氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响
作者：陈小松 王国俊 蔡 雄 余宏宇 胡以平
单位：第二军医大学长征医院感染科，上海，200003；余宏宇：第二军医大学长征医院病理科；胡以平：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室，上海，200433(通讯作者)
关键词：氧化苦参碱；肝炎病毒；乙型；转基因小鼠
第二军医大学学报991012 摘要 目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用，并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ICR-TgN(HBV adr 1.2)SMMU为动物模型，运用ELISA和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱100, 200, 300 mg/kg腹腔注射,1次/d,30 d后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量较空白对照组(予等体积生理盐水腹腔注射)均有明显的下降，且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱200 mg/kg作用10 d,20 d时小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。
, 百拇医药
中图分类号 R 373.21 文献标识码：A
Oxymatrine downregulate HBV gene expression in HBV transgenic mice
Chen Xiaosong, Wang Guojun, Cai Xiong, Yu Hongyu, Hu Yiping
(Department of Infectious Disease,Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To explore the effect of oxymatrine (Oxy) on HBV. Methods: HBV transgenic mice ICR-TgN (HBV adr 1.2)SMMU was used in this study. ELISA and immunohistochemistry methods were adopted to determine the expression level of HBV in liver of transgenic mice. Results: Injected with Oxy 100, 200 or 300 mg/kg intraperitonealy once a day for 30 days later, HBV transgenic mice showed lower HBV gene product content in liver than control (injected with saline for 30 days). Further study indicated that Oxy can downregulate HBV gene expression when injected 200 mg/kg for 10 and 20 days. Conclusion: Oxy can decrease the content of HBsAg and HBcAg in HBV transgenic mice liver at the same time.
, 百拇医药
KEY WORDS oxymatrine; hepatitis B virus; transgenic mice
慢性乙型肝炎为常见病，危害极大，临床采用氧化苦参碱注射液治疗慢性乙型肝炎已获得满意疗效[1]。为进一步研究氧化苦参碱有无抗乙型肝炎病毒作用并初步揭示其作用机制，采用乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠为动物模型进行了研究，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物：ICR-TgN(HBV adr 1.2 )SMMU小鼠，清洁级，由第二军医大学细胞生物学教研室及实验动物中心提供[2]；氧化苦参碱注射液购自宁夏制药厂(批号 961228)； 限制性内切酶、放射性核素、成套试剂分别购自Promega，Gibco、华美、华顺等公司；PCR引物自行设计，Gibco公司合成,上游引物5′CCCAATGGAA CACTCACC3′， 下游引物 5′AGGAACCACTGAACAAATGGC3′。
, 百拇医药
1.2 转基因小鼠的筛选鉴定 取2周龄小鼠尾组织1.5 cm ，剪碎，蛋白酶K消化过夜，酚、氯仿抽提基因组，PCR (94℃ 50 s ,60℃ 50 s ,72℃ 1 min 10 s, 循环30次)初筛后，行Southern blot 鉴定。
1.3 不同剂量氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠的影响 取8～12周龄转基因小鼠24只，雌雄各半，随机分为4组，分别予生理盐水(对照组)、氧化苦参碱(治疗组) 100，200，300 mg/kg,腹腔注射，1次/d，30 d后，处死小鼠，取肝脏、血清，分别进行肝脏组织HBsAg，HBeAg的ELISA 检测及HBsAg，HBcAg的免疫组化检测，测定血清丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、球蛋白。
1.4 氧化苦参碱作用不同时间对乙型肝炎病毒转基因小鼠的作用 取8～12周龄转基因小鼠16只，雌性，异戊巴比妥(70 μg/g)腹腔麻醉后，打开腹腔，取肝脏左叶约150 mg，关腹。2周后，予氧化苦参碱200 mg/kg， 腹腔注射，1次/d，分别于第10，20，30，60天随机各处死小鼠4只，取肝脏，与治疗前标本同时进行HBsAg，HBcAg的免疫组化检测。
, 百拇医药
1.5 肝组织匀浆的ELISA检测 取新鲜肝组织置蛋白抽提液(0.1 mol/L PBS，1% Triton，1 mmol/L PMSF )中 ，充分匀浆8次， 冻融3次，1.5×104 r/min离心10 min，取上清，测定蛋白浓度，-20℃备用，ELISA 检测时每孔加5 mg 总蛋白，按试剂盒说明操作。免疫组化(ABC法)参照常规方法进行，血清检测按常规方法进行。普通电镜检测由上海市第二医科大学电镜室完成。
2 结 果
2.1 不同剂量氧化苦参碱对乙型肝炎病毒的作用
2.1.1 对肝功能指标的影响 血清丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、球蛋白与治疗前比较无显著差异。
2.1.2 ELISA 检测结果 各组肝脏内HBeAg ELISA检测结果(
)分别为：生理盐水组 0.522±0.133，100 mg/kg组 0.188±0.090，200 mg/kg组 0.160±0.072，300 mg/kg组 0.068±0.044；统计学分析结果表明：治疗组与对照组之间有显著差异(F检验，P< 0.01 )，各治疗剂量之间无显著差异(P>0.05)。HBsAg 由于未知原因，非特异吸附强，结果不可信，未列出。
, 百拇医药
2.1.3 免疫组化检测结果 对照组6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg全部阳性。氧化苦参碱100 mg/kg组2/6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性；200 mg/kg组6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg均为阴性；300 mg/kg组2/6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性，且HBsAg，HBcAg两者变化一致。统计学分析结果表明：治疗组与对照组之间有显著差异(Fisher直接概率计算法P=0.005 )，各剂量组之间无显著差异(P=0.227)。结果表明：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内的表达。
2.2 氧化苦参碱作用不同时间对乙型肝炎病毒的作用 每个标本随机计数5个高倍镜视野，计数免疫组化阳性和阴性细胞数，χ2检验比较治疗前后有无显著差异。结果表明200 mg/kg氧化苦参碱治疗10 d，20 d组4只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性细胞数较治疗前均有明显减少，染色强度亦有明显下降(图1，图见封三上),HBsAg，HBcAg两者变化一致；30 d组有2只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性细胞数较治疗前有明显减少，染色强度亦有下降，60 d 组4只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性细胞数以及染色强度与治疗前比较均无明显改变。电镜检测结果亦表明治疗前胞质及胞核内均可见HBsAg，HBcAg样颗粒，治疗后未发现类似颗粒(图2)。
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图1 氧化苦参碱治疗前后小鼠肝脏内HBsAg和HBcAg的免疫组化结果(×400)
Fig 1 Immunohistochemistry results of HBsAg and HBcAg in mice liver before
and after Oxy treatment (×400)
A: HBsAg (before treatment); B: HBsAg (after treatment); C: HBcAg (before treatment);
D: HBcAg (after treatment)
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图2 氧化苦参碱治疗前后小鼠肝脏的电镜照片(×34 000)
Fig 2 Electron micrograph of mice liver before(A) and after(B) Oxy treatment (×34 000)
3 讨 论
氧化苦参碱是从中药苦豆子中提取的生物碱，苦参素注射液中氧化苦参碱含量超过98%。有报道苦参素注射液对慢性乙型肝炎患者血清HBeAg，HBVDNA阴转率分别为44.3 %和45.3%[1]。本研究所采用的乙型肝炎病毒转基因小鼠是第二军医大学细胞生物学教研室运用受精卵显微注射法建立的乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠[2]，其对乙型肝炎病毒是免疫耐受的，是研究药物抗乙型肝炎病毒作用的较理想动物模型。研究结果表明：氧化苦参碱有抗乙型肝炎病毒作用，可降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量，且对两者作用一致，无选择性作用，增大剂量、延长作用时间并不能进一步提高疗效，可能与小鼠处于免疫耐受状态有关。已知氧化苦参碱是一种较强的免疫抑制剂，可以抑制多种炎性因子的释放，有明确的抗炎作用，对IL-2 诱导的LAK 细胞杀瘤活性亦有较强抑制作用，故氧化苦参碱通过IL-2等细胞因子发挥其抗乙型肝炎病毒作用的可能性不大[3～6]。推测其作用机制如下：(1)可能诱导细胞内某种物质的产生，从而加强了乙型肝炎病毒基因产物的降解，有文献报道，氧化苦参碱可增加肝脏内细胞色素P450 的含量[7],氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒作用与诱导肝脏内细胞色素P450之间有无一定的联系尚待进一步的实验证实；(2)氧化苦参碱的化学结构与嘌呤类似，可能干扰病毒脱氧核糖核酸的合成，亦需进一步的实验证实。另据报道，苦参总碱对柯萨其病毒B3的蛋白合成有抑制作用[8]，表明苦参碱类生物碱对多种病毒都有抑制作用，其具体作用机制尚待进一步探讨。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0746-03
参考文献
1 蔡 雄,王国俊,瞿 瑶， 等. 氧化苦参碱注射液对慢性乙型肝炎的疗效观察[J]. 第二军医大学学报， 1997，18(1)：47
2 胡卫江,胡以平,李建秀， 等. 乙型肝炎病毒(adr亚型)转基因小鼠的研究[J]. 第二军医大学学报，1999，20(4)：212
3 廖 杰,张宝恒. 氧化苦参碱的抗炎症作用[J]. 北京医科大学学报, 1988，20(4)：313
4 尚红生，赵 娟，陈慰峰， 等. 苦参碱对巨噬细胞抑制P815肿瘤细胞增殖效应的影响[J]. 北京医科大学学报， 1986，18(2)：127
, 百拇医药
5 王会贤,章灵华,黄 艺， 等. 氧化苦参碱对LAK细胞活性的影响[J]. 免疫学杂志, 1994，10(1):17
6 Goidotti LG, Gulihut S, Chisari F, et al. Interleukin-2 and alpha/beta interferon down-regulate hepatitis B virus gene expression in vivo by tumor necrosis factor-dependent and independent pathways[J]. J Virology, 1994,68(3):1265
7 袁 ，吕式琪，姚 娴. 氧化苦参碱对环磷酰胺抗癌活性和毒性的影响[J]. 药学学报, 1987，22(4):245
8 陈福祥，刘晶星，陆德源. 苦参总碱体外抗柯萨奇病毒3型作用测定及其机理的初步研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志， 1995，9(2)：115
(1999-03-08收稿，1999-08-23修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长征医院感染科，上海，200003；余宏宇：第二军医大学长征医院病理科；胡以平：第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室，上海，200433(通讯作者)
关键词：氧化苦参碱；肝炎病毒；乙型；转基因小鼠
第二军医大学学报991012 摘要 目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用，并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ICR-TgN(HBV adr 1.2)SMMU为动物模型，运用ELISA和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱100, 200, 300 mg/kg腹腔注射,1次/d,30 d后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量较空白对照组(予等体积生理盐水腹腔注射)均有明显的下降，且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱200 mg/kg作用10 d,20 d时小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。
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中图分类号 R 373.21 文献标识码：A
Oxymatrine downregulate HBV gene expression in HBV transgenic mice
Chen Xiaosong, Wang Guojun, Cai Xiong, Yu Hongyu, Hu Yiping
(Department of Infectious Disease,Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To explore the effect of oxymatrine (Oxy) on HBV. Methods: HBV transgenic mice ICR-TgN (HBV adr 1.2)SMMU was used in this study. ELISA and immunohistochemistry methods were adopted to determine the expression level of HBV in liver of transgenic mice. Results: Injected with Oxy 100, 200 or 300 mg/kg intraperitonealy once a day for 30 days later, HBV transgenic mice showed lower HBV gene product content in liver than control (injected with saline for 30 days). Further study indicated that Oxy can downregulate HBV gene expression when injected 200 mg/kg for 10 and 20 days. Conclusion: Oxy can decrease the content of HBsAg and HBcAg in HBV transgenic mice liver at the same time.
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KEY WORDS oxymatrine; hepatitis B virus; transgenic mice
慢性乙型肝炎为常见病，危害极大，临床采用氧化苦参碱注射液治疗慢性乙型肝炎已获得满意疗效[1]。为进一步研究氧化苦参碱有无抗乙型肝炎病毒作用并初步揭示其作用机制，采用乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠为动物模型进行了研究，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物：ICR-TgN(HBV adr 1.2 )SMMU小鼠，清洁级，由第二军医大学细胞生物学教研室及实验动物中心提供[2]；氧化苦参碱注射液购自宁夏制药厂(批号 961228)； 限制性内切酶、放射性核素、成套试剂分别购自Promega，Gibco、华美、华顺等公司；PCR引物自行设计，Gibco公司合成,上游引物5′CCCAATGGAA CACTCACC3′， 下游引物 5′AGGAACCACTGAACAAATGGC3′。
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1.2 转基因小鼠的筛选鉴定 取2周龄小鼠尾组织1.5 cm ，剪碎，蛋白酶K消化过夜，酚、氯仿抽提基因组，PCR (94℃ 50 s ,60℃ 50 s ,72℃ 1 min 10 s, 循环30次)初筛后，行Southern blot 鉴定。
1.3 不同剂量氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠的影响 取8～12周龄转基因小鼠24只，雌雄各半，随机分为4组，分别予生理盐水(对照组)、氧化苦参碱(治疗组) 100，200，300 mg/kg,腹腔注射，1次/d，30 d后，处死小鼠，取肝脏、血清，分别进行肝脏组织HBsAg，HBeAg的ELISA 检测及HBsAg，HBcAg的免疫组化检测，测定血清丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、球蛋白。
1.4 氧化苦参碱作用不同时间对乙型肝炎病毒转基因小鼠的作用 取8～12周龄转基因小鼠16只，雌性，异戊巴比妥(70 μg/g)腹腔麻醉后，打开腹腔，取肝脏左叶约150 mg，关腹。2周后，予氧化苦参碱200 mg/kg， 腹腔注射，1次/d，分别于第10，20，30，60天随机各处死小鼠4只，取肝脏，与治疗前标本同时进行HBsAg，HBcAg的免疫组化检测。
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1.5 肝组织匀浆的ELISA检测 取新鲜肝组织置蛋白抽提液(0.1 mol/L PBS，1% Triton，1 mmol/L PMSF )中 ，充分匀浆8次， 冻融3次，1.5×104 r/min离心10 min，取上清，测定蛋白浓度，-20℃备用，ELISA 检测时每孔加5 mg 总蛋白，按试剂盒说明操作。免疫组化(ABC法)参照常规方法进行，血清检测按常规方法进行。普通电镜检测由上海市第二医科大学电镜室完成。
2 结 果
2.1 不同剂量氧化苦参碱对乙型肝炎病毒的作用
2.1.1 对肝功能指标的影响 血清丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、球蛋白与治疗前比较无显著差异。
2.1.2 ELISA 检测结果 各组肝脏内HBeAg ELISA检测结果(
)分别为：生理盐水组 0.522±0.133，100 mg/kg组 0.188±0.090，200 mg/kg组 0.160±0.072，300 mg/kg组 0.068±0.044；统计学分析结果表明：治疗组与对照组之间有显著差异(F检验，P< 0.01 )，各治疗剂量之间无显著差异(P>0.05)。HBsAg 由于未知原因，非特异吸附强，结果不可信，未列出。, 百拇医药
2.1.3 免疫组化检测结果 对照组6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg全部阳性。氧化苦参碱100 mg/kg组2/6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性；200 mg/kg组6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg均为阴性；300 mg/kg组2/6只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性，且HBsAg，HBcAg两者变化一致。统计学分析结果表明：治疗组与对照组之间有显著差异(Fisher直接概率计算法P=0.005 )，各剂量组之间无显著差异(P=0.227)。结果表明：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内的表达。
2.2 氧化苦参碱作用不同时间对乙型肝炎病毒的作用 每个标本随机计数5个高倍镜视野，计数免疫组化阳性和阴性细胞数，χ2检验比较治疗前后有无显著差异。结果表明200 mg/kg氧化苦参碱治疗10 d，20 d组4只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性细胞数较治疗前均有明显减少，染色强度亦有明显下降(图1，图见封三上),HBsAg，HBcAg两者变化一致；30 d组有2只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性细胞数较治疗前有明显减少，染色强度亦有下降，60 d 组4只小鼠肝脏内HBsAg，HBcAg阳性细胞数以及染色强度与治疗前比较均无明显改变。电镜检测结果亦表明治疗前胞质及胞核内均可见HBsAg，HBcAg样颗粒，治疗后未发现类似颗粒(图2)。
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图1 氧化苦参碱治疗前后小鼠肝脏内HBsAg和HBcAg的免疫组化结果(×400)
Fig 1 Immunohistochemistry results of HBsAg and HBcAg in mice liver before
and after Oxy treatment (×400)
A: HBsAg (before treatment); B: HBsAg (after treatment); C: HBcAg (before treatment);
D: HBcAg (after treatment)
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图2 氧化苦参碱治疗前后小鼠肝脏的电镜照片(×34 000)
Fig 2 Electron micrograph of mice liver before(A) and after(B) Oxy treatment (×34 000)
3 讨 论
氧化苦参碱是从中药苦豆子中提取的生物碱，苦参素注射液中氧化苦参碱含量超过98%。有报道苦参素注射液对慢性乙型肝炎患者血清HBeAg，HBVDNA阴转率分别为44.3 %和45.3%[1]。本研究所采用的乙型肝炎病毒转基因小鼠是第二军医大学细胞生物学教研室运用受精卵显微注射法建立的乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠[2]，其对乙型肝炎病毒是免疫耐受的，是研究药物抗乙型肝炎病毒作用的较理想动物模型。研究结果表明：氧化苦参碱有抗乙型肝炎病毒作用，可降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg 和HBcAg的含量，且对两者作用一致，无选择性作用，增大剂量、延长作用时间并不能进一步提高疗效，可能与小鼠处于免疫耐受状态有关。已知氧化苦参碱是一种较强的免疫抑制剂，可以抑制多种炎性因子的释放，有明确的抗炎作用，对IL-2 诱导的LAK 细胞杀瘤活性亦有较强抑制作用，故氧化苦参碱通过IL-2等细胞因子发挥其抗乙型肝炎病毒作用的可能性不大[3～6]。推测其作用机制如下：(1)可能诱导细胞内某种物质的产生，从而加强了乙型肝炎病毒基因产物的降解，有文献报道，氧化苦参碱可增加肝脏内细胞色素P450 的含量[7],氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒作用与诱导肝脏内细胞色素P450之间有无一定的联系尚待进一步的实验证实；(2)氧化苦参碱的化学结构与嘌呤类似，可能干扰病毒脱氧核糖核酸的合成，亦需进一步的实验证实。另据报道，苦参总碱对柯萨其病毒B3的蛋白合成有抑制作用[8]，表明苦参碱类生物碱对多种病毒都有抑制作用，其具体作用机制尚待进一步探讨。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0746-03
参考文献
1 蔡 雄,王国俊,瞿 瑶， 等. 氧化苦参碱注射液对慢性乙型肝炎的疗效观察[J]. 第二军医大学学报， 1997，18(1)：47
2 胡卫江,胡以平,李建秀， 等. 乙型肝炎病毒(adr亚型)转基因小鼠的研究[J]. 第二军医大学学报，1999，20(4)：212
3 廖 杰,张宝恒. 氧化苦参碱的抗炎症作用[J]. 北京医科大学学报, 1988，20(4)：313
4 尚红生，赵 娟，陈慰峰， 等. 苦参碱对巨噬细胞抑制P815肿瘤细胞增殖效应的影响[J]. 北京医科大学学报， 1986，18(2)：127
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5 王会贤,章灵华,黄 艺， 等. 氧化苦参碱对LAK细胞活性的影响[J]. 免疫学杂志, 1994，10(1):17
6 Goidotti LG, Gulihut S, Chisari F, et al. Interleukin-2 and alpha/beta interferon down-regulate hepatitis B virus gene expression in vivo by tumor necrosis factor-dependent and independent pathways[J]. J Virology, 1994,68(3):1265
7 袁 ，吕式琪，姚 娴. 氧化苦参碱对环磷酰胺抗癌活性和毒性的影响[J]. 药学学报, 1987，22(4):245
8 陈福祥，刘晶星，陆德源. 苦参总碱体外抗柯萨奇病毒3型作用测定及其机理的初步研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志， 1995，9(2)：115
(1999-03-08收稿，1999-08-23修回), http://www.100md.com