Ⅰ型细胞间粘附分子mRNA表达与肝癌侵袭转移的关系
作者：曲增强 吴孟超 陈 汉 方石岗 钱其军 郭亚军
单位：第二军医大学东方肝胆外科医院介入科，上海，200438
关键词：Ⅰ型细胞间粘附分子；肝细胞癌；侵袭；转移
第二军医大学学报991010 摘要 目的：研究Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)mRNA的表达与肝癌侵袭转移的关系。方法：采用原位分子杂交及Northern blot方法检测34例肝癌组织中ICAM-1 mRNA 的表达。结果：34例肝癌中24例包膜不完整、门静脉癌栓或形成转移灶,10例肝癌包膜完整,34例肝癌中21例肝癌细胞ICAM-1 mRNA表达阳性。伴门静脉癌栓或形成转移的肝癌18例中，16例ICAM-1 mRNA表达(++)～(+++)；6例包膜不完整的肝癌3例表达阳性，而10例包膜完整的肝癌仅有2例表达阳性。门静脉癌栓及肝内转移灶ICAM-1 mRNA表达强阳性。结论：肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌的侵袭转移相关。
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中图分类号 R 735.7 文献标识码：A
Study on relationship between the mRNA expression of intercellular adhesion molecule Ⅰ and the HCC invasion and metastasis
Qu Zengqiang, Wu Mengchao, Chen Han, Fang Shigang，Qian Qijun，Guo Yajun
(Department of intervention， Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second military Medical University, Shanghai，200438)
ABSTRACT Objective: To investigate the relationship between intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) mRNA expression and the hepatocellular carcinoma(HCC) invasion and metastasis. Methods： The ICAM-1 mRNA expression was analyzed in 34 HCC surgical specimens using in situ hybridization and Northern blot techniques. Results： The 34 cases of HCC were divided into 2 groups，twenty-four HCC cases showed expansive growth pattern，such as direct invasion，portal cancer emboli as well as tumour satellites，and 10 cases have fibrous capsule. Twenty-one HCC cases showed ICAM-1 mRNA positive expression. The ICAM-1 mRNA expression was stronger in metastatic HCC than in that of non-metastatic HCC, and the metastatic lesions and portal cancer emboli showed strong positive expression. Conclusion: The ICAM-1 mRNA expression in the HCC cells may relate to the invasion and metastasis of HCC.
, 百拇医药
KEY WORDS adhesion molecule Ⅰ, intercellular； hepatocellular carcinoma； invasion； metastasis
恶性肿瘤侵袭及转移的确切机制迄今尚未明确。粘附分子在肿瘤转移的多个环节中，如癌细胞从母瘤脱离、侵入和穿出血管等过程中发挥重要作用[1]。本研究以原位分子杂交及Northern印迹杂交方法观察Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)在不同类型肝癌中的表达及分布，并初步探讨肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌侵袭转移的关系。
1 材料和方法
1.1 临床资料 取自手术切除部分的原发性肝癌标本共34例，均经病理证实。34例肝癌中24例包膜不完整，其中18例伴门静脉癌栓或形成转移灶，6例肝癌突破包膜向周围肝组织侵袭性生长；10例肝癌包膜完整，未见癌向包膜外侵袭性生长。对照的5例标本取自肝血管瘤周围的正常肝组织。
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1.2 标本处理 癌及癌旁组织标本离体后30 min内液氮速冻，OCT包埋，-20℃连续恒温冷冻切片(6 μm)数张，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，-70℃保存。标本分别用于苏木精-伊红(HE)染色、原位杂交及Northern印迹杂交。
1.3 主要试剂 人ICAM-1 cDNA质粒探针长度1.6 kb，HindⅢ/BamHⅠ双酶切回收。地高辛标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。核素探针标记试剂盒购自Promega公司。α-32P dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。
1.4 实验方法
1.4.1 原位分子杂交 以DIG随机引物法标记DNA探针，原位杂交操作流程参照文献[2]，杂交探针浓度约为1 μg/ml。镜下观察细胞出现蓝色颗粒为阳性。高倍镜下任取4个不同视野各计数200个细胞，阳性细胞所占的百分率<30%为(+)；30%～50%为(++)，>50%为(+++)。
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1.4.2 Northern印迹杂交 按Chomczynski的一步法提取组织总RNA，以32P随机引物法标记DNA探针，按文献[3]进行Northern印迹杂交，放射自显影结束后，以缓冲液洗去硝纤膜上的放射性标记探针，硝纤膜以32P标记的GAPDH探针重新杂交及放射自显影。
1.5 统计学处理 结果经秩和检验处理。
2 结 果
2.1 原位杂交 正常肝仅在血管内皮细胞、部分间质细胞中ICAM-1 mRNA表达阳性。34例肝癌中共21例癌细胞表达阳性；24例包膜不完整的肝癌中19例癌细胞表达阳性，其中伴门静脉癌栓或发生转移的肝癌18例中16例ICAM-1 mRNA表达(++)～(+++)，6例包膜不完整的肝癌中3例癌细胞表达(+)，而10例包膜完整的肝癌仅有2例癌细胞表达(+)(表1)。向周围肝组织浸润性生长的肝癌细胞、门静脉癌栓及肝内多个转移灶表达均呈强阳性。
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表1 34例肝癌ICAM-1 mRNA的表达
Tab 1 The ICAM-1 mRNA expression in 34 HCC cases Group
n
-
+
++
+++
Well capsulated
10
8
1
1
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0
Incomplete-capsulated**
24
5
2
10
7
**P<0.01 vs well capsulated group
2.2 Northern印迹杂交 正常肝组织ICAM-1 mRNA表达很低，部分侵袭性肝癌组织ICAM-1 mRNA的表达明显高于癌旁，伴癌栓形成的数例肝癌，ICAM-1 mRNA表达明显增高，而且癌栓及肝门转移淋巴结ICAM-1 mRNA表达高于原发灶(图1)。
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图1 ICAM-1 mRNA Northern印迹杂交
Fig 1 ICAM-1 mRNA Northern blot
C：Cancer tissue； P：Pericarcinomatous tissue；
E：Portal cancer emboli
3 讨 论
肝癌细胞早期侵袭转移是原发性肝癌术后高复发率的主要原因，因此，有必要研究影响肝癌细胞侵袭及转移的因素。
ICAM-1为相对分子质量7～11万的糖蛋白，介导细胞与细胞间的相互作用，其天然配体为白细胞功能相关抗原1(LFA-1)[4]。近年ICAM-1在肿瘤转移方面的研究表明，黑素瘤、胃癌等肿瘤ICAM-1的高表达与其转移相关。Miele等[5]报道以TNFα，IFNγ处理黑素瘤细胞使其ICAM-1表达上调，其形成肺转移灶的能力显著增强。以反义核酸阻断肿瘤细胞ICAM-1的表达，其形成肺转移灶的能力降低41%～64%，而且先以反义核酸阻断黑素瘤细胞ICAM-1的表达，再以TNFα，IFNγ处理，其形成肺转移灶的能力并不增强。这些结果均表明ICAM-1的表达与某些肿瘤的转移相关。
, 百拇医药
本研究结果表明大部分侵袭性肝癌ICAM-1 mRNA均有较高水平的表达，原位杂交及Northern blot均显示转移灶及癌栓ICAM-1 mRNA表达明显高于癌旁并稍高于原发灶，而包膜完整的肝癌仅有少部分ICAM-1表达阳性，提示肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌的侵袭及转移有关。
肝癌细胞产生的ICAM-1在其转移过程中的确切作用尚不清楚。推测ICAM-1在肝癌转移的多个环节发挥作用。由于肝癌组织中肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)LFA-1表达阳性，高表达ICAM-1的肝癌细胞可能通过与其配体LFA-1结合，从而使肿瘤细胞与TILs紧密结合，这可能导致癌细胞间粘附力降低，从而易于随淋巴细胞的迁移而脱离母瘤进入血循环或淋巴循环[6]。本实验中癌栓ICAM-1表达强阳性，这一结果支持这个观点。亦有推测ICAM-1表达阳性的肿瘤细胞在血循环中通过ICAM-1与LFA-1的相互作用，使肿瘤细胞与外周血淋巴细胞形成栓子，使其易于在循环中逃避机体的免疫排斥作用，而且形成的癌栓易于在毛细血管或淋巴窦着床形成转移[7]。由于发现合并转移的肾细胞癌及乳癌患者血中ICAM-1明显高于无转移者[8]，因此推测从肿瘤细胞脱落的ICAM-1在血循环中可能阻断细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与肿瘤细胞的粘附，使CTL不能有效地杀死肿瘤细胞。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0740-03
参考文献
1 Vanten-Horst E，Danen EHJ，Smit L，et al. Expression of CD44 splice variants in human cutaneous melanoma and melanoma cell lines is related to tumor progression and metastatic potential[J]. Int J Cancer，1995，64(2):182
2 苏慧慈 主编. 原位杂交[M]. 北京:中国科学技术出版社,1994. 59～91
3 Davis LG, Kuehl MW， Bettey JF. ed. Basic methods in molecular Biology[M]. 2nd. Appleton and Lange,1994. 232～234
, 百拇医药
4 Obiri NI, Tandon N, Puri RK. Up-regulation of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) on human renal cell carcinoma cells by interleukin-4[J]. Int J Cancer, 1995,61(5):635
5 Miele ME,Bennett CF,Miller BE,et al.Enhanced metastatic ability of TNF-alpha-treated malignant melanoma cells is reduced by intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1,CD54) antisense oligonucleotides[J]. Exp Cell Res,1994,214(1):231
6 Johnson JP, Stade BG ,Holzmann B, et al. De novo expression of intercellular adhesion molecule 1 in melanoma correlate with increased risk of metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86(2):641
, 百拇医药
7 Natali P, Nicotra MR , Cavaliere R, et al. Differential expression of intercellular adhesion molecule 1 in primary and metastatic melanoma lesions[J]. Cancer Res,1990,50(4):1271
8 Jackson AM, Alexandrov AB, Gribben SC, et al. Expression and shedding of ICAM-1 in bladder cancer and its immunotherapy[J]. Int J Cancer,1993,55(6)921
(1999-02-10收稿，1999-08-23修回), 百拇医药
单位：第二军医大学东方肝胆外科医院介入科，上海，200438
关键词：Ⅰ型细胞间粘附分子；肝细胞癌；侵袭；转移
第二军医大学学报991010 摘要 目的：研究Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)mRNA的表达与肝癌侵袭转移的关系。方法：采用原位分子杂交及Northern blot方法检测34例肝癌组织中ICAM-1 mRNA 的表达。结果：34例肝癌中24例包膜不完整、门静脉癌栓或形成转移灶,10例肝癌包膜完整,34例肝癌中21例肝癌细胞ICAM-1 mRNA表达阳性。伴门静脉癌栓或形成转移的肝癌18例中，16例ICAM-1 mRNA表达(++)～(+++)；6例包膜不完整的肝癌3例表达阳性，而10例包膜完整的肝癌仅有2例表达阳性。门静脉癌栓及肝内转移灶ICAM-1 mRNA表达强阳性。结论：肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌的侵袭转移相关。
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中图分类号 R 735.7 文献标识码：A
Study on relationship between the mRNA expression of intercellular adhesion molecule Ⅰ and the HCC invasion and metastasis
Qu Zengqiang, Wu Mengchao, Chen Han, Fang Shigang，Qian Qijun，Guo Yajun
(Department of intervention， Eastern Hospital of Hepatobiliary Surgery, Second military Medical University, Shanghai，200438)
ABSTRACT Objective: To investigate the relationship between intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) mRNA expression and the hepatocellular carcinoma(HCC) invasion and metastasis. Methods： The ICAM-1 mRNA expression was analyzed in 34 HCC surgical specimens using in situ hybridization and Northern blot techniques. Results： The 34 cases of HCC were divided into 2 groups，twenty-four HCC cases showed expansive growth pattern，such as direct invasion，portal cancer emboli as well as tumour satellites，and 10 cases have fibrous capsule. Twenty-one HCC cases showed ICAM-1 mRNA positive expression. The ICAM-1 mRNA expression was stronger in metastatic HCC than in that of non-metastatic HCC, and the metastatic lesions and portal cancer emboli showed strong positive expression. Conclusion: The ICAM-1 mRNA expression in the HCC cells may relate to the invasion and metastasis of HCC.
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KEY WORDS adhesion molecule Ⅰ, intercellular； hepatocellular carcinoma； invasion； metastasis
恶性肿瘤侵袭及转移的确切机制迄今尚未明确。粘附分子在肿瘤转移的多个环节中，如癌细胞从母瘤脱离、侵入和穿出血管等过程中发挥重要作用[1]。本研究以原位分子杂交及Northern印迹杂交方法观察Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)在不同类型肝癌中的表达及分布，并初步探讨肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌侵袭转移的关系。
1 材料和方法
1.1 临床资料 取自手术切除部分的原发性肝癌标本共34例，均经病理证实。34例肝癌中24例包膜不完整，其中18例伴门静脉癌栓或形成转移灶，6例肝癌突破包膜向周围肝组织侵袭性生长；10例肝癌包膜完整，未见癌向包膜外侵袭性生长。对照的5例标本取自肝血管瘤周围的正常肝组织。
, http://www.100md.com
1.2 标本处理 癌及癌旁组织标本离体后30 min内液氮速冻，OCT包埋，-20℃连续恒温冷冻切片(6 μm)数张，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，-70℃保存。标本分别用于苏木精-伊红(HE)染色、原位杂交及Northern印迹杂交。
1.3 主要试剂 人ICAM-1 cDNA质粒探针长度1.6 kb，HindⅢ/BamHⅠ双酶切回收。地高辛标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。核素探针标记试剂盒购自Promega公司。α-32P dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。
1.4 实验方法
1.4.1 原位分子杂交 以DIG随机引物法标记DNA探针，原位杂交操作流程参照文献[2]，杂交探针浓度约为1 μg/ml。镜下观察细胞出现蓝色颗粒为阳性。高倍镜下任取4个不同视野各计数200个细胞，阳性细胞所占的百分率<30%为(+)；30%～50%为(++)，>50%为(+++)。
, 百拇医药
1.4.2 Northern印迹杂交 按Chomczynski的一步法提取组织总RNA，以32P随机引物法标记DNA探针，按文献[3]进行Northern印迹杂交，放射自显影结束后，以缓冲液洗去硝纤膜上的放射性标记探针，硝纤膜以32P标记的GAPDH探针重新杂交及放射自显影。
1.5 统计学处理 结果经秩和检验处理。
2 结 果
2.1 原位杂交 正常肝仅在血管内皮细胞、部分间质细胞中ICAM-1 mRNA表达阳性。34例肝癌中共21例癌细胞表达阳性；24例包膜不完整的肝癌中19例癌细胞表达阳性，其中伴门静脉癌栓或发生转移的肝癌18例中16例ICAM-1 mRNA表达(++)～(+++)，6例包膜不完整的肝癌中3例癌细胞表达(+)，而10例包膜完整的肝癌仅有2例癌细胞表达(+)(表1)。向周围肝组织浸润性生长的肝癌细胞、门静脉癌栓及肝内多个转移灶表达均呈强阳性。
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表1 34例肝癌ICAM-1 mRNA的表达
Tab 1 The ICAM-1 mRNA expression in 34 HCC cases Group
n
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+++
Well capsulated
10
8
1
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, http://www.100md.com
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Incomplete-capsulated**
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**P<0.01 vs well capsulated group
2.2 Northern印迹杂交 正常肝组织ICAM-1 mRNA表达很低，部分侵袭性肝癌组织ICAM-1 mRNA的表达明显高于癌旁，伴癌栓形成的数例肝癌，ICAM-1 mRNA表达明显增高，而且癌栓及肝门转移淋巴结ICAM-1 mRNA表达高于原发灶(图1)。
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图1 ICAM-1 mRNA Northern印迹杂交
Fig 1 ICAM-1 mRNA Northern blot
C：Cancer tissue； P：Pericarcinomatous tissue；
E：Portal cancer emboli
3 讨 论
肝癌细胞早期侵袭转移是原发性肝癌术后高复发率的主要原因，因此，有必要研究影响肝癌细胞侵袭及转移的因素。
ICAM-1为相对分子质量7～11万的糖蛋白，介导细胞与细胞间的相互作用，其天然配体为白细胞功能相关抗原1(LFA-1)[4]。近年ICAM-1在肿瘤转移方面的研究表明，黑素瘤、胃癌等肿瘤ICAM-1的高表达与其转移相关。Miele等[5]报道以TNFα，IFNγ处理黑素瘤细胞使其ICAM-1表达上调，其形成肺转移灶的能力显著增强。以反义核酸阻断肿瘤细胞ICAM-1的表达，其形成肺转移灶的能力降低41%～64%，而且先以反义核酸阻断黑素瘤细胞ICAM-1的表达，再以TNFα，IFNγ处理，其形成肺转移灶的能力并不增强。这些结果均表明ICAM-1的表达与某些肿瘤的转移相关。
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本研究结果表明大部分侵袭性肝癌ICAM-1 mRNA均有较高水平的表达，原位杂交及Northern blot均显示转移灶及癌栓ICAM-1 mRNA表达明显高于癌旁并稍高于原发灶，而包膜完整的肝癌仅有少部分ICAM-1表达阳性，提示肝癌细胞ICAM-1 mRNA的表达与肝癌的侵袭及转移有关。
肝癌细胞产生的ICAM-1在其转移过程中的确切作用尚不清楚。推测ICAM-1在肝癌转移的多个环节发挥作用。由于肝癌组织中肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)LFA-1表达阳性，高表达ICAM-1的肝癌细胞可能通过与其配体LFA-1结合，从而使肿瘤细胞与TILs紧密结合，这可能导致癌细胞间粘附力降低，从而易于随淋巴细胞的迁移而脱离母瘤进入血循环或淋巴循环[6]。本实验中癌栓ICAM-1表达强阳性，这一结果支持这个观点。亦有推测ICAM-1表达阳性的肿瘤细胞在血循环中通过ICAM-1与LFA-1的相互作用，使肿瘤细胞与外周血淋巴细胞形成栓子，使其易于在循环中逃避机体的免疫排斥作用，而且形成的癌栓易于在毛细血管或淋巴窦着床形成转移[7]。由于发现合并转移的肾细胞癌及乳癌患者血中ICAM-1明显高于无转移者[8]，因此推测从肿瘤细胞脱落的ICAM-1在血循环中可能阻断细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与肿瘤细胞的粘附，使CTL不能有效地杀死肿瘤细胞。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0740-03
参考文献
1 Vanten-Horst E，Danen EHJ，Smit L，et al. Expression of CD44 splice variants in human cutaneous melanoma and melanoma cell lines is related to tumor progression and metastatic potential[J]. Int J Cancer，1995，64(2):182
2 苏慧慈 主编. 原位杂交[M]. 北京:中国科学技术出版社,1994. 59～91
3 Davis LG, Kuehl MW， Bettey JF. ed. Basic methods in molecular Biology[M]. 2nd. Appleton and Lange,1994. 232～234
, 百拇医药
4 Obiri NI, Tandon N, Puri RK. Up-regulation of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) on human renal cell carcinoma cells by interleukin-4[J]. Int J Cancer, 1995,61(5):635
5 Miele ME,Bennett CF,Miller BE,et al.Enhanced metastatic ability of TNF-alpha-treated malignant melanoma cells is reduced by intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1,CD54) antisense oligonucleotides[J]. Exp Cell Res,1994,214(1):231
6 Johnson JP, Stade BG ,Holzmann B, et al. De novo expression of intercellular adhesion molecule 1 in melanoma correlate with increased risk of metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86(2):641
, 百拇医药
7 Natali P, Nicotra MR , Cavaliere R, et al. Differential expression of intercellular adhesion molecule 1 in primary and metastatic melanoma lesions[J]. Cancer Res,1990,50(4):1271
8 Jackson AM, Alexandrov AB, Gribben SC, et al. Expression and shedding of ICAM-1 in bladder cancer and its immunotherapy[J]. Int J Cancer,1993,55(6)921
(1999-02-10收稿，1999-08-23修回), 百拇医药