BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞生存能力的影响
作者：黄 海 周江红 潘星华 余 龙 孔宪涛
单位：作者单位：第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科，上海，200433(作者现于MTC,Karolinska Institute,Sweden)；周江红：第二军医大学长海医院药学部；潘星华：Boyer Center for Molecular Medicine,Yale University,USA；余 龙：复旦大学遗传学研究所基因工程国家重点实验室；孔宪涛：第二军医大学长征医院全军临床免疫中心
关键词：鼻咽肿瘤；BHRF1基因；反义技术
第二军医大学学报991004 摘要 目的：探讨BHRF1反义寡核苷酸对表达BHRF1的鼻咽癌细胞株CNE2生存能力的影响。方法：检测反义阻断BHRF1表达后BHRF1-CNE2细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化。结果：在喜树碱作用下，应用BHRF1反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降，凋亡率增高。结论：反义阻断BHRF1的表达可降低CNE2细胞的生存能力，这在鼻咽癌的治疗中可能具有一定的价值。
, 百拇医药
中图分类号 R 739.60.5 文献标识码：A
Effect of BHRF1 antisense oligonucleotide on the vitality of BHRF1-CNE2 cells
Huang Hai, Zhou Jianghong, Pan Xinghua, Yu Long, Kong Xiantao
(Department of Otohinolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of BHRF1 antisense oligonucleotide on apoptotic resistance of the BHRF1 expressing cell line of nasopharyngeal carcimona, CNE2. Methods: After incubated with BHRF1 antisense oligonucleotide, BHRF1-CNE2 cells were treated with camptothecin, and tested for the alterations of proliferative ability and apoptotic index. Results: After the treatment of camptothecin, in antisense group, proliferative rates of CNE2 dropped and apoptotic rates increased. Conclusion: Antisense inhibition of BHRF1 expression can reduce apoptotic resistance of CNE2 cells, which may be valuable for the treatment of nasopharyngeal carcinoma.
, 百拇医药
KEY WORDS nasopharyngeal neoplasms; genes, BHRF1; antisense technique
在EB病毒感染的组织细胞中多发现有EB病毒基因BHRF1的存在，提示BHRF1基因在病毒生活周期中起着重要作用。BHRF1基因和bcl-2在核酸序列上具有很高的同源性，提示其有相似的作用机制，即抑制细胞凋亡的作用。EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明确相关，本研究探讨反义阻断BHRF1表达对鼻咽癌细胞株CNE2细胞生存能力的影响及其在治疗中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 材料 BHRF1-CNE2细胞为我们构建的含BHRF1表达载体的鼻咽癌细胞株[1]。
1.2 寡核苷酸片段的合成 按照BHRF1 cDNA开放阅读框前20个碱基对的序列分别合成其正义、反义及无义寡核苷酸片段，并于3′和5′端行硫化。正义片段：5′-GATCTTGTAGAGCAAGATGG-3′；反义片段：5′-CCATCTTGCTCTACAAG ATC-3′；无义片段：5′-CTAGAACATCTCGTTCTACC-3′。
, http://www.100md.com
1.3 反义阻断BHRF1表达对癌细胞在喜树碱作用下生存能力的影响 向接种于96孔板(3×103个/孔)的CNE2细胞分别加入终浓度为10 μmol/L的正义、反义、无义寡核苷酸片段，再培养1 d后加入含有20 nmol/ml喜树碱的新鲜培养液，继续培养8 d，每2 d换1次含相应寡核苷酸片段的喜树碱培养液，空白对照组则不加任何寡核苷酸片段。每天检测每组3孔的MTT值。
1.4 反义阻断BHRF1表达对癌细胞抗凋亡能力的影响 (1)BHRF1-CNE2细胞分别加入终浓度为10 μmol/L的各种寡核苷酸片段培养24 h后，用0.15 mmol/L的喜树碱培养6 h；(2)利用末端标记技术检查癌细胞的凋亡情况；(3)凋亡指数计算：凋亡指数＝凋亡细胞数/100个细胞，每例随机计算3个视野。
1.5 统计学处理 数据以
表示，用χ2检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 反义阻断BHRF1表达对癌细胞在喜树碱作用下生存能力的影响 从图1中可以看出，随着反义BHRF1寡核苷酸对BHRF1表达的阻断作用，在喜树碱作用下，反义寡核苷酸作用组的癌细胞数迅速下降，致第7天癌细胞基本死亡；而空白组、无义组和正义组的癌细胞数则呈缓慢下降的趋势，致第10天细胞才接近全部死亡。
图1 BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞
在喜树碱作用下增殖的影响
Fig 1 Effect of BHRF1 antisense oligonucleotide on
the proliferation of BHRF1-CNE2 cells
, 百拇医药
under the condition of camptothecin
○: Blank; ●:Non-sense; △: Sense; ▲: Antisense
2.2 反义阻断BHRF1表达对癌细胞抗凋亡能力的影响 阳性凋亡细胞表现为细胞核内有棕褐色颗粒。空白组、无义组、正义组和反义组凋亡指数分别为30.5±9.24，34.2±7.45，32.7±5.33，58.6±11.62。经统计学处理显示，反义组与空白组、正义组及无义组间的差异有非常显著的意义(P<0.01)。
3 讨 论
BHRF1是参与调节细胞凋亡的生存基因家族成员之一，其与bcl-2在羧基端的某些区域大部分核苷酸序列相同，蛋白质结构相同，提示其为功能区。共焦显微镜分析发现，BHRF1与bcl-2有相同的细胞内定位，共同分布于核周、胞浆和核膜[1]。BHRF1与bcl-2有着相似的核苷酸序列和相同的细胞内定位，提示其具有相同的功能和作用机制，即抑制细胞凋亡的作用，为细胞生存提供了一个替代的、bcl-2非依赖的方法[2]。我们通过检测发现，在大多数的鼻咽癌组织中存在BHRF1基因，其表达可能与患者的临床预后有关[3]。转基因研究发现，BHRF1的表达能保护细胞免于DNA损伤物质如顺铂和丝裂霉素C诱发的凋亡[4]。
, http://www.100md.com
由于反义寡核苷酸具有特异性高和操作简单等特点，所以已被广泛应用于肿瘤研究中，并在基因治疗中具有良好的应用前景。通过研究发现，反义EB病毒LMP1基因能有效地抑制人低分化鼻咽癌细胞株CNE3细胞的生长，软琼脂集落形成率和裸鼠致癌能力明显下降[5]。反义寡核苷酸可抑制EB病毒诱导的细胞增生，并可同时阻断多个病毒基因以增加作用效果。
喜树碱可与拓扑异构酶Ⅰ结合，而抑制DNA的复制、修复和转录过程。其对增殖细胞敏感，为细胞周期特异性，主要作用于S期。
原位末端标记法是检测细胞凋亡的特异性方法之一，其利用细胞在凋亡过程中产生的具有粘性末端的DNA碎片可被Klenow聚合酶补平的原理，将生物素标记的核苷酸原位掺入DNA缺口，再用辣根酶标记的抗生物素蛋白抗体作用后，经DAB显色可使凋亡细胞呈阳性着色，故可准确反映出喜树碱诱发CNE2细胞凋亡的情况。
本研究发现，BHRF1的反义寡核苷酸片段可抑制BHRF1-CNE2细胞抵抗喜树碱诱发的凋亡作用。进入细胞的反义BHRF1片段根据碱基互补的原则，特异性地与BHRF1基因的相应部位结合，而抑制其进行翻译表达，进而影响其功能发挥。随着CNE2细胞对培养液中反义BHRF1片段的吸收，其细胞内浓度逐渐增加，阻断效果增强，使其对喜树碱杀伤抗性下降，凋亡率增高。因此，本实验证实了反义寡核苷酸片段能有效降低BHRF1表达对CNE2细胞抗喜树碱诱发凋亡的影响，其在鼻咽癌治疗中的价值值得进一步的研究。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0720-03
参考文献
1 黄 海，潘星华，余 龙，等. BHRF1基因表达对CNE2细胞生长的影响[J]. 第二军医大学学报，1998，19(2)：131
2 Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection[J]. Virology, 1994, 201(2):404
3 黄 海，潘星华，周水淼，等. 鼻咽癌组织中BHRF1基因的研究[J]. 第二军医大学学报，1998，19(1)：85
, 百拇医药
4 Henderson S, Huen D, Rowe M, et al. Epstein-Barr virus-coded BHRF1 protein, a viral homologue of Bcl-2, protects human B cells from programmed cell death[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(18): 8479
5 刘振声，李宝民，刘彦仿，等. EB病毒反义LMP1基因对人低分化鼻咽癌CNE-3细胞株生长的抑制作用[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31(2)：92
(1999-02-06收稿，1999-07-21修回), http://www.100md.com
单位：作者单位：第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科，上海，200433(作者现于MTC,Karolinska Institute,Sweden)；周江红：第二军医大学长海医院药学部；潘星华：Boyer Center for Molecular Medicine,Yale University,USA；余 龙：复旦大学遗传学研究所基因工程国家重点实验室；孔宪涛：第二军医大学长征医院全军临床免疫中心
关键词：鼻咽肿瘤；BHRF1基因；反义技术
第二军医大学学报991004 摘要 目的：探讨BHRF1反义寡核苷酸对表达BHRF1的鼻咽癌细胞株CNE2生存能力的影响。方法：检测反义阻断BHRF1表达后BHRF1-CNE2细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化。结果：在喜树碱作用下，应用BHRF1反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降，凋亡率增高。结论：反义阻断BHRF1的表达可降低CNE2细胞的生存能力，这在鼻咽癌的治疗中可能具有一定的价值。
, 百拇医药
中图分类号 R 739.60.5 文献标识码：A
Effect of BHRF1 antisense oligonucleotide on the vitality of BHRF1-CNE2 cells
Huang Hai, Zhou Jianghong, Pan Xinghua, Yu Long, Kong Xiantao
(Department of Otohinolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of BHRF1 antisense oligonucleotide on apoptotic resistance of the BHRF1 expressing cell line of nasopharyngeal carcimona, CNE2. Methods: After incubated with BHRF1 antisense oligonucleotide, BHRF1-CNE2 cells were treated with camptothecin, and tested for the alterations of proliferative ability and apoptotic index. Results: After the treatment of camptothecin, in antisense group, proliferative rates of CNE2 dropped and apoptotic rates increased. Conclusion: Antisense inhibition of BHRF1 expression can reduce apoptotic resistance of CNE2 cells, which may be valuable for the treatment of nasopharyngeal carcinoma.
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KEY WORDS nasopharyngeal neoplasms; genes, BHRF1; antisense technique
在EB病毒感染的组织细胞中多发现有EB病毒基因BHRF1的存在，提示BHRF1基因在病毒生活周期中起着重要作用。BHRF1基因和bcl-2在核酸序列上具有很高的同源性，提示其有相似的作用机制，即抑制细胞凋亡的作用。EB病毒感染与鼻咽癌的发生和发展明确相关，本研究探讨反义阻断BHRF1表达对鼻咽癌细胞株CNE2细胞生存能力的影响及其在治疗中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 材料 BHRF1-CNE2细胞为我们构建的含BHRF1表达载体的鼻咽癌细胞株[1]。
1.2 寡核苷酸片段的合成 按照BHRF1 cDNA开放阅读框前20个碱基对的序列分别合成其正义、反义及无义寡核苷酸片段，并于3′和5′端行硫化。正义片段：5′-GATCTTGTAGAGCAAGATGG-3′；反义片段：5′-CCATCTTGCTCTACAAG ATC-3′；无义片段：5′-CTAGAACATCTCGTTCTACC-3′。
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1.3 反义阻断BHRF1表达对癌细胞在喜树碱作用下生存能力的影响 向接种于96孔板(3×103个/孔)的CNE2细胞分别加入终浓度为10 μmol/L的正义、反义、无义寡核苷酸片段，再培养1 d后加入含有20 nmol/ml喜树碱的新鲜培养液，继续培养8 d，每2 d换1次含相应寡核苷酸片段的喜树碱培养液，空白对照组则不加任何寡核苷酸片段。每天检测每组3孔的MTT值。
1.4 反义阻断BHRF1表达对癌细胞抗凋亡能力的影响 (1)BHRF1-CNE2细胞分别加入终浓度为10 μmol/L的各种寡核苷酸片段培养24 h后，用0.15 mmol/L的喜树碱培养6 h；(2)利用末端标记技术检查癌细胞的凋亡情况；(3)凋亡指数计算：凋亡指数＝凋亡细胞数/100个细胞，每例随机计算3个视野。
1.5 统计学处理 数据以
表示，用χ2检验。, 百拇医药
2 结 果
2.1 反义阻断BHRF1表达对癌细胞在喜树碱作用下生存能力的影响 从图1中可以看出，随着反义BHRF1寡核苷酸对BHRF1表达的阻断作用，在喜树碱作用下，反义寡核苷酸作用组的癌细胞数迅速下降，致第7天癌细胞基本死亡；而空白组、无义组和正义组的癌细胞数则呈缓慢下降的趋势，致第10天细胞才接近全部死亡。
图1 BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞
在喜树碱作用下增殖的影响
Fig 1 Effect of BHRF1 antisense oligonucleotide on
the proliferation of BHRF1-CNE2 cells
, 百拇医药
under the condition of camptothecin
○: Blank; ●:Non-sense; △: Sense; ▲: Antisense
2.2 反义阻断BHRF1表达对癌细胞抗凋亡能力的影响 阳性凋亡细胞表现为细胞核内有棕褐色颗粒。空白组、无义组、正义组和反义组凋亡指数分别为30.5±9.24，34.2±7.45，32.7±5.33，58.6±11.62。经统计学处理显示，反义组与空白组、正义组及无义组间的差异有非常显著的意义(P<0.01)。
3 讨 论
BHRF1是参与调节细胞凋亡的生存基因家族成员之一，其与bcl-2在羧基端的某些区域大部分核苷酸序列相同，蛋白质结构相同，提示其为功能区。共焦显微镜分析发现，BHRF1与bcl-2有相同的细胞内定位，共同分布于核周、胞浆和核膜[1]。BHRF1与bcl-2有着相似的核苷酸序列和相同的细胞内定位，提示其具有相同的功能和作用机制，即抑制细胞凋亡的作用，为细胞生存提供了一个替代的、bcl-2非依赖的方法[2]。我们通过检测发现，在大多数的鼻咽癌组织中存在BHRF1基因，其表达可能与患者的临床预后有关[3]。转基因研究发现，BHRF1的表达能保护细胞免于DNA损伤物质如顺铂和丝裂霉素C诱发的凋亡[4]。
, http://www.100md.com
由于反义寡核苷酸具有特异性高和操作简单等特点，所以已被广泛应用于肿瘤研究中，并在基因治疗中具有良好的应用前景。通过研究发现，反义EB病毒LMP1基因能有效地抑制人低分化鼻咽癌细胞株CNE3细胞的生长，软琼脂集落形成率和裸鼠致癌能力明显下降[5]。反义寡核苷酸可抑制EB病毒诱导的细胞增生，并可同时阻断多个病毒基因以增加作用效果。
喜树碱可与拓扑异构酶Ⅰ结合，而抑制DNA的复制、修复和转录过程。其对增殖细胞敏感，为细胞周期特异性，主要作用于S期。
原位末端标记法是检测细胞凋亡的特异性方法之一，其利用细胞在凋亡过程中产生的具有粘性末端的DNA碎片可被Klenow聚合酶补平的原理，将生物素标记的核苷酸原位掺入DNA缺口，再用辣根酶标记的抗生物素蛋白抗体作用后，经DAB显色可使凋亡细胞呈阳性着色，故可准确反映出喜树碱诱发CNE2细胞凋亡的情况。
本研究发现，BHRF1的反义寡核苷酸片段可抑制BHRF1-CNE2细胞抵抗喜树碱诱发的凋亡作用。进入细胞的反义BHRF1片段根据碱基互补的原则，特异性地与BHRF1基因的相应部位结合，而抑制其进行翻译表达，进而影响其功能发挥。随着CNE2细胞对培养液中反义BHRF1片段的吸收，其细胞内浓度逐渐增加，阻断效果增强，使其对喜树碱杀伤抗性下降，凋亡率增高。因此，本实验证实了反义寡核苷酸片段能有效降低BHRF1表达对CNE2细胞抗喜树碱诱发凋亡的影响，其在鼻咽癌治疗中的价值值得进一步的研究。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0720-03
参考文献
1 黄 海，潘星华，余 龙，等. BHRF1基因表达对CNE2细胞生长的影响[J]. 第二军医大学学报，1998，19(2)：131
2 Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection[J]. Virology, 1994, 201(2):404
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4 Henderson S, Huen D, Rowe M, et al. Epstein-Barr virus-coded BHRF1 protein, a viral homologue of Bcl-2, protects human B cells from programmed cell death[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(18): 8479
5 刘振声，李宝民，刘彦仿，等. EB病毒反义LMP1基因对人低分化鼻咽癌CNE-3细胞株生长的抑制作用[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31(2)：92
(1999-02-06收稿，1999-07-21修回), http://www.100md.com