小鼠α2(Ⅰ)型原胶原基因启动子活性研究
作者：高春芳 王 皓 黄 超 孔宪涛
单位：第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海，200003
关键词：基因；胶原；启动子；转录
第二军医大学学报991008 摘要 目的: 明确纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动子片段，逐段研究小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因2 kb的启动子序列。方法: 从小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因转录起始点上游-2 kb～+54 bp的片段中，取长度不等的片段作为启动子，与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成6个重组体，脂质体转染法转染上述重组体至胶原产生细胞(NIH3T3)和非胶原产生细胞(COS7), CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性。结果: -780～+54 bp序列具有最高启动CAT表达活性且有不完全细胞特异性，缺失近转录起始点500 bp, 即-2～-0.5 kb片段的启动子活性最低。结论: 近转录起始点500 bp的序列为小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因启动激活所必需，-780～+54 bp片段有高启动活性，并有望以此序列发现纤维化相关的特异DNA结合蛋白。
, 百拇医药
中图分类号 Q 753 文献标识码：A
Activity analysis of promoter from mouse α2(Ⅰ) procollagen gene
Gao Chunfang, Wang Hao, Huang Chao, Kong Xiantao
(Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To clarify which segment or sequence in mouse α2(Ⅰ) procollagen gene is responsible for high transcriptional activity during fibrogenesis. This study focused on further fractional analysis of 2 kb-length mouse α2(Ⅰ) procollagen gene promoter activity. Methods: Six chimeric genes were constructed in which various lengths of sequences between 2 000 bp upstream of the start of transcription of the mouse α2(Ⅰ) procollagen gene and 54 bp downstream of this site were fused to chloramphenicol acetyltransferase(CAT) reporter gene. These recombinant plasmids were transfected transiently to collagen-producing cells(NIH3T3) and non-collagen-producing cells(COS7) with liposomal transfection method. The putative promoters activities were observed and compared by means of CAT measurement in transfected cells. Results: The highest and partial cell specific CAT expression was observed in construction driven by -780～ +54 bp fragment. The construction containing sequence deleted the proximal 500 bp from the transcription start site and part of exonⅠ resulted in the lowest CAT expression. Conclusion: Some essential elements might exist in the 500 bp fraction proximal to transcription start site and part of exon of Ⅰin mouse α2(Ⅰ) procollagen gene. The high potential promoter sequence between -780 bp from the start of transcription site and +54 bp from this site is of great significance in our following study searching for specific DNA-binding proteins in activated collagen-producing cells.
, 百拇医药
KEY WORDS genes, collagen; promoter; transcription
肝脏内胶原产生及胶原含量显著增加是肝硬化患者的主要病理特征， 以Ⅰ型胶原为主的细胞外间质(ECM)过度沉积导致正常肝组织结构破坏、肝功能受损。目前有关肝纤维化或硬化形成的机制尚不完全明确。鉴于Ⅰ型胶原在纤维化或硬化的形成中的重要作用，研究在不同病理条件下Ⅰ型胶原基因的异常激活，对阐述纤维化或硬化病理形成机制有特别重要的意义[1]。
Ⅰ型胶原生物合成在转录水平和转录后水平受多种因素的影响， 这些因素包括细胞因子(如TGFβ,IFNγ)、化学物质(如乙醛)等[2,3]。目前研究已明确发现病理条件下TGFβ通过核转录因子(如SP-1)与Ⅰ型胶原基因上游相应调控序列(顺式调控元件)结合，促使Ⅰ型胶原基因激活并高水平转录[2,4]。进一步研究还发现小鼠Ⅰ型胶原基因5′侧翼区-2 kb至+54 bp(包括部分外显子Ⅰ )片段足以调控细胞特异性Ⅰ型胶原基因转录激活，基因缺失研究在这2 kb的序列中还发现了一些重要的调控元件，但对于这些调控元件及其相应的转录因子研究结果不尽相同[2,3,5]，国内亦未见有同类研究报道。本研究以小鼠α2(Ⅰ)基因-2 kb～+54 bp片段为靶序列，逐段研究其启动转录活性，以发现高启动活性片段。
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1 材料和方法
1.1 细胞培养 小鼠NIH3T3细胞和猴肾COS7细胞(中科院细胞所)以含10%FCS的1640(Gibco)培养液培养，0.125%胰蛋白酶(Sigma)消化传代。
1.2 重组体构建 载体质粒pCAT-促进子(Promega)不含启动子，但含有SV40增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因。重组体中所含的启动子即是所要研究的原胶原α2(Ⅰ)启动子片段。 重组体pCOL0.4，pCOL0.8，pCOL1.0，pCOL1.3的启动子分别是以含小鼠α2(Ⅰ)原胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ1009 (美国NIC Crombrugghe 教授惠赠)为模板的PCR扩增产物[5], 其5′端引物序列分别为：pCOL 0.4: 5′-CATAGTCC-AAGCTTCTGTAAAGAGCCCACGT-3′；pCOL 0.8: 5′-CATAGTCCAAGCTTCCCCTCATCAA-CGAGAG-3′； pCOL 1.0: 5′-CATAGTCCAAGC-TTTCCCAGGAGTTCGCCAG-3′； pCOL 1.3: 5′-CATAGTCCAAGCTTACGCCCTAGGGATGA-TG-3′。
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上述4种重组体的3′端引物相同，序列为：5′-TAGCATCCGTCGACAATCGTGGACCGTTCC-3′。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶Hind Ⅲ及SalⅠ识别位点(下划线部分)。PCR按常规方法进行(PE-9600 PCR扩增仪)，扩增产物经纯化回收后，用Hind Ⅲ，SalⅠ酶切并与相同粘末端的线性pCAT-促进子载体经T4 DNA连接酶(Promega)连接，连接混和物转染至感受态大肠杆菌并筛选，经小量酶切鉴定正确后，大量扩增阳性克隆，抽提、纯化质粒重组体(Qiagen plasmid midi kit)，紫外分光光度计(Du-600,Beckman)测得率、纯度。含小鼠α2(Ⅰ)原胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ 1009经Hind Ⅲ酶切得到2.0 kb(-2 kb～+54 bp)片段，与含HindⅢ粘末端的pCAT-促进子线性载体连接(T4连接酶)组成pCOL 2.0。取上述2 kb序列经XbaⅠ+HindⅢ双酶切后得到1.5 kb(-2 kb～-500 bp)片段，再与有相同粘端的pCAT-促进子线性载体连接组成重组体pCOL 1.5。
, 百拇医药
1.3 DNA转染 DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim),具体操作方法如下： NIH3T3细胞或COS7细胞以5×105/孔接种于6孔培养板(Nunc),待细胞60%～80%融合生长后，换新鲜但不含FCS的培养基，重组质粒以脂质体-DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶(ALP)表达质粒pSV2AP(Merck&Co. Inc.惠赠)作为内对照及含CAT的表达质粒(Invitrogen)作为阳性对照[6]。转染后6 h，每孔细胞加两倍于正常量的FCS(20%)，24 h后换新鲜含10%FCS的培养基，继续培养24 h后，测定报告基因CAT活性。
1.4 CAT及ALP活性测定 终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、ALP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。
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2 结 果
2.1 重组体鉴定 以含原胶原α2(Ⅰ)基因-2 kb～+54 bp的质粒为模板，PCR扩增得到4个具有相同3′端的长短分别为0.4,0.8,1.0,1.3 kb的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体pCAT-促进子分别组成重组体pCOL 0.4，pCOL 0.8，pCOL 1.0，pCOL 1.3，重组体中的PCR产物经测序证实碱基正确率超过99.5%, 重组体pCOL 2.0的启动子来自含上述2 kb片段的质粒pAZ1009的酶切片段，pCOL 1.5启动子是pCOL 2.0双酶切后的1.5 kb片段(详见1.2)。上述这些重组体均经酶切鉴定，结果正确(图1 )，即载体均为4.6 kb的pCAT-促进子，插入的启动子长短分别为0.4，0.8，1.0，1.3，1.5，2.0 kb。
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图1 6种重组体酶切后电泳结果
Fig 1 Electrophoresis of 6 constructs digested with restriction enzyme(1% agarose)
1: 100 bp DNA ladder; 2～5: pCOL 0.4, pCOL 0.8 , pCOL 1.0, pCOL 1.3, respectively, all digested with Hind Ⅲ+ Sal Ⅰ; 6: pCOL
1.5 (XbaⅠ + Hind Ⅲ) ; 7:λDNA/ Hind Ⅲ markers ; 8: pCOL 2.0 (Hind Ⅲ ) ; 9: λDNA/EcoRⅠ + Hind Ⅲ markers
2.2 CAT及ALP活性测定结果 胶原产生细胞(NIH3T3)在转染上述含长短不一的启动子的重组体后48 h，ELISA测定细胞CAT表达量，同时测定蛋白浓度及ALP活性，ALP活性作为内对照以保证在转染效率相同条件下比较CAT表达量，CAT测定结果用相应蛋白含量及ALP活性校正后，以pCOL 2.0转染细胞后CAT表达量为1，其余重组体转染后细胞的CAT相对表达量见表1。结果转染含-780～+54 bp重组体的细胞具有最大CAT表达量，而-2 kb～+54 bp中缺失近端500 bp，即-2 kb～-500 bp的重组体转染细胞后CAT表达量最低，其余重组体CAT表达活性的强弱依次为：pCOL 0.4, pCOL 1.0, pCOL 1.3。该结果表明，近转录起始点500 bp的片段为本研究小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因启动激活活性必需，-780～+54 bp片段的启动活性较全长2 kb者强，该片段在COS7细胞中虽仍有一定启动活性，但低于在NIH3T3中的活性(pCOL 0.8/pCOL 2.0: 3.16±0.2 vs 9.88±1.0)，提示该片段具有部分细胞特异性。
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表1 含不同启动子的重组体转染NIH3T3细胞
后CAT相对表达量
Tab 1 Summary of CAT expression driven by various
lengths of the 5′flanking sequence of
mouse α2(Ⅰ) procollagen gene Name of transfected
constructions
Putative promoters
length
(bp)
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Relative activities of
reporter gene(CAT)
(
)
pCOL 0.4
-348～+54
4.40±0.4
pCOL 0.8
-780～+54
9.88±1.0
pCOL 1.0
, http://www.100md.com
-980～+54
2.90±0.3
pCOL 1.3
-1 304～+54
2.30±0.3
pCOL 1.5
-2 000～-500
0.87±0.1
pCOL 2.0
-2 000～+54
1.00
3 讨 论
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器官硬化(纤维化)是器官慢性炎症反应的主要病理转归，常见于肝脏、肺、肾脏、皮肤、心血管等，肝硬化是其典型例证。Ⅰ型胶原是硬化(纤维化)中细胞外间质的主要成分[1]。Ⅰ型胶原的两种肽链分别由α1(Ⅰ)，α2(Ⅰ)基因编码。近年来对小鼠Ⅰ型胶原基因的研究表明，包括TGFβ在内的多种因子或化学物质对Ⅰ型胶原基因转录调控有重要作用，诸多重要的转录因子如SP-1，NF-Ⅰ，AP-1，NF-κB 等与其转录调控有关[3,4,7,9,10]。上述转录因子和尚未发现的核因子(即反式作用元件)与相应的DNA调控序列(即顺式作用元件)结合，导致了胶原基因表达的激活或失活。已有研究表明在鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游2 kb的序列存在这种调控元件，5′侧翼区2 kb～+54 bp(包括部分外显子Ⅰ) 的片段足以调控细胞特异性胶原表达。进一步的缺失研究还发现这2 kb的启动子中有几百bp的片段为基因表达所必需[5]，但对于这2 kb片段及DNA结合蛋白的研究结果不尽相同[2,3,5]，国内尚未见有同类研究报道。由于在真核细胞的多种基因转录起始点上游存在TATA盒、CCAAT盒等，胶原基因亦不例外，我们设想近转录起始点上游的序列对转录激活至关重要，为此，我们在不缺失近转录起始序列的基础上，研究有相同3′端但长短不等的启动片段对转录活性的影响。4个重组体pCOL 0.4，pCOL 0.8，pCOL 1.0，pCOL 1.3按此条件构建， 即用不含启动子、但含SV40增强子及CAT报告基因的载体分别与作为启动子的-348～+54 bp，-780～+54 bp，-980～+54 bp，-1 304～+54 bp片段相连组成重组体，为比较近转录起始点上游序列及全长启动子的活性，我们同时构建了以-2～-0.5 kb，-2 kb～+54 bp为启动子的重组体，细胞(NIH3T3)转染及报告基因定量分析提示： -780～+54 bp片段具有最强的启动子样活性，且在非胶原产生细胞(COS7)中亦仍有一定启动活性但低于在NIH3T3中的活性，提示该片段具有不完全细胞特异性，表明部分调控细胞特异性表达的元件存在于这800 bp片段内。
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对已报道的小鼠α2(Ⅰ)型胶原序列进一步分析发现，-690～-610 bp这80 bp片段中G+C占70%以上[5]，这个富含GC的SP-1潜能结合位点(区)可能与相应片段的高启动活性有关。含-1 304～+54 bp， -980～+54 bp，-348～+54 bp的重组体较-2 kb～+54 bp也有较高的CAT表达，提示这些片段亦有较高的启动活性。2 kb启动子缺失近端500 bp即-2 kb～-500 bp片段启动活性最低，这一结果证实了我们最初的设想，即近转录起始点上游的序列对转录激活至关重要。由于上述重组体含长度不等且起止位点不同的片段作为启动子，分析其CAT表达量的差异，我们认为：(1) 全长2 kb的启动子上游(-2.0～-1.3 kb)可能存在负性调控元件, 负性调控元件还可能存在于-980 ～-780 bp中。(2) -348～+54 bp，-780～-348 bp中可能存在正性调控序列。应用本研究中重组的含高活性启动子(-780～+54 bp，-348～+54 bp)的重组体，目前我们正进一步研究相应于这些高启动活性序列的DNA结合蛋白，有望在激活态胶原产生细胞中发现纤维化相关的新的或特异核转录因子，这一研究将有助于我们进一步认识纤维化(硬化)发生中胶原基因如何被转录激活，为纤维化的逆转提供新思路。此外，本研究中建立的含有效α2(Ⅰ)胶原启动序列的重组体，由于报告基因检测方法简便且能定量，是一个新的在转录水平筛选抗纤维化药物的可靠方法。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0733-04
参考文献
1 Brenner DA, Alcorn JM, Feitelberg SP, et al. Expression of collagen genes in the liver[J]. Mol Biol Med , 1990,7(1):105
2 Inagaki Y, Truter S, Tanaka S, et al. Overlapping pathways mediate the opposing actions of TNF alpha and TGF beta on alpha2(Ⅰ)collagen transcription[J]. J Biol Chem, 1995,270(7):3353
3 Anania FA, Potter JJ, Rennie-Tankersley L, et al. Effect of acetaldehyde on nuclear protein binding to the nuclear factor I consensus sequence in the alpha2(Ⅰ) collagen promoter[J]. Hepatology, 1995,21(6):1640
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4 Rippe RA, Almounajed G, Brenner DA. SP1 binding activity increases in activated I to cells[J]. Hepatology, 1995,22(1):241
5 Schmidt A, Rossi P, Crombrugghe B. Transcriptional control of the mouse alpha2(Ⅰ) collagen gene: functional deletion analysis of the promoter and evidence for cell-specific expression[J]. Mol Cell Biol, 1986,6(2):347
6 Yoon K, Thiede MA, Rodan GA. Alkaline phosphatase as a report enzyme[J]. Gene, 1988,66(1):11
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7 Inagaki Y, Truter S, Ramirez F. Transforming growth factor-β stimulates α2(Ⅰ)collagen gene expression through a cis-acting element that contains an SP1-binding site[J]. J Biol Chem, 1994,269(20):14828
8 Gao CF, Gressner G, Zoremba M, et al. Transforming growth factor β (TGF-β) expression in isolated and cultured rat hepatocytes[J]. J Cell Physiol, 1996,167(2):394
9 Poppleton HM,Raghow R. Transcriptional activation of the minimal pro α1(Ⅰ)collagen promoter: obligatory requirement for SP1[J]. Biochem J, 1997,323(1):225
10 Ratziu V, Lalazar A, Wong L, et al. Zf9, a Kruppel-like transcription factor up-regulated in vivo during early hepatic fibrosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(8):9500
(1999-02-25收稿，1999-08-10修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院全军临床免疫中心，上海，200003
关键词：基因；胶原；启动子；转录
第二军医大学学报991008 摘要 目的: 明确纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动子片段，逐段研究小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因2 kb的启动子序列。方法: 从小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因转录起始点上游-2 kb～+54 bp的片段中，取长度不等的片段作为启动子，与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成6个重组体，脂质体转染法转染上述重组体至胶原产生细胞(NIH3T3)和非胶原产生细胞(COS7), CAT-ELISA测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性。结果: -780～+54 bp序列具有最高启动CAT表达活性且有不完全细胞特异性，缺失近转录起始点500 bp, 即-2～-0.5 kb片段的启动子活性最低。结论: 近转录起始点500 bp的序列为小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因启动激活所必需，-780～+54 bp片段有高启动活性，并有望以此序列发现纤维化相关的特异DNA结合蛋白。
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中图分类号 Q 753 文献标识码：A
Activity analysis of promoter from mouse α2(Ⅰ) procollagen gene
Gao Chunfang, Wang Hao, Huang Chao, Kong Xiantao
(Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital,Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To clarify which segment or sequence in mouse α2(Ⅰ) procollagen gene is responsible for high transcriptional activity during fibrogenesis. This study focused on further fractional analysis of 2 kb-length mouse α2(Ⅰ) procollagen gene promoter activity. Methods: Six chimeric genes were constructed in which various lengths of sequences between 2 000 bp upstream of the start of transcription of the mouse α2(Ⅰ) procollagen gene and 54 bp downstream of this site were fused to chloramphenicol acetyltransferase(CAT) reporter gene. These recombinant plasmids were transfected transiently to collagen-producing cells(NIH3T3) and non-collagen-producing cells(COS7) with liposomal transfection method. The putative promoters activities were observed and compared by means of CAT measurement in transfected cells. Results: The highest and partial cell specific CAT expression was observed in construction driven by -780～ +54 bp fragment. The construction containing sequence deleted the proximal 500 bp from the transcription start site and part of exonⅠ resulted in the lowest CAT expression. Conclusion: Some essential elements might exist in the 500 bp fraction proximal to transcription start site and part of exon of Ⅰin mouse α2(Ⅰ) procollagen gene. The high potential promoter sequence between -780 bp from the start of transcription site and +54 bp from this site is of great significance in our following study searching for specific DNA-binding proteins in activated collagen-producing cells.
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KEY WORDS genes, collagen; promoter; transcription
肝脏内胶原产生及胶原含量显著增加是肝硬化患者的主要病理特征， 以Ⅰ型胶原为主的细胞外间质(ECM)过度沉积导致正常肝组织结构破坏、肝功能受损。目前有关肝纤维化或硬化形成的机制尚不完全明确。鉴于Ⅰ型胶原在纤维化或硬化的形成中的重要作用，研究在不同病理条件下Ⅰ型胶原基因的异常激活，对阐述纤维化或硬化病理形成机制有特别重要的意义[1]。
Ⅰ型胶原生物合成在转录水平和转录后水平受多种因素的影响， 这些因素包括细胞因子(如TGFβ,IFNγ)、化学物质(如乙醛)等[2,3]。目前研究已明确发现病理条件下TGFβ通过核转录因子(如SP-1)与Ⅰ型胶原基因上游相应调控序列(顺式调控元件)结合，促使Ⅰ型胶原基因激活并高水平转录[2,4]。进一步研究还发现小鼠Ⅰ型胶原基因5′侧翼区-2 kb至+54 bp(包括部分外显子Ⅰ )片段足以调控细胞特异性Ⅰ型胶原基因转录激活，基因缺失研究在这2 kb的序列中还发现了一些重要的调控元件，但对于这些调控元件及其相应的转录因子研究结果不尽相同[2,3,5]，国内亦未见有同类研究报道。本研究以小鼠α2(Ⅰ)基因-2 kb～+54 bp片段为靶序列，逐段研究其启动转录活性，以发现高启动活性片段。
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1 材料和方法
1.1 细胞培养 小鼠NIH3T3细胞和猴肾COS7细胞(中科院细胞所)以含10%FCS的1640(Gibco)培养液培养，0.125%胰蛋白酶(Sigma)消化传代。
1.2 重组体构建 载体质粒pCAT-促进子(Promega)不含启动子，但含有SV40增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因。重组体中所含的启动子即是所要研究的原胶原α2(Ⅰ)启动子片段。 重组体pCOL0.4，pCOL0.8，pCOL1.0，pCOL1.3的启动子分别是以含小鼠α2(Ⅰ)原胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ1009 (美国NIC Crombrugghe 教授惠赠)为模板的PCR扩增产物[5], 其5′端引物序列分别为：pCOL 0.4: 5′-CATAGTCC-AAGCTTCTGTAAAGAGCCCACGT-3′；pCOL 0.8: 5′-CATAGTCCAAGCTTCCCCTCATCAA-CGAGAG-3′； pCOL 1.0: 5′-CATAGTCCAAGC-TTTCCCAGGAGTTCGCCAG-3′； pCOL 1.3: 5′-CATAGTCCAAGCTTACGCCCTAGGGATGA-TG-3′。
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上述4种重组体的3′端引物相同，序列为：5′-TAGCATCCGTCGACAATCGTGGACCGTTCC-3′。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶Hind Ⅲ及SalⅠ识别位点(下划线部分)。PCR按常规方法进行(PE-9600 PCR扩增仪)，扩增产物经纯化回收后，用Hind Ⅲ，SalⅠ酶切并与相同粘末端的线性pCAT-促进子载体经T4 DNA连接酶(Promega)连接，连接混和物转染至感受态大肠杆菌并筛选，经小量酶切鉴定正确后，大量扩增阳性克隆，抽提、纯化质粒重组体(Qiagen plasmid midi kit)，紫外分光光度计(Du-600,Beckman)测得率、纯度。含小鼠α2(Ⅰ)原胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ 1009经Hind Ⅲ酶切得到2.0 kb(-2 kb～+54 bp)片段，与含HindⅢ粘末端的pCAT-促进子线性载体连接(T4连接酶)组成pCOL 2.0。取上述2 kb序列经XbaⅠ+HindⅢ双酶切后得到1.5 kb(-2 kb～-500 bp)片段，再与有相同粘端的pCAT-促进子线性载体连接组成重组体pCOL 1.5。
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1.3 DNA转染 DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim),具体操作方法如下： NIH3T3细胞或COS7细胞以5×105/孔接种于6孔培养板(Nunc),待细胞60%～80%融合生长后，换新鲜但不含FCS的培养基，重组质粒以脂质体-DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶(ALP)表达质粒pSV2AP(Merck&Co. Inc.惠赠)作为内对照及含CAT的表达质粒(Invitrogen)作为阳性对照[6]。转染后6 h，每孔细胞加两倍于正常量的FCS(20%)，24 h后换新鲜含10%FCS的培养基，继续培养24 h后，测定报告基因CAT活性。
1.4 CAT及ALP活性测定 终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、ALP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。
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2 结 果
2.1 重组体鉴定 以含原胶原α2(Ⅰ)基因-2 kb～+54 bp的质粒为模板，PCR扩增得到4个具有相同3′端的长短分别为0.4,0.8,1.0,1.3 kb的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体pCAT-促进子分别组成重组体pCOL 0.4，pCOL 0.8，pCOL 1.0，pCOL 1.3，重组体中的PCR产物经测序证实碱基正确率超过99.5%, 重组体pCOL 2.0的启动子来自含上述2 kb片段的质粒pAZ1009的酶切片段，pCOL 1.5启动子是pCOL 2.0双酶切后的1.5 kb片段(详见1.2)。上述这些重组体均经酶切鉴定，结果正确(图1 )，即载体均为4.6 kb的pCAT-促进子，插入的启动子长短分别为0.4，0.8，1.0，1.3，1.5，2.0 kb。
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图1 6种重组体酶切后电泳结果
Fig 1 Electrophoresis of 6 constructs digested with restriction enzyme(1% agarose)
1: 100 bp DNA ladder; 2～5: pCOL 0.4, pCOL 0.8 , pCOL 1.0, pCOL 1.3, respectively, all digested with Hind Ⅲ+ Sal Ⅰ; 6: pCOL
1.5 (XbaⅠ + Hind Ⅲ) ; 7:λDNA/ Hind Ⅲ markers ; 8: pCOL 2.0 (Hind Ⅲ ) ; 9: λDNA/EcoRⅠ + Hind Ⅲ markers
2.2 CAT及ALP活性测定结果 胶原产生细胞(NIH3T3)在转染上述含长短不一的启动子的重组体后48 h，ELISA测定细胞CAT表达量，同时测定蛋白浓度及ALP活性，ALP活性作为内对照以保证在转染效率相同条件下比较CAT表达量，CAT测定结果用相应蛋白含量及ALP活性校正后，以pCOL 2.0转染细胞后CAT表达量为1，其余重组体转染后细胞的CAT相对表达量见表1。结果转染含-780～+54 bp重组体的细胞具有最大CAT表达量，而-2 kb～+54 bp中缺失近端500 bp，即-2 kb～-500 bp的重组体转染细胞后CAT表达量最低，其余重组体CAT表达活性的强弱依次为：pCOL 0.4, pCOL 1.0, pCOL 1.3。该结果表明，近转录起始点500 bp的片段为本研究小鼠α2(Ⅰ)原胶原基因启动激活活性必需，-780～+54 bp片段的启动活性较全长2 kb者强，该片段在COS7细胞中虽仍有一定启动活性，但低于在NIH3T3中的活性(pCOL 0.8/pCOL 2.0: 3.16±0.2 vs 9.88±1.0)，提示该片段具有部分细胞特异性。
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表1 含不同启动子的重组体转染NIH3T3细胞
后CAT相对表达量
Tab 1 Summary of CAT expression driven by various
lengths of the 5′flanking sequence of
mouse α2(Ⅰ) procollagen gene Name of transfected
constructions
Putative promoters
length
(bp)
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Relative activities of
reporter gene(CAT)
(
)pCOL 0.4
-348～+54
4.40±0.4
pCOL 0.8
-780～+54
9.88±1.0
pCOL 1.0
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-980～+54
2.90±0.3
pCOL 1.3
-1 304～+54
2.30±0.3
pCOL 1.5
-2 000～-500
0.87±0.1
pCOL 2.0
-2 000～+54
1.00
3 讨 论
, 百拇医药
器官硬化(纤维化)是器官慢性炎症反应的主要病理转归，常见于肝脏、肺、肾脏、皮肤、心血管等，肝硬化是其典型例证。Ⅰ型胶原是硬化(纤维化)中细胞外间质的主要成分[1]。Ⅰ型胶原的两种肽链分别由α1(Ⅰ)，α2(Ⅰ)基因编码。近年来对小鼠Ⅰ型胶原基因的研究表明，包括TGFβ在内的多种因子或化学物质对Ⅰ型胶原基因转录调控有重要作用，诸多重要的转录因子如SP-1，NF-Ⅰ，AP-1，NF-κB 等与其转录调控有关[3,4,7,9,10]。上述转录因子和尚未发现的核因子(即反式作用元件)与相应的DNA调控序列(即顺式作用元件)结合，导致了胶原基因表达的激活或失活。已有研究表明在鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游2 kb的序列存在这种调控元件，5′侧翼区2 kb～+54 bp(包括部分外显子Ⅰ) 的片段足以调控细胞特异性胶原表达。进一步的缺失研究还发现这2 kb的启动子中有几百bp的片段为基因表达所必需[5]，但对于这2 kb片段及DNA结合蛋白的研究结果不尽相同[2,3,5]，国内尚未见有同类研究报道。由于在真核细胞的多种基因转录起始点上游存在TATA盒、CCAAT盒等，胶原基因亦不例外，我们设想近转录起始点上游的序列对转录激活至关重要，为此，我们在不缺失近转录起始序列的基础上，研究有相同3′端但长短不等的启动片段对转录活性的影响。4个重组体pCOL 0.4，pCOL 0.8，pCOL 1.0，pCOL 1.3按此条件构建， 即用不含启动子、但含SV40增强子及CAT报告基因的载体分别与作为启动子的-348～+54 bp，-780～+54 bp，-980～+54 bp，-1 304～+54 bp片段相连组成重组体，为比较近转录起始点上游序列及全长启动子的活性，我们同时构建了以-2～-0.5 kb，-2 kb～+54 bp为启动子的重组体，细胞(NIH3T3)转染及报告基因定量分析提示： -780～+54 bp片段具有最强的启动子样活性，且在非胶原产生细胞(COS7)中亦仍有一定启动活性但低于在NIH3T3中的活性，提示该片段具有不完全细胞特异性，表明部分调控细胞特异性表达的元件存在于这800 bp片段内。
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对已报道的小鼠α2(Ⅰ)型胶原序列进一步分析发现，-690～-610 bp这80 bp片段中G+C占70%以上[5]，这个富含GC的SP-1潜能结合位点(区)可能与相应片段的高启动活性有关。含-1 304～+54 bp， -980～+54 bp，-348～+54 bp的重组体较-2 kb～+54 bp也有较高的CAT表达，提示这些片段亦有较高的启动活性。2 kb启动子缺失近端500 bp即-2 kb～-500 bp片段启动活性最低，这一结果证实了我们最初的设想，即近转录起始点上游的序列对转录激活至关重要。由于上述重组体含长度不等且起止位点不同的片段作为启动子，分析其CAT表达量的差异，我们认为：(1) 全长2 kb的启动子上游(-2.0～-1.3 kb)可能存在负性调控元件, 负性调控元件还可能存在于-980 ～-780 bp中。(2) -348～+54 bp，-780～-348 bp中可能存在正性调控序列。应用本研究中重组的含高活性启动子(-780～+54 bp，-348～+54 bp)的重组体，目前我们正进一步研究相应于这些高启动活性序列的DNA结合蛋白，有望在激活态胶原产生细胞中发现纤维化相关的新的或特异核转录因子，这一研究将有助于我们进一步认识纤维化(硬化)发生中胶原基因如何被转录激活，为纤维化的逆转提供新思路。此外，本研究中建立的含有效α2(Ⅰ)胶原启动序列的重组体，由于报告基因检测方法简便且能定量，是一个新的在转录水平筛选抗纤维化药物的可靠方法。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0733-04
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(1999-02-25收稿，1999-08-10修回), 百拇医药