随机多肽噬菌体展示载体pCANTAB5X的构建
作者：潘 卫 戚中田
单位：第二军医大学基础医学部微生物学教研室，上海，200433
关键词：噬菌体展示；载体
第二军医大学学报991005 摘要 目的：构建适用于外源性随机多肽的噬菌体展示载体。方法：在引物中加入XbaⅠ识别序列，将用该引物扩增的PCR产物克隆到pGEM-T中，再将该片段插入pCANTAB5E中构建成噬菌体展示载体pCANTAB5X。结果：限制酶切点XbaⅠ和HGV C片段被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5X中。结论：构建的新的噬菌体展示载体pCANTAB5X能有效展示外源性随机多肽。
中图分类号 Q 782 文献标识码：A
Construction of novel phagemid pCANTAB5X for displaying of random peptides
, 百拇医药
Pan Wei, Qi Zhongtian
(Department of Microbiology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective： To construct the new phage display vector for effectively displaying the foreign peptides. Methods: A new cloning site XbaⅠ was added to the primers for HGV cDNA PCR amplification. The PCR products was cloned into pGEM-T and transferred to pCANTAB5E to construct the phagemid pCANTAB5X with a novel XbaⅠ cloning site. Results: A novel phagemid pCANTAB5X was constructed with a new cloning site of XbaⅠ. Conclusion: The novel vector can effectively display the foreign peptides.
, 百拇医药
KEY WORDS phagedisplay; vector
噬菌体展示技术是研究生物活性分子间相互作用的新技术[1]。 各种类型的外源分子已在噬菌体表面得到成功的展示[2～4]。 然而，现使用的噬菌体展示载体的克隆位点不理想，往往是较为稀有、酶切效率不高的限制酶酶切位点， 这对构建外源性随机肽库的效率起了限制作用。 本研究在噬菌体展示载体中引入了常用的限制酶克隆位点，构建成能有效展示外源性随机肽的展示载体pCANTAB5X。
1 材料和方法
1.1 质粒载体和细菌株 重组噬菌体抗体表达试剂盒为Amersham pharmacia biotech公司产品(Code No.27-9401-01)，其中包括噬菌粒 pCANTAB5E表达载体(用SfiⅠ, NotⅠ预切过)。 HGV cDNA克隆质粒pHGVqz 由本室提供, 其中包括HGV全长cDNA序列[5]。质粒pGEM-T试剂盒购自Promega公司。大肠杆菌DH5α，TG1为本室保存。
, 百拇医药
1.2 引物序列 用于引入XbaⅠ位点及扩增HGV C片段的上游引物PSFⅠ：5′-GCGGCCCAGCCGGCCTCTAGAAATGCATGGGG-3′，引入XbaⅠ 酶切位点(-TCTAGA-)和SfiⅠ位点(-GGCCCAGCCGGCC-)，下游引物PNOTⅠ：5′-AGGCGGCCGC TCTAGA ACCCAATATC- 3′， 引入XbaⅠ 酶切位点(-TCTAGA-)和NotⅠ位点(-GCGGCCGC-)。上游测序引物PCANTAB5-S1：5′-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC- 3′，下游测序引物序列为 PCANTAB5-S6：5′-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG- 3′。
1.3 工具酶 Taq酶、限制酶、碱性磷酸酶、连接酶均为Gibco BRL产品。
1.4 HGV C片段的PCR扩增与克隆 用PSFⅠ及PNOTⅠ以pHGVqz为模板扩增HGV C基因片段。取纯化的PCR产物500 ng与500 ng pGEM-T载体连接。转化JM109钙化菌。提取重组质粒DNA，XbaⅠ酶切鉴定重组子。
, 百拇医药
1.5 重组噬菌体展示载体pCANTAB5X的构建 克隆到pGEM-T质粒上的HGV C片段用限制酶SfiⅠ及NotⅠ酶切，分离250 bp左右的小片段与经SfiⅠ, NotⅠ预切的pCANTAB-5E连接，转化TG1钙化菌，提取质粒DNA，XbaⅠ, SfiⅠ, NotⅠ酶切鉴定重组子。
1.6 pCANTAB5X DNA序列测定 阳性克隆重组质粒用DNA抽提试剂盒纯化。采用PCR方法进行DNA序列测定，测序引物为pCANTAB5E克隆位点上游和下游引物。所测序列用DNASIS软件进行序列比较分析。
1.7 重组噬菌体展示载体pCANTAB5X的展示应用 pCANTAB5X用XbaⅠ酶切，分离载体片段，碱性磷酸酶处理， 与用PCR方法制备经XbaⅠ酶切的HCV核心蛋白随机DNA连接， 转化大肠杆菌TG1，重组细菌用载体上、下游引物进行PCR扩增，检测插入片段的大小。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HGV核心片段的PCR扩增 用于HGV核心片段(HGC259)的PCR扩增的上游引物PSFI序列相应于HGV IW株[5] 核苷酸序列的435位，上游还带有19个碱基的SfiⅠ和XbaⅠ的限制酶识别序列，下游引物PNOTⅠ相应于HGV序列661位，下游还带有13个碱基的XbaⅠ和NotⅠ识别序列。这样理论上的扩增片段大小应为259 bp。扩增片段电泳后与 pGEM-7Z(+1)/HaeⅢ DNA分子质量标记比较，确在260 bp左右，符合理论值。
2.2 HGV核心片段(HGC 259)的克隆 用试剂盒纯化HGC 259扩增片段，将其克隆到质粒pGEM-T中。二者连接转化后挑6个转化子扩增细菌，提取质粒DNA，用XbaⅠ酶切鉴定重组子，结果如图1所示，6个克隆中有5个含有插入片段，插入片段大小应为231 bp左右，实际电泳结果比扩增片段略小，符合理论预计值。
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图1 HGV 片段pGEM-T-HGC-C克隆的XbaⅠ酶切鉴定
Fig 1 Digestion of pGEM-T-HGC-C with XbaⅠ
Lane 1～6: Clone 1～6; Lane 7: HGV C
fragment; Lane 8:PCR marker
2.3 噬菌粒pCANTAB5X构建 用限制酶SfiⅠ和NotⅠ将HGC 259片段从pGEM-T质粒上切出。低熔点胶回收小片段(分子质量230 bp左右)，直接与重组噬菌体抗体表达系统试剂盒中提供的、已预先用SfiⅠ和NotⅠ切好的噬菌粒载体pCANTAB5E连接。转化大肠杆菌TG1，挑6个重组子用限制酶NotⅠ, XbaⅠ和SfiⅠ筛选鉴定，结果见图2，6个重组子酶切带型均一致，酶切结果符合理论预计值。
, 百拇医药
图2 pCANTAB5X的酶切鉴定
Fig 2 Digestion of pCANTAB5X with NotⅠ,XbaⅠ and SfiⅠ
Lane 1～6: Clone 1～6 digested with NotⅠ; Lane 7: Control plasmid DNA; Lane 8:λDNA/HindⅢ +EcoRⅠ marker; Lane 9～14:Clone 1～6 digested with XbaⅠ; Lane 15～20: Clone 1～6 digested with SfiⅠ
2.4 pCANTAB5X插入区域的序列分析结果 对噬菌粒pCANTAB5X插入部位进行了DNA序列分析。为了明确插入序列接头处的序列，在pCANTAB5E克隆位点SfiⅠ序列上游28 bp处合成了上游测序引物PCANTAB5-S1；在pCANTAB-5E琥珀酸突变终止子下游合成了测序引物PCANTAB5-S6。分别用上、下游引物测定pCANTAB5X中的插入序列及周围序列。二者测定结果经计算机分析比较表明其重叠区域完全一样。这样pCANTAB5X的插入序列及周围DNA序列完全肯定。
, 百拇医药
2.5 pCANTAB5X的应用 将PCR方法制备的HCV核心蛋白随机DNA，克隆到pCANTAB5X的XbaⅠ位点， 用克隆位点两侧的引物扩增克隆片段，结果见图3， 各种大小不一的随机DNA片段被克隆到了pCANTAB5X载体中。 这些插入片段经杂交证实为HCV核心序列(结果未示)。表明该载体有效地展示了外源随机DNA。
图3 pCANTAB5X展示的HCV随机片段的PCR检测
Fig 3 PCR detection of cloned HCV C
random DNA in pCANTAB5X
Lane 1: PCR marker; Lane 2: HCV core DNA;
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Lane 3～10: Clone 1～8
3 讨 论
自从Smith[1] 首次将外源性蛋白展示于噬菌体表面以来，该技术被不断完善，已成为研究生物活性分子的重要方法之一。目前除了生物活性分子蛋白质、激素、细胞因子、酶和病毒蛋白等被成功地展示于噬菌体表面外，多种多样的噬菌体库已被构建成功，如随机肽库[6]、cDNA文库[7]、基因文库[8]和抗体库[9]等。近来一些病毒蛋白及天然蛋白的随机肽噬菌体展示库也被构建成功。然而，这样的随机肽库的构建对噬菌粒的克隆位点要求更高，需要常用的限制酶位点，酶切效率要高，克隆效果要好。而目前现成的展示载体并不能很好地满足这一要求，如BioLab提供载体(M13KE)克隆位点是ACC651和EagⅠ等。Pharmacia 公司提供的pCANTAB5E 是用于展示抗体库的噬菌粒载体，所用的克隆位点是SfiⅠ和NotⅠ。这些位点都不是常用位点。当利用这些位点进行随机肽基因库克隆时，由于在基因操作过程中的不便，往往最终的结果不尽如人意，而影响到克隆效率及库的容量。当使用常用的限制酶位点XbaⅠ进行随机DNA的克隆时，其操作过程得以简化，有利于提高克隆效率，增大库容量。
, 百拇医药
分别使用上、下游测序引物测定了引入pCANTAB5X的DNA序列，两个测序结果的比较表明，引入的序列完全正确，XbaⅠ切点和原载体的序列均完全正确；酶谱分析的结果也证实了这一点。新的展示载体pCANTAB5X可以用XbaⅠ单酶位点展示外源性随机肽库，这一位点是位于噬菌体PⅢ蛋白的N端和信号肽序列的C端之间，所展示的外源蛋白是以融合蛋白的形式展示在PⅢ的N端，因此用单酶位点所克隆的随机DNA库中只有1/6的序列被正确地展示出来。然而这一展示系统是否实用是应用中的最大问题。
我们利用这一XbaⅠ位点成功地展示了HCV核心蛋白的随机DNA，构建成功了噬菌体库，用抗 HCV血清对库进行了选择，获得了阳性克隆，阳性克隆的序列分析证明了外源蛋白以正确的读框得到了展示(结果未示)。说明了这一新的噬菌粒展示载体达到了设计要求，能够正确、方便、有效地展示随机DNA库，具有广阔的应用前景。
文章编号：0258-879X(1999)10-0723-03
, http://www.100md.com
参考文献
1 Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228(4705):1315
2 Smith GP, Petrenko VA. Phage display[J]. Chem Rev， 1997，97(2):391
3 McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains[J]. Nature, 1990，348(6301):552
, http://www.100md.com
4 Winter G, Milstein C. Man-made antibodies[J]. Nature, 1991, 349(6307):293
5 朱分禄， 戚中田， 任 浩, 等. 庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的拼接及克隆[J]. 第二军医大学学报，1998, 19(4)：301
6 白雪帆，Fack F, 杭长寿， 等. 汉坦病毒S基因-多肽噬菌体表面呈现文库的构建[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 1999,15(1):1
7 Jespers LS, Messens JH, De Keyser A, et al. Surface expression and ligand-based selection of cDNAs fused to filamentous phage gene Ⅵ[J]. Biotechnology, 1995, 13(4):378
, 百拇医药
8 Santini C, Brennan D, Mennuni C, et al. Efficient display of an HCV cDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid protein D of bacteriophage lambda[J]. J Mol Biol, 1998, 282(1):125
9 Den W, Sompuram SR, Sarantopoulos S, et al. A bidirectional phage display vector for the selection and mass transfer of polyclonal antibody libraries[J]. J Immunol Methods, 1999, 222(1/2):45
(1999-06-18收稿，1999-08-18修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学基础医学部微生物学教研室，上海，200433
关键词：噬菌体展示；载体
第二军医大学学报991005 摘要 目的：构建适用于外源性随机多肽的噬菌体展示载体。方法：在引物中加入XbaⅠ识别序列，将用该引物扩增的PCR产物克隆到pGEM-T中，再将该片段插入pCANTAB5E中构建成噬菌体展示载体pCANTAB5X。结果：限制酶切点XbaⅠ和HGV C片段被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5X中。结论：构建的新的噬菌体展示载体pCANTAB5X能有效展示外源性随机多肽。
中图分类号 Q 782 文献标识码：A
Construction of novel phagemid pCANTAB5X for displaying of random peptides
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Pan Wei, Qi Zhongtian
(Department of Microbiology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective： To construct the new phage display vector for effectively displaying the foreign peptides. Methods: A new cloning site XbaⅠ was added to the primers for HGV cDNA PCR amplification. The PCR products was cloned into pGEM-T and transferred to pCANTAB5E to construct the phagemid pCANTAB5X with a novel XbaⅠ cloning site. Results: A novel phagemid pCANTAB5X was constructed with a new cloning site of XbaⅠ. Conclusion: The novel vector can effectively display the foreign peptides.
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KEY WORDS phagedisplay; vector
噬菌体展示技术是研究生物活性分子间相互作用的新技术[1]。 各种类型的外源分子已在噬菌体表面得到成功的展示[2～4]。 然而，现使用的噬菌体展示载体的克隆位点不理想，往往是较为稀有、酶切效率不高的限制酶酶切位点， 这对构建外源性随机肽库的效率起了限制作用。 本研究在噬菌体展示载体中引入了常用的限制酶克隆位点，构建成能有效展示外源性随机肽的展示载体pCANTAB5X。
1 材料和方法
1.1 质粒载体和细菌株 重组噬菌体抗体表达试剂盒为Amersham pharmacia biotech公司产品(Code No.27-9401-01)，其中包括噬菌粒 pCANTAB5E表达载体(用SfiⅠ, NotⅠ预切过)。 HGV cDNA克隆质粒pHGVqz 由本室提供, 其中包括HGV全长cDNA序列[5]。质粒pGEM-T试剂盒购自Promega公司。大肠杆菌DH5α，TG1为本室保存。
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1.2 引物序列 用于引入XbaⅠ位点及扩增HGV C片段的上游引物PSFⅠ：5′-GCGGCCCAGCCGGCCTCTAGAAATGCATGGGG-3′，引入XbaⅠ 酶切位点(-TCTAGA-)和SfiⅠ位点(-GGCCCAGCCGGCC-)，下游引物PNOTⅠ：5′-AGGCGGCCGC TCTAGA ACCCAATATC- 3′， 引入XbaⅠ 酶切位点(-TCTAGA-)和NotⅠ位点(-GCGGCCGC-)。上游测序引物PCANTAB5-S1：5′-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC- 3′，下游测序引物序列为 PCANTAB5-S6：5′-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG- 3′。
1.3 工具酶 Taq酶、限制酶、碱性磷酸酶、连接酶均为Gibco BRL产品。
1.4 HGV C片段的PCR扩增与克隆 用PSFⅠ及PNOTⅠ以pHGVqz为模板扩增HGV C基因片段。取纯化的PCR产物500 ng与500 ng pGEM-T载体连接。转化JM109钙化菌。提取重组质粒DNA，XbaⅠ酶切鉴定重组子。
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1.5 重组噬菌体展示载体pCANTAB5X的构建 克隆到pGEM-T质粒上的HGV C片段用限制酶SfiⅠ及NotⅠ酶切，分离250 bp左右的小片段与经SfiⅠ, NotⅠ预切的pCANTAB-5E连接，转化TG1钙化菌，提取质粒DNA，XbaⅠ, SfiⅠ, NotⅠ酶切鉴定重组子。
1.6 pCANTAB5X DNA序列测定 阳性克隆重组质粒用DNA抽提试剂盒纯化。采用PCR方法进行DNA序列测定，测序引物为pCANTAB5E克隆位点上游和下游引物。所测序列用DNASIS软件进行序列比较分析。
1.7 重组噬菌体展示载体pCANTAB5X的展示应用 pCANTAB5X用XbaⅠ酶切，分离载体片段，碱性磷酸酶处理， 与用PCR方法制备经XbaⅠ酶切的HCV核心蛋白随机DNA连接， 转化大肠杆菌TG1，重组细菌用载体上、下游引物进行PCR扩增，检测插入片段的大小。
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2 结 果
2.1 HGV核心片段的PCR扩增 用于HGV核心片段(HGC259)的PCR扩增的上游引物PSFI序列相应于HGV IW株[5] 核苷酸序列的435位，上游还带有19个碱基的SfiⅠ和XbaⅠ的限制酶识别序列，下游引物PNOTⅠ相应于HGV序列661位，下游还带有13个碱基的XbaⅠ和NotⅠ识别序列。这样理论上的扩增片段大小应为259 bp。扩增片段电泳后与 pGEM-7Z(+1)/HaeⅢ DNA分子质量标记比较，确在260 bp左右，符合理论值。
2.2 HGV核心片段(HGC 259)的克隆 用试剂盒纯化HGC 259扩增片段，将其克隆到质粒pGEM-T中。二者连接转化后挑6个转化子扩增细菌，提取质粒DNA，用XbaⅠ酶切鉴定重组子，结果如图1所示，6个克隆中有5个含有插入片段，插入片段大小应为231 bp左右，实际电泳结果比扩增片段略小，符合理论预计值。
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图1 HGV 片段pGEM-T-HGC-C克隆的XbaⅠ酶切鉴定
Fig 1 Digestion of pGEM-T-HGC-C with XbaⅠ
Lane 1～6: Clone 1～6; Lane 7: HGV C
fragment; Lane 8:PCR marker
2.3 噬菌粒pCANTAB5X构建 用限制酶SfiⅠ和NotⅠ将HGC 259片段从pGEM-T质粒上切出。低熔点胶回收小片段(分子质量230 bp左右)，直接与重组噬菌体抗体表达系统试剂盒中提供的、已预先用SfiⅠ和NotⅠ切好的噬菌粒载体pCANTAB5E连接。转化大肠杆菌TG1，挑6个重组子用限制酶NotⅠ, XbaⅠ和SfiⅠ筛选鉴定，结果见图2，6个重组子酶切带型均一致，酶切结果符合理论预计值。
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图2 pCANTAB5X的酶切鉴定
Fig 2 Digestion of pCANTAB5X with NotⅠ,XbaⅠ and SfiⅠ
Lane 1～6: Clone 1～6 digested with NotⅠ; Lane 7: Control plasmid DNA; Lane 8:λDNA/HindⅢ +EcoRⅠ marker; Lane 9～14:Clone 1～6 digested with XbaⅠ; Lane 15～20: Clone 1～6 digested with SfiⅠ
2.4 pCANTAB5X插入区域的序列分析结果 对噬菌粒pCANTAB5X插入部位进行了DNA序列分析。为了明确插入序列接头处的序列，在pCANTAB5E克隆位点SfiⅠ序列上游28 bp处合成了上游测序引物PCANTAB5-S1；在pCANTAB-5E琥珀酸突变终止子下游合成了测序引物PCANTAB5-S6。分别用上、下游引物测定pCANTAB5X中的插入序列及周围序列。二者测定结果经计算机分析比较表明其重叠区域完全一样。这样pCANTAB5X的插入序列及周围DNA序列完全肯定。
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2.5 pCANTAB5X的应用 将PCR方法制备的HCV核心蛋白随机DNA，克隆到pCANTAB5X的XbaⅠ位点， 用克隆位点两侧的引物扩增克隆片段，结果见图3， 各种大小不一的随机DNA片段被克隆到了pCANTAB5X载体中。 这些插入片段经杂交证实为HCV核心序列(结果未示)。表明该载体有效地展示了外源随机DNA。
图3 pCANTAB5X展示的HCV随机片段的PCR检测
Fig 3 PCR detection of cloned HCV C
random DNA in pCANTAB5X
Lane 1: PCR marker; Lane 2: HCV core DNA;
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Lane 3～10: Clone 1～8
3 讨 论
自从Smith[1] 首次将外源性蛋白展示于噬菌体表面以来，该技术被不断完善，已成为研究生物活性分子的重要方法之一。目前除了生物活性分子蛋白质、激素、细胞因子、酶和病毒蛋白等被成功地展示于噬菌体表面外，多种多样的噬菌体库已被构建成功，如随机肽库[6]、cDNA文库[7]、基因文库[8]和抗体库[9]等。近来一些病毒蛋白及天然蛋白的随机肽噬菌体展示库也被构建成功。然而，这样的随机肽库的构建对噬菌粒的克隆位点要求更高，需要常用的限制酶位点，酶切效率要高，克隆效果要好。而目前现成的展示载体并不能很好地满足这一要求，如BioLab提供载体(M13KE)克隆位点是ACC651和EagⅠ等。Pharmacia 公司提供的pCANTAB5E 是用于展示抗体库的噬菌粒载体，所用的克隆位点是SfiⅠ和NotⅠ。这些位点都不是常用位点。当利用这些位点进行随机肽基因库克隆时，由于在基因操作过程中的不便，往往最终的结果不尽如人意，而影响到克隆效率及库的容量。当使用常用的限制酶位点XbaⅠ进行随机DNA的克隆时，其操作过程得以简化，有利于提高克隆效率，增大库容量。
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分别使用上、下游测序引物测定了引入pCANTAB5X的DNA序列，两个测序结果的比较表明，引入的序列完全正确，XbaⅠ切点和原载体的序列均完全正确；酶谱分析的结果也证实了这一点。新的展示载体pCANTAB5X可以用XbaⅠ单酶位点展示外源性随机肽库，这一位点是位于噬菌体PⅢ蛋白的N端和信号肽序列的C端之间，所展示的外源蛋白是以融合蛋白的形式展示在PⅢ的N端，因此用单酶位点所克隆的随机DNA库中只有1/6的序列被正确地展示出来。然而这一展示系统是否实用是应用中的最大问题。
我们利用这一XbaⅠ位点成功地展示了HCV核心蛋白的随机DNA，构建成功了噬菌体库，用抗 HCV血清对库进行了选择，获得了阳性克隆，阳性克隆的序列分析证明了外源蛋白以正确的读框得到了展示(结果未示)。说明了这一新的噬菌粒展示载体达到了设计要求，能够正确、方便、有效地展示随机DNA库，具有广阔的应用前景。
文章编号：0258-879X(1999)10-0723-03
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参考文献
1 Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228(4705):1315
2 Smith GP, Petrenko VA. Phage display[J]. Chem Rev， 1997，97(2):391
3 McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains[J]. Nature, 1990，348(6301):552
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4 Winter G, Milstein C. Man-made antibodies[J]. Nature, 1991, 349(6307):293
5 朱分禄， 戚中田， 任 浩, 等. 庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的拼接及克隆[J]. 第二军医大学学报，1998, 19(4)：301
6 白雪帆，Fack F, 杭长寿， 等. 汉坦病毒S基因-多肽噬菌体表面呈现文库的构建[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 1999,15(1):1
7 Jespers LS, Messens JH, De Keyser A, et al. Surface expression and ligand-based selection of cDNAs fused to filamentous phage gene Ⅵ[J]. Biotechnology, 1995, 13(4):378
, 百拇医药
8 Santini C, Brennan D, Mennuni C, et al. Efficient display of an HCV cDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid protein D of bacteriophage lambda[J]. J Mol Biol, 1998, 282(1):125
9 Den W, Sompuram SR, Sarantopoulos S, et al. A bidirectional phage display vector for the selection and mass transfer of polyclonal antibody libraries[J]. J Immunol Methods, 1999, 222(1/2):45
(1999-06-18收稿，1999-08-18修回), http://www.100md.com