明显损伤，表现为心脏收缩和舒张功能降低，心输出量降低，严重者可出现心率紊乱甚至心力衰竭，在烧伤休克发生及发展中起重要作用。以往的研究多注重心肌细胞损伤，近年来人们对血管内皮细胞(EC)的损伤逐渐重视，认为EC不仅是损伤的靶器官，而且主动参与损伤[1，2]。早期补液对于烧伤的救治有着重要意义这已被公认，但早期补液对心脏心肌细胞及血管EC的影响尚不十分清楚。故本实验应用常规电镜技术及过氧化氢细胞化学技术对此进行研究。
1 材料和方法
1.1 动物及其分组 实验所用动物为SD大鼠，共28只，雌雄不拘，由第二军医大学动物实验中心提供，体质量200～250 g。1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，剃去背部毛发，在100℃水中烫20 s，造成25%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤。烫伤未补液组动物分为4组：烫伤后30 min组，1，4，8 h组。补液组烫伤后30 min从下肢静脉缓慢推注林格液2 ml/(kg.1%TBSA)，分为3组：烫伤后1，4，8 h组。每组4只动物，2只进行常规电镜观察，2只进行过氧化氢细胞化学观察。
, 百拇医药
1.2 常规电镜观察 模型制备后，取心肌组织(左心室)将其切成小块，用4%多聚甲醛固定，漂洗后锇酸后固定，脱水，Epon-812包埋，超薄切片，切片染色后在日立H-800电镜下观察。
1.3 过氧化氢细胞化学 模型制备后，向心脏灌流含铈生理溶液5 min(溶液配方：CeCl3 1 mmol/L, NaCl 140 mmol/L ,KCl 4 mmol/L,葡萄糖11 mmol/L，使用前向其中吹氧)[3]，再用3%多聚甲醛灌流固定。也可不用灌流固定，在含铈生理溶液中将心脏切成小块浸泡5 min,然后再用多聚甲醛固定。其余同常规电镜制样。
2 结 果
烧伤早期(30 min)毛细血管EC即可出现明显损伤，而此时心肌细胞尚无明显变化，血管EC肿胀，过氧化氢细胞化学反应为血管EC血管腔面有大量电子致密物沉积(图1A)。未补液组,烧伤后1 h心肌细胞线粒体出现肿胀，基质颗粒消失(图1B);烧伤后4 h血管EC除肿胀外，还向血管腔内伸出较长突起(图1C),血管外还可见有大量血浆渗出(图1D); 烧伤后8 h，心肌细胞及血管EC损伤较重，心肌细胞的细胞连接也可出现破坏(图1E)。过氧化氢细胞化学反应烧伤后1，4 h与烧伤后30 min基本类似；烧伤后8 h，过氧化氢细胞化学反应物沉淀较多。补液组烧伤后1，4 h，心肌细胞及血管EC的损伤则明显减轻，主要表现为EC肿胀程度及心肌细胞线粒体肿胀程度减轻，血管外血浆渗出减少；烧伤后8 h心肌细胞及血管EC损伤则开始恢复，主要表现为血管EC出现大量吞饮泡，血管外液体渗出明显减少(图1F)。过氧化氢细胞化学反应物沉淀也较未补液组少。
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图1 烧伤后早期心肌细胞和血管EC的变化
Fig 1 Early after burn, the changes of myocardial cells and EC
A: 0.5 h after burn, hydrogen peroxide cytochemistry(bar=0.5 μm);B: 1 h after burn, no fluid resuscitation group, mitochondria in myocardial cells swelled evidently(bar=1 μm);C: 4 h after burn, no fluid resuscitation group, projections of EC were observed. Hydrogen peroxide cytochemistry was positive (bar=0.5 μm);D: 4 h after burn, no fluid resuscitation group,evident oozes outside blood vessels (bar=0.5 μm);E: 8 h after burn, no fluid resuscitation group, cell junction of myocardial cells were damaged (bar= 1 μm);F: 8 h after burn, fluid resuscit-
, 百拇医药
ation group, a lot of pinocytosis in EC (bar= 0.5 μm)
3 讨 论
本实验结果表明烧伤后血管EC损伤发生较早，在烧伤早期(0.5 h)即发生，而此时心肌细胞尚未有明显改变。烧伤后1～4 h EC除肿胀外，还可向血管腔面伸出较长突起，该现象可能有一定的生理及病理意义，一方面增加了与血液的接触面，有利于吸收更多的氧，另一方面又可使血流速度减缓，从而使组织缺血及缺氧加重,细胞发生水肿。烧伤后8 h心肌细胞出现的心肌细胞连接受损，可能就是由于严重的心肌细胞水肿所致。烧伤后过氧化氢细胞化学反应为阳性，提示氧自由基参与了烧伤后心脏心肌细胞及血管EC的损伤，这与有关文献报道一致[4]，正常动物血管EC过氧化氢细胞化学反应为阴性。通常氧自由基的半衰期很短，故较难检测。过氧化氢的半衰期相对较长一点，本实验所用方法是检测过氧化氢。过氧化氢可与铈离子反应形成Ce(OH)2OOH,该物质在电镜下观察为电子致密物质[3，5]，该细胞化学反应特异性强，灵敏度高。另外，过氧化氢与铈离子反应很快，过氧化氢被消耗后，又有利于其他氧自由基转化为过氧化氢，故该方法基本可反映整个氧自由基产生情况。实验结果表明烧伤早期即有过氧化氢产生，产生部位为血管EC血管腔面，关于过氧化氢的来源，可能为血管EC所产生[6]。因为血管EC含有黄嘌呤脱氢氧化酶系，烧伤后可首先形成超氧阴离子自由基，进一步转化为过氧化氢。心肌细胞在烧伤后主要表现为线粒体肿胀，线粒体损伤必然导致ATP产生减少，这可能是烧伤后心脏收缩和舒张功能下降的重要原因。
, 百拇医药
烧伤早期补液对心脏心肌细胞及血管EC的损伤有明显减轻作用。最明显表现在烧伤后8 h心脏心肌细胞及血管EC损伤开始恢复，从图1-F中可以看出，血管EC出现大量吞饮泡，血管外液体渗出减少，另外图中还可见血管腔内有较多的泡状结构，可能由EC而来，因为有报道烧伤后循环EC增加[7]，但在本实验中，是否通过此方式加速血管外液体渗出重吸收？补液组过氧化氢细胞化学反应致密沉淀物也较未补液组减少，这提示早期补液有减少氧自由基损伤作用，若液体中加入抗自由基成分，效果可能更好。
文章编号：0258-879X(1999)10-0780-03
参考文献
1 王今达.90年代SIRS和MODS发病机制研究进展-血管内皮细胞功能失常[J]. 中国危重病急救医学, 1997, 9(12)：705
2 杨宗城.烧伤早期脏器损害发病机制的探讨[J]. 解放军医学杂志, 1998,23(2)：84
, 百拇医药
3 Shlafer M,Brosamer K,Forder JR, et al. Cerium chloride as a histochemical marker of hydrogen peroxide in reperfused ischemic hearts[J]. J Mol Cell Cardiol,1990,22(1):83
4 路 卫，陈玉林，刘 林，等. 烧伤休克延迟补液后氧自由基对心肌的损伤[J]. 中华整形烧伤外科杂志, 1995,11(2)：112
5 Karnovsky MJ. Cytochemistry and reactive oxygen species: a retrospective[J]. Histochemistry, 1994,102(1):15
6 Kerrigan CL,Stotland MA. Ischemia reperfusion injury: a re-view[J]. Microsurgery, 1993,14(3):165
7 杨宗城，罗向东，高建川，等.严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用[J]. 解放军医学杂志 ,1996,21(1)：10
(1999-04-29收稿，1999-08-30修回), 百拇医药
单位：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室，上海，200433；唐洪泰：第二军医大学长海医院烧伤科
关键词：烧伤；液体复苏；心脏；血管内皮细胞
第二军医大学学报991023 摘要 目的：研究烧伤后大鼠心脏心肌细胞、血管内皮细胞(EC)的变化及早期补液对它们的影响。方法：应用了常规电镜技术及过氧化氢细胞化学方法。结果：烧伤后0.5 h血管EC肿胀，烧伤后4 h血管EC可向血管腔伸出较长突起，血管腔外有明显渗出，心肌细胞线粒体明显肿胀。过氧化氢细胞化学反应为血管EC血管腔面有较多致密沉积物。烧伤后8 h心肌细胞及血管EC损伤进一步加重。补液组烧伤后1，4，8 h，心肌细胞及血管EC损伤明显减轻，过氧化氢细胞化学反应电子致密沉积物也较少。烧伤后8 h细胞损伤开始恢复，血管EC出现大量吞饮泡，血管外液体重吸收。结论：烧伤后心肌细胞及血管EC发生损伤，早期补液对损伤有明显减轻作用。
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中图分类号 R 644 文献标识码：A
Effects of early fluid resuscitation on rat myocardial cells and capillary endothelial cells after burn
Sha Jihong，Ye Xiting，Tang Hongtai，Zheng Zun， Yang Yongji
(Department of Cell Biology，Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To study the changes of rat myocardial cells and neighbour capillary endothelial cells(EC) after burn and the effects of early fluid resuscitation.Methods: Routine electron microscopic technique and cytochemical methods of hydrogen peroxide were performed. Results: Thirty min after burn, EC swelling was observed. Four hours after burn, projections of EC were observed. Mitochondria in myocardial cells swelled evidently. There were evident oozes outside blood vessels. In hydrogen peroxide cytochemistry group, there were electron dense materials on the luminal face of the EC. Eight hours after burn，the myocardial cells and capillary EC were more severely injured. In 1，4，8 h groups with fluid resuscitation, the injury degree of myocardial cells and EC were lower than that in the groups without fluid resuscitation. In hydrogen peroxide cytochemistry group, the electron dense materials on the luminal face of the EC decreased. Furthermore at 8 h after burn, there were a lot of pinocytosis in EC. Oozes outside blood vessels were absorbed. Conclusion: After burn, rat myocardial cells and EC are injured. Early fluid resuscitation can reduce the injury.
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KEY WORDS burns; fluid resuscitation; heart; capilary endothelial cells
烧伤早期心脏即发生明显损伤，表现为心脏收缩和舒张功能降低，心输出量降低，严重者可出现心率紊乱甚至心力衰竭，在烧伤休克发生及发展中起重要作用。以往的研究多注重心肌细胞损伤，近年来人们对血管内皮细胞(EC)的损伤逐渐重视，认为EC不仅是损伤的靶器官，而且主动参与损伤[1，2]。早期补液对于烧伤的救治有着重要意义这已被公认，但早期补液对心脏心肌细胞及血管EC的影响尚不十分清楚。故本实验应用常规电镜技术及过氧化氢细胞化学技术对此进行研究。
1 材料和方法
1.1 动物及其分组 实验所用动物为SD大鼠，共28只，雌雄不拘，由第二军医大学动物实验中心提供，体质量200～250 g。1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，剃去背部毛发，在100℃水中烫20 s，造成25%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤。烫伤未补液组动物分为4组：烫伤后30 min组，1，4，8 h组。补液组烫伤后30 min从下肢静脉缓慢推注林格液2 ml/(kg.1%TBSA)，分为3组：烫伤后1，4，8 h组。每组4只动物，2只进行常规电镜观察，2只进行过氧化氢细胞化学观察。
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1.2 常规电镜观察 模型制备后，取心肌组织(左心室)将其切成小块，用4%多聚甲醛固定，漂洗后锇酸后固定，脱水，Epon-812包埋，超薄切片，切片染色后在日立H-800电镜下观察。
1.3 过氧化氢细胞化学 模型制备后，向心脏灌流含铈生理溶液5 min(溶液配方：CeCl3 1 mmol/L, NaCl 140 mmol/L ,KCl 4 mmol/L,葡萄糖11 mmol/L，使用前向其中吹氧)[3]，再用3%多聚甲醛灌流固定。也可不用灌流固定，在含铈生理溶液中将心脏切成小块浸泡5 min,然后再用多聚甲醛固定。其余同常规电镜制样。
2 结 果
烧伤早期(30 min)毛细血管EC即可出现明显损伤，而此时心肌细胞尚无明显变化，血管EC肿胀，过氧化氢细胞化学反应为血管EC血管腔面有大量电子致密物沉积(图1A)。未补液组,烧伤后1 h心肌细胞线粒体出现肿胀，基质颗粒消失(图1B);烧伤后4 h血管EC除肿胀外，还向血管腔内伸出较长突起(图1C),血管外还可见有大量血浆渗出(图1D); 烧伤后8 h，心肌细胞及血管EC损伤较重，心肌细胞的细胞连接也可出现破坏(图1E)。过氧化氢细胞化学反应烧伤后1，4 h与烧伤后30 min基本类似；烧伤后8 h，过氧化氢细胞化学反应物沉淀较多。补液组烧伤后1，4 h，心肌细胞及血管EC的损伤则明显减轻，主要表现为EC肿胀程度及心肌细胞线粒体肿胀程度减轻，血管外血浆渗出减少；烧伤后8 h心肌细胞及血管EC损伤则开始恢复，主要表现为血管EC出现大量吞饮泡，血管外液体渗出明显减少(图1F)。过氧化氢细胞化学反应物沉淀也较未补液组少。
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图1 烧伤后早期心肌细胞和血管EC的变化
Fig 1 Early after burn, the changes of myocardial cells and EC
A: 0.5 h after burn, hydrogen peroxide cytochemistry(bar=0.5 μm);B: 1 h after burn, no fluid resuscitation group, mitochondria in myocardial cells swelled evidently(bar=1 μm);C: 4 h after burn, no fluid resuscitation group, projections of EC were observed. Hydrogen peroxide cytochemistry was positive (bar=0.5 μm);D: 4 h after burn, no fluid resuscitation group,evident oozes outside blood vessels (bar=0.5 μm);E: 8 h after burn, no fluid resuscitation group, cell junction of myocardial cells were damaged (bar= 1 μm);F: 8 h after burn, fluid resuscit-
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ation group, a lot of pinocytosis in EC (bar= 0.5 μm)
3 讨 论
本实验结果表明烧伤后血管EC损伤发生较早，在烧伤早期(0.5 h)即发生，而此时心肌细胞尚未有明显改变。烧伤后1～4 h EC除肿胀外，还可向血管腔面伸出较长突起，该现象可能有一定的生理及病理意义，一方面增加了与血液的接触面，有利于吸收更多的氧，另一方面又可使血流速度减缓，从而使组织缺血及缺氧加重,细胞发生水肿。烧伤后8 h心肌细胞出现的心肌细胞连接受损，可能就是由于严重的心肌细胞水肿所致。烧伤后过氧化氢细胞化学反应为阳性，提示氧自由基参与了烧伤后心脏心肌细胞及血管EC的损伤，这与有关文献报道一致[4]，正常动物血管EC过氧化氢细胞化学反应为阴性。通常氧自由基的半衰期很短，故较难检测。过氧化氢的半衰期相对较长一点，本实验所用方法是检测过氧化氢。过氧化氢可与铈离子反应形成Ce(OH)2OOH,该物质在电镜下观察为电子致密物质[3，5]，该细胞化学反应特异性强，灵敏度高。另外，过氧化氢与铈离子反应很快，过氧化氢被消耗后，又有利于其他氧自由基转化为过氧化氢，故该方法基本可反映整个氧自由基产生情况。实验结果表明烧伤早期即有过氧化氢产生，产生部位为血管EC血管腔面，关于过氧化氢的来源，可能为血管EC所产生[6]。因为血管EC含有黄嘌呤脱氢氧化酶系，烧伤后可首先形成超氧阴离子自由基，进一步转化为过氧化氢。心肌细胞在烧伤后主要表现为线粒体肿胀，线粒体损伤必然导致ATP产生减少，这可能是烧伤后心脏收缩和舒张功能下降的重要原因。
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烧伤早期补液对心脏心肌细胞及血管EC的损伤有明显减轻作用。最明显表现在烧伤后8 h心脏心肌细胞及血管EC损伤开始恢复，从图1-F中可以看出，血管EC出现大量吞饮泡，血管外液体渗出减少，另外图中还可见血管腔内有较多的泡状结构，可能由EC而来，因为有报道烧伤后循环EC增加[7]，但在本实验中，是否通过此方式加速血管外液体渗出重吸收？补液组过氧化氢细胞化学反应致密沉淀物也较未补液组减少，这提示早期补液有减少氧自由基损伤作用，若液体中加入抗自由基成分，效果可能更好。
文章编号：0258-879X(1999)10-0780-03
参考文献
1 王今达.90年代SIRS和MODS发病机制研究进展-血管内皮细胞功能失常[J]. 中国危重病急救医学, 1997, 9(12)：705
2 杨宗城.烧伤早期脏器损害发病机制的探讨[J]. 解放军医学杂志, 1998,23(2)：84
, 百拇医药
3 Shlafer M,Brosamer K,Forder JR, et al. Cerium chloride as a histochemical marker of hydrogen peroxide in reperfused ischemic hearts[J]. J Mol Cell Cardiol,1990,22(1):83
4 路 卫，陈玉林，刘 林，等. 烧伤休克延迟补液后氧自由基对心肌的损伤[J]. 中华整形烧伤外科杂志, 1995,11(2)：112
5 Karnovsky MJ. Cytochemistry and reactive oxygen species: a retrospective[J]. Histochemistry, 1994,102(1):15
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7 杨宗城，罗向东，高建川，等.严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用[J]. 解放军医学杂志 ,1996,21(1)：10
(1999-04-29收稿，1999-08-30修回), 百拇医药