肿瘤转移抑制基因nm23-H1 mRNA在人卵巢癌中的表达
作者：周晓宁 陈晓东 王昭梅 沙金燕 崔 英 顾 青 姜海燕
单位：第二军医大学长海医院妇产科，上海，200433；陈晓东：广州军区广州总医院病理科
关键词：卵巢肿瘤；肿瘤转移抑制基因；原位杂交
第二军医大学学报991011 摘要 目的：通过检测人卵巢癌标本中肿瘤转移抑制基因nm23-H1 mRNA的表达，了解其临床意义及其与预后的关系。 方法：应用原位杂交技术检测43例人卵巢癌标本中nm23-H1 mRNA的表达水平。 结果：nm23-H1 mRNA表达水平与卵巢癌的病理组织学类型无关(P>0.05)；与患者术时有淋巴结或大网膜转移呈负相关(P<0.05)；且转移灶的阳性表达率低于原发灶(P<0.05)。 结论：nm23-H1基因在人卵巢癌的扩散和转移过程中可能发挥着抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达水平具有重要的临床意义。
, 百拇医药
中图分类号 R 737.31 文献标识码：A
Expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 mRNA in human ovarian carcinomas
Zhou Xiaoning, Chen Xiaodong, Wang Zhaomei, Sha Jinyan, Cui Ying, Gu Qing, Jiang Haiyan
(Department of Obstetrics and Gynecology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To detect the expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 mRNA in human ovarian carcinomas, and to evaluate its clinic value as well as its relationship with prognosis. Methods: The expression of nm23-H1 mRNA was detected in 43 cases of human ovarian carcinomas by means of in situ hybridization. Results: The expression of nm23-H1 mRNA did not statistically correlated with histologic types of ovarian carcinomas (P>0.05); there was an inverse relationship between nm23-H1 mRNA level and those cases with metastasis foci both in lymph nodes and in the great omentum(P<0.05); positive rate of nm23-H1 mRNA was higher in primary than in metastatic foci(P<0.05). Conclusions: nm23-H1 gene may play an important role in suppressing metastasis of ovarian carcinomas. The expression of nm23-H1 gene in ovarian cancer tissues may serve as one of assessable factors for prognosis in ovarian carcinoma.
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KEY WORDS ovarian heoplasms; tumor metastasis suppressor gene; in situ hybridization
卵巢癌的发病率近年不断上升，多数患者就诊时就已有腹腔内播散或远处脏器的转移，仅约20%的患者肿瘤尚局限在盆腔。而对卵巢肿瘤发生转移的机制及其相关基因和分子水平的变化，目前所知甚少。nm23基因是近年来颇受重视的肿瘤转移抑制基因，是1988年首次从鼠黑素瘤K-1735细胞株中分离得到，它在低转移细胞株中的表达强度约为高转移细胞株的10倍。研究发现，在人基因组中存在着两个nm23基因：nm23-H1基因和nm23-H2基因，它们均编码17 kd的蛋白质，其中nm23-H1基因的表达水平与肿瘤转移的关系更为密切[1]。研究结果证实，在人乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑素瘤等肿瘤组织中，nm23-H1基因的表达降低与转移发生和预后差密切相关。本实验对43例人卵巢癌组织中nm23-H1 基因的mRNA进行了原位检测，旨在分析nm23-H1 基因与卵巢癌转移的相关性，希望为临床治疗方案的选择及患者预后判断提供客观依据。
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1 材料和方法
1.1 标本 共采用43例人卵巢癌标本，根据FIGO卵巢恶性肿瘤分期标准(1985年)，Ⅰ～Ⅱ期16例，取其原发灶标本；Ⅲ～Ⅳ期27例，分别取其原发灶和淋巴结或网膜转移灶标本。所有标本均于组织离体后0.5 h内无菌采集，置4%多聚甲醛PBS(pH 7.4)固定1 h，置15%蔗糖PBS漂洗4～5 h，即行冰冻切片，切片厚约15 μm，载玻片预先经严格处理灭活RNA酶，然后涂布铬矾明胶(0.01%铬矾，0.1%明胶)。
1.2 制备cRNA探针 nm23-H1 cDNA由美国Rosengard博士转赠。测序结果与报道相符。载体质粒为PGEM-4Z。经限制酶HindⅢ或SmaⅠ酶切线性化后作为模板分别合成反义和正义探针。用地高辛RNA标记试剂盒(DIG-RNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim公司)标记探针。每次标记加入线性化模板1 μg，新合成的标记cRNA探针约10 μg。反义cRNA探针全长约971 bp，其中编码区732 bp，5′端非编码区144 bp，3′端非编码区约95 bp。
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1.3 原位杂交 原位杂交操作流程按常规稍加改良进行。冰冻切片冷风稍吹干，用4%多聚甲醛PBS(pH 7.4)4℃固定30 min，37℃烤片12 h，依次用PBS，TritonX-100PBS洗脱；蛋白酶K消化，37℃ 30 min；消化后再用4%多聚甲醛PBS固定10 min；PBS，0.25%乙酸酐和2×SSC洗后进行杂交。杂交液成分为：50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，5×SSC ，5× Denhardt液，2% SDS, 100 μg/ml变性的鲱精DNA，2～4 μg/ml nm23-H1反义cRNA探针。每张切片加25 μl杂交液，盖石蜡膜；杂交温度设置在50～55℃，12～16 h。梯度洗脱液洗(4×SSC，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，0.05 mol/L PBS)；加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim公司)1∶500稀释，25℃ 4 h；PBS洗；洗脱液Ⅰ(含100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；100 mmol/L NaCl；50 mmol/L MgCl2)和洗脱液Ⅱ(含100 mmol/L Tris-HCl, pH 9.5;100 mmol/L NaCl；50 mmol/L MgCl2)洗后显色；显色液用洗脱液Ⅱ新鲜配制，含NBT 400 mg/ml，BICP 200 mg/ml，每张切片加40 μl，25℃避光显色。每隔1 h观察颜色反应。用PBS洗终止显色反应。经100%乙醇，二甲苯处理后，中性树胶封片，避光保存。
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1.4 对照设置 阴性对照：(1) 杂交前用RNase 100 μg/ml，37℃ 1 h预处理组织切片；(2) 用nm23-H1正义cRNA探针代替nm23-H1反义cRNA探针；(3) 用不含nm23-H1反义cRNA探针的预杂交液进行杂交反应。阳性对照：用已知表达nm23-H1 mRNA的人肝癌组织切片进行杂交反应，结果为阳性。
1.5 统计学处理 用χ2检验判定差异显著性。
2 结 果
2.1 结果判定 原位杂交染色显示nm23-H1 mRNA阳性产物定位于胞质内，为蓝色颗粒或团块(图1)。
, http://www.100md.com 图1 卵巢癌nm23-H1 mRNA原位杂交染色结果
Fig 1 Results of nm23-H1 mRNA in situ hybridization stain in ovarian carcinoma
A:Positive×100; B:Positive×200
2.2 nm23-H1 mRNA表达与不同组织学类型卵巢癌的关系 43例卵巢癌原发灶标本中，浆液性囊腺癌20例， 阳性染色7例， 阳性率35.0%；粘液性囊腺癌9例，阳性染色5例，阳性率55.6%；低分化腺癌8例，阳性染色3例，阳性率37.5%；子宫内膜样腺癌6例，阳性染色3例，阳性率50.0%。各组织学类型间nm23-H1 mRNA的阳性表达率，经统计学处理，相差不显著(P>0.05)。
2.3 nm23-H1 mRNA表达与卵巢癌有否淋巴结和网膜转移的关系 43例原发灶标本中，有淋巴结网膜转移的26例，阳性染色7例，阳性率26.9%；无转移者17例，阳性染色11例，阳性率64.7%。两者nm23-H1 mRNA 的阳性表达率，经统计学处理，相差显著(P<0.05)，nm23-H1 mRNA 的阳性表达率与卵巢癌发生转移呈负相关。
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2.4 卵巢癌原发灶、转移灶间nm23-H1 mRNA 表达的关系 26例术时有淋巴结网膜转移的患者，原发灶阳性染色7例，阳性率26.9%；转移灶阳性染色1例，阳性率3.9%。两组间nm23-H1 mRNA的阳性表达率，经统计学处理，相差显著(P<0.05)。
3 讨 论
nm23基因发现后，国内外学者从多个角度对其进行了深入的研究，结果显示，该基因编码蛋白质的生化性质、结构功能都与肿瘤转移密切相关。nm23基因作为转移抑制基因，已被多数学者所接受。本实验的结果也提示，在人卵巢癌组织中，nm23-H1 mRNA的表达水平与卵巢癌发生淋巴结网膜转移呈负相关，且原发灶的nm23-H1 mRNA 水平高于转移灶，与多数文献报道相符[2～6] 。本实验结果还发现，nm23-H1 mRNA水平与卵巢癌的组织学类型无关，这与部分学者的研究结果一致[7，8]。Scambia等曾从分子和蛋白质水平研究了106例原发性卵巢癌患者的nm23基因，发现在无淋巴结转移的患者中，nm23-H1阳性率较高，且阳性患者中对化疗反应性佳的比例也较高，其5年生存率亦明显高于nm23-H1阴性者，认为nm23-H1含量测定对临床上治疗选择及预后判断具有重要的指导意义。目前在nm23基因与卵巢癌的相关性研究中的结论尚不一致，但多数学者支持nm23基因在卵巢癌中具有转移抑制作用和nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因的假说。本研究结果亦显示，nm23-H1基因在人卵巢癌转移过程中发挥着抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达水平有重要的临床意义，可望为患者的治疗选择及预后判断提供客观的实验依据。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0743-03
参考文献
1 Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential[J]. J Natl Cancer Inst, 1988, 80(3): 200
2 Viel A, Agnese LD, Canzonieri V, et al. Suppressive role of the metastasis-related nm23-H1 gene in human ovarian carcinomas: association of high messenger RNA expression with lack of lymph node metastasis[J]. Cancer Res, 1995, 55(15): 2645
, 百拇医药
3 Mandai M, Konishi I, Komatsu T, et al. Mutation of the nm23 gene, loss of heterozygosity at the nm23 locus and K-ras mutation in ovarian carcinoma: correlation with tumour progression and nm23 gene expression[J]. Br J Cancer,1995, 72(3): 691
4 Mandai M, Konishi I, Koshiyama M, et al. Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas: correlation with clinicopathology, EGFR, c-erbB-2, and c-erbB-3 genes, and sex steroid receptor expression[J]. Cancer Res,1994, 54(7): 1825
, http://www.100md.com
5 Scambia G, Ferrandina G, Marone M, et al. nm23 in ovarian cancer: correlation with clinical outcome and other clinicopathologic and biochemical prognostic parameters[J]. J Clin Oncol,1996, 14(2): 334
6 吴晓华，蔡树模，张志毅，等.卵巢肿瘤中癌基因nm23-H1,c-erbB-2,ras和P53的蛋白表达与腹膜后淋巴结转移关系的研究[J]. 肿瘤， 1997,17(3)：134
7 Harlozinska A, Bar JK, Gerber J. nm23 expression in tissue sections and tumor effusion cells of ovarian neoplasms[J]. Int J Cancer. 1996,69(5): 415
8 Leary JA, Kerr J, Chenevix-trench G, et al. Increased expression of the NME1 gene is associated with metastasis in epithelial ovarian cancer[J]. Int J Cancer, 1995, 64(3): 189
(1999-01-22收稿，1999-08-20修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院妇产科，上海，200433；陈晓东：广州军区广州总医院病理科
关键词：卵巢肿瘤；肿瘤转移抑制基因；原位杂交
第二军医大学学报991011 摘要 目的：通过检测人卵巢癌标本中肿瘤转移抑制基因nm23-H1 mRNA的表达，了解其临床意义及其与预后的关系。 方法：应用原位杂交技术检测43例人卵巢癌标本中nm23-H1 mRNA的表达水平。 结果：nm23-H1 mRNA表达水平与卵巢癌的病理组织学类型无关(P>0.05)；与患者术时有淋巴结或大网膜转移呈负相关(P<0.05)；且转移灶的阳性表达率低于原发灶(P<0.05)。 结论：nm23-H1基因在人卵巢癌的扩散和转移过程中可能发挥着抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达水平具有重要的临床意义。
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中图分类号 R 737.31 文献标识码：A
Expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 mRNA in human ovarian carcinomas
Zhou Xiaoning, Chen Xiaodong, Wang Zhaomei, Sha Jinyan, Cui Ying, Gu Qing, Jiang Haiyan
(Department of Obstetrics and Gynecology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To detect the expression of tumor metastasis suppressor gene nm23-H1 mRNA in human ovarian carcinomas, and to evaluate its clinic value as well as its relationship with prognosis. Methods: The expression of nm23-H1 mRNA was detected in 43 cases of human ovarian carcinomas by means of in situ hybridization. Results: The expression of nm23-H1 mRNA did not statistically correlated with histologic types of ovarian carcinomas (P>0.05); there was an inverse relationship between nm23-H1 mRNA level and those cases with metastasis foci both in lymph nodes and in the great omentum(P<0.05); positive rate of nm23-H1 mRNA was higher in primary than in metastatic foci(P<0.05). Conclusions: nm23-H1 gene may play an important role in suppressing metastasis of ovarian carcinomas. The expression of nm23-H1 gene in ovarian cancer tissues may serve as one of assessable factors for prognosis in ovarian carcinoma.
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KEY WORDS ovarian heoplasms; tumor metastasis suppressor gene; in situ hybridization
卵巢癌的发病率近年不断上升，多数患者就诊时就已有腹腔内播散或远处脏器的转移，仅约20%的患者肿瘤尚局限在盆腔。而对卵巢肿瘤发生转移的机制及其相关基因和分子水平的变化，目前所知甚少。nm23基因是近年来颇受重视的肿瘤转移抑制基因，是1988年首次从鼠黑素瘤K-1735细胞株中分离得到，它在低转移细胞株中的表达强度约为高转移细胞株的10倍。研究发现，在人基因组中存在着两个nm23基因：nm23-H1基因和nm23-H2基因，它们均编码17 kd的蛋白质，其中nm23-H1基因的表达水平与肿瘤转移的关系更为密切[1]。研究结果证实，在人乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑素瘤等肿瘤组织中，nm23-H1基因的表达降低与转移发生和预后差密切相关。本实验对43例人卵巢癌组织中nm23-H1 基因的mRNA进行了原位检测，旨在分析nm23-H1 基因与卵巢癌转移的相关性，希望为临床治疗方案的选择及患者预后判断提供客观依据。
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1 材料和方法
1.1 标本 共采用43例人卵巢癌标本，根据FIGO卵巢恶性肿瘤分期标准(1985年)，Ⅰ～Ⅱ期16例，取其原发灶标本；Ⅲ～Ⅳ期27例，分别取其原发灶和淋巴结或网膜转移灶标本。所有标本均于组织离体后0.5 h内无菌采集，置4%多聚甲醛PBS(pH 7.4)固定1 h，置15%蔗糖PBS漂洗4～5 h，即行冰冻切片，切片厚约15 μm，载玻片预先经严格处理灭活RNA酶，然后涂布铬矾明胶(0.01%铬矾，0.1%明胶)。
1.2 制备cRNA探针 nm23-H1 cDNA由美国Rosengard博士转赠。测序结果与报道相符。载体质粒为PGEM-4Z。经限制酶HindⅢ或SmaⅠ酶切线性化后作为模板分别合成反义和正义探针。用地高辛RNA标记试剂盒(DIG-RNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim公司)标记探针。每次标记加入线性化模板1 μg，新合成的标记cRNA探针约10 μg。反义cRNA探针全长约971 bp，其中编码区732 bp，5′端非编码区144 bp，3′端非编码区约95 bp。
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1.3 原位杂交 原位杂交操作流程按常规稍加改良进行。冰冻切片冷风稍吹干，用4%多聚甲醛PBS(pH 7.4)4℃固定30 min，37℃烤片12 h，依次用PBS，TritonX-100PBS洗脱；蛋白酶K消化，37℃ 30 min；消化后再用4%多聚甲醛PBS固定10 min；PBS，0.25%乙酸酐和2×SSC洗后进行杂交。杂交液成分为：50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，5×SSC ，5× Denhardt液，2% SDS, 100 μg/ml变性的鲱精DNA，2～4 μg/ml nm23-H1反义cRNA探针。每张切片加25 μl杂交液，盖石蜡膜；杂交温度设置在50～55℃，12～16 h。梯度洗脱液洗(4×SSC，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，0.05 mol/L PBS)；加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim公司)1∶500稀释，25℃ 4 h；PBS洗；洗脱液Ⅰ(含100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；100 mmol/L NaCl；50 mmol/L MgCl2)和洗脱液Ⅱ(含100 mmol/L Tris-HCl, pH 9.5;100 mmol/L NaCl；50 mmol/L MgCl2)洗后显色；显色液用洗脱液Ⅱ新鲜配制，含NBT 400 mg/ml，BICP 200 mg/ml，每张切片加40 μl，25℃避光显色。每隔1 h观察颜色反应。用PBS洗终止显色反应。经100%乙醇，二甲苯处理后，中性树胶封片，避光保存。
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1.4 对照设置 阴性对照：(1) 杂交前用RNase 100 μg/ml，37℃ 1 h预处理组织切片；(2) 用nm23-H1正义cRNA探针代替nm23-H1反义cRNA探针；(3) 用不含nm23-H1反义cRNA探针的预杂交液进行杂交反应。阳性对照：用已知表达nm23-H1 mRNA的人肝癌组织切片进行杂交反应，结果为阳性。
1.5 统计学处理 用χ2检验判定差异显著性。
2 结 果
2.1 结果判定 原位杂交染色显示nm23-H1 mRNA阳性产物定位于胞质内，为蓝色颗粒或团块(图1)。
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Fig 1 Results of nm23-H1 mRNA in situ hybridization stain in ovarian carcinoma
A:Positive×100; B:Positive×200
2.2 nm23-H1 mRNA表达与不同组织学类型卵巢癌的关系 43例卵巢癌原发灶标本中，浆液性囊腺癌20例， 阳性染色7例， 阳性率35.0%；粘液性囊腺癌9例，阳性染色5例，阳性率55.6%；低分化腺癌8例，阳性染色3例，阳性率37.5%；子宫内膜样腺癌6例，阳性染色3例，阳性率50.0%。各组织学类型间nm23-H1 mRNA的阳性表达率，经统计学处理，相差不显著(P>0.05)。
2.3 nm23-H1 mRNA表达与卵巢癌有否淋巴结和网膜转移的关系 43例原发灶标本中，有淋巴结网膜转移的26例，阳性染色7例，阳性率26.9%；无转移者17例，阳性染色11例，阳性率64.7%。两者nm23-H1 mRNA 的阳性表达率，经统计学处理，相差显著(P<0.05)，nm23-H1 mRNA 的阳性表达率与卵巢癌发生转移呈负相关。
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2.4 卵巢癌原发灶、转移灶间nm23-H1 mRNA 表达的关系 26例术时有淋巴结网膜转移的患者，原发灶阳性染色7例，阳性率26.9%；转移灶阳性染色1例，阳性率3.9%。两组间nm23-H1 mRNA的阳性表达率，经统计学处理，相差显著(P<0.05)。
3 讨 论
nm23基因发现后，国内外学者从多个角度对其进行了深入的研究，结果显示，该基因编码蛋白质的生化性质、结构功能都与肿瘤转移密切相关。nm23基因作为转移抑制基因，已被多数学者所接受。本实验的结果也提示，在人卵巢癌组织中，nm23-H1 mRNA的表达水平与卵巢癌发生淋巴结网膜转移呈负相关，且原发灶的nm23-H1 mRNA 水平高于转移灶，与多数文献报道相符[2～6] 。本实验结果还发现，nm23-H1 mRNA水平与卵巢癌的组织学类型无关，这与部分学者的研究结果一致[7，8]。Scambia等曾从分子和蛋白质水平研究了106例原发性卵巢癌患者的nm23基因，发现在无淋巴结转移的患者中，nm23-H1阳性率较高，且阳性患者中对化疗反应性佳的比例也较高，其5年生存率亦明显高于nm23-H1阴性者，认为nm23-H1含量测定对临床上治疗选择及预后判断具有重要的指导意义。目前在nm23基因与卵巢癌的相关性研究中的结论尚不一致，但多数学者支持nm23基因在卵巢癌中具有转移抑制作用和nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因的假说。本研究结果亦显示，nm23-H1基因在人卵巢癌转移过程中发挥着抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达水平有重要的临床意义，可望为患者的治疗选择及预后判断提供客观的实验依据。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0743-03
参考文献
1 Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential[J]. J Natl Cancer Inst, 1988, 80(3): 200
2 Viel A, Agnese LD, Canzonieri V, et al. Suppressive role of the metastasis-related nm23-H1 gene in human ovarian carcinomas: association of high messenger RNA expression with lack of lymph node metastasis[J]. Cancer Res, 1995, 55(15): 2645
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3 Mandai M, Konishi I, Komatsu T, et al. Mutation of the nm23 gene, loss of heterozygosity at the nm23 locus and K-ras mutation in ovarian carcinoma: correlation with tumour progression and nm23 gene expression[J]. Br J Cancer,1995, 72(3): 691
4 Mandai M, Konishi I, Koshiyama M, et al. Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas: correlation with clinicopathology, EGFR, c-erbB-2, and c-erbB-3 genes, and sex steroid receptor expression[J]. Cancer Res,1994, 54(7): 1825
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5 Scambia G, Ferrandina G, Marone M, et al. nm23 in ovarian cancer: correlation with clinical outcome and other clinicopathologic and biochemical prognostic parameters[J]. J Clin Oncol,1996, 14(2): 334
6 吴晓华，蔡树模，张志毅，等.卵巢肿瘤中癌基因nm23-H1,c-erbB-2,ras和P53的蛋白表达与腹膜后淋巴结转移关系的研究[J]. 肿瘤， 1997,17(3)：134
7 Harlozinska A, Bar JK, Gerber J. nm23 expression in tissue sections and tumor effusion cells of ovarian neoplasms[J]. Int J Cancer. 1996,69(5): 415
8 Leary JA, Kerr J, Chenevix-trench G, et al. Increased expression of the NME1 gene is associated with metastasis in epithelial ovarian cancer[J]. Int J Cancer, 1995, 64(3): 189
(1999-01-22收稿，1999-08-20修回), 百拇医药