小鼠神经细胞cdc2类蛋白激酶调节亚基p35Nck5a基因的克隆和鉴定
作者：周常文 戴旭明 薛 红 傅继梁
单位：第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海，200433；周常文：兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所，新疆乌鲁木齐市，830000；薛 红：香港科技大学生物化学系
关键词：p35Nck5a基因；克隆；序列分析
摘要 目的摘要 目的： 获取小鼠神经细胞cdc2类激酶(Nclk)调节亚基p35Nck5a基因组DNA，用于构建基因重复性打靶载体。方法： 用噬斑原位杂交法从λPS基因文库中克隆小鼠p35Nck5a基因；用限制性内切酶酶切图谱分析和序列测定进行基因组结构分析。结果： 获得较完整的p35Nck5a基因组DNA酶切图谱；该基因由一个外显子组成，长924 bp，编码307个氨基酸的蛋白质，内含子长208 bp，位于5′端侧翼序列中。测定的序列(-1 080至+924 bp和+3 721至+4 222 bp)与已报道的序列基本一致，仅在-135和-295位各插入一个碱基G。结论： 得到的 p35Nck5a基因组DNA片段长约11 kb, 其5′端侧翼序列含有一些已知的调控序列，3′端含有poly A的信号序列，满足了构建基因重复性打靶载体的要求。
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中图分类号 Q 785 文献标识码：A
Cloning and identification of mouse neuronal cdc2-like kinase regulatory subunit p35Nck5a gene
Zhou Changwen, Dai Xuming, Xue Hong, Fu Jiliang
(Department of Medical Genetics, Department of Basic Medicine,Second Military Medical University, Shanghai，200433)
ABSTRACT Objective: To construct gene targeting vector for duplicating the regulatory subunit p35Nck5a gene of mouse neuronal cdc2-like kinase(Nclk) and study the relationship between increased Nclk activity and hyperphosphorylated protein tau of Alzheimer′s disease(AD). Methods: Bacteriophage plaque in situ hybridization was used for cloning p35Nck5a gene from λPS library . The analysis of p35Nck5a genomic DNA structure was carried out by restriction endonuclease mapping and sequencing. Results: p35Nck5a gene mapping was obtained. The gene consisted of only an exon which was 924 bp in length and encoded a protein which contained 307 amino acids. A 208 bp intron was located in 5′-flanking region. The determined sequence(-1 080 to +924 bp and +3 721 to +4 222 bp) was basically consistent with that reported, except a base G was inserted at -135 site and -295 site, respectively. Conclusion: About 11 kb of genomic DNA fragment is obtained, in which there are some known regulatory elements in 5′-flanking region and the polyadenylation signal in 3′-flanking region. This DNA fragment meets the requirement of constructing gene targeting vector for gene duplication.
, 百拇医药
KEY WORDS genes, p35Nck5a; cloning; sequence analysis
神经细胞cdc2类激酶(Nclk)由催化亚基Cdk5和调节亚基p35Nck5a或p39nck5ai组成, Nclk的活性是由调节亚基决定的[1]。p35Nck5a和p39Nck5ai基因的同源性为60%。体外研究发现，Nclk可使微管相关蛋白——tau蛋白的正常和异常位点发生磷酸化。异常过度磷酸化的tau蛋白的存在是Alzheimer病(AD)重要的病理特征之一[2]，因此，Nclk可能与AD的发生密切相关。为了在活体内验证Nclk激酶活性增高与NFTs形成之间的联系，根据“DNA双链缺口修复”的原理[3]，在保持其他遗传背景相同的情况下，通过基因打靶技术制备p35Nck5a基因定点重复的小鼠模型可能是一条最佳途径。本研究报道小鼠Nclk调节亚基p35Nck5a基因的克隆及其结构分析，为下一步研究奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要材料 pHP39Nck5ai 质粒和λPS基因组文库[4]由薛红博士提供。pBluescript SK+ 质粒系Stratagene公司产品。C600和DH5α菌株由本室保存。实验中使用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等分别购自Gibco BRL和USB等公司。α-32P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。WizardTM质粒抽提试剂盒购自Promega公司。QIAEX Ⅱ凝胶纯化试剂盒购自QIAGENE公司。Ready-to-go探针标记试剂盒和T7测序试剂盒购自Pharmacia 公司。 ABI PRISMTM 荧光测序试剂盒购自PE公司。根据小鼠p35Nck5a基因序列和Stratagene公司序列资料，用PCGENE软件包自行设计了PCR和测序引物，由上海生工生物工程公司合成。引物序列及其结合位点见表1。
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表1 实验中所用的测序引物
Tab 1 Sequencing primers used in the experiment
Primer name
Nucleotide sequence
Binding site
p35f
5′-ATGGGCACGGTGCTGTCCCTATC-3′
1～23 bp
p35r
5′-TCACCGATCCAGCCCCAGGAGGA-3′
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924～901 bp
p35-1
5′-GCTAGACTTAAGTGTTCGAGC-3′
4 247～4 268 bp
p35-2
5′-CCAAACTGAGCTTCATGACTC-3′
4 885～4 864 bp
pT3
5′-TCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACA-3′
T3 promoter sequence
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pT7
5′-AATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAAT-3′
T7 promoter sequence
1.2 方法
1.2.1 λPS基因文库的筛选 参照文献[5]介绍的方法进行。以C600为宿主菌，采用人的p39Nck5ai cDNA为探针，共筛选约2×105个噬斑。用杂交阳性单斑制备噬菌体原种，然后，用PEG沉淀法提取噬菌体DNA。
1.2.2 亚克隆的制备 噬菌体和pBluescript SK+质粒DNA的酶切、连接和转化等按常规方法进行；DNA片段的回收和质粒DNA的小量制备按试剂盒说明书进行；用酶切或杂交方法鉴定阳性亚克隆质粒。
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1.2.3 限制性内切酶酶切图谱分析 采用单酶/双酶组合酶切分析法[6]进行。
1.2.4 PCR扩增 依据引物的Tm值不同，采用相应的反应条件，按常规进行。
1.2.5 Southern 印迹杂交 用Pharmacia 公司真空转移仪按说明书进行DNA转移；按Ready-to-go试剂盒说明书进行探针标记；用杂交仪按常规方法进行杂交反应。
1.2.6 序列测定 核素测序按T7测序试剂盒说明书进行；荧光测序按ABI公司测序试剂盒说明书进行。
2 结 果
2.1 λPS基因文库的筛选 根据人p39Nck5ai与小鼠p39Nck5ai和p35Nck5a基因的同源性分别为98%和60%，适当降低洗膜的严格性，通过一次筛选，希望同时获得小鼠p39Nck5ai和p35Nck5a两个基因。pHP39Nck5ai 质粒DNA经EcoRⅠ酶切，得到1.1 kb长的人p39Nck5ai cDNA作为筛库探针，经4轮筛选，共获得7个阳性克隆(E11-1, E11-2，E13-7, E14-1，E15-4，E16-2，E17-5)。参照已知的部分限制性内切酶酶切图谱，对其进行酶切分析，初步判定E15-4克隆中含有Nclk的主要调节亚基p35Nck5a基因。
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2.2 小鼠p35Nck5a基因组DNA的鉴定
2.2.1 Southern印迹杂交 用BamHⅠ对E15-4噬菌体DNA进行酶切分析，电泳后出现5条带，其中，20 kb 和9 kb 2条带分别是λ2001载体的长、短臂,插入片段得到长约6.5，5和3 kb的3条带(图1a)。经探针杂交后，6.5 kb条带呈杂交阳性(图1b)，回收该片段，将其克隆于pBluescript SK+质粒上, 制成6.5 kb/BamHⅠ亚克隆质粒作进一步验证。
图1 E15-4噬菌体DNA的BamHⅠ酶切和杂交结果
Fig 1 Results of BamHⅠ digestion and
, 百拇医药
hybridization of E15-4 phage DNA
a：Restriction endonuclease (BamHⅠ) mapping of E15-4 phage DNA；M:λDNA/Hind Ⅲ Marker；1: BamHⅠ-digested DNA fragments；b: Southern blotting of BamHⅠ-digested DNA fragments
2.2.2 PCR扩增 用位于p35Nck5a基因起始密码处的正向引物p35f和终止密码处的反向引物p35r, 对E15-4噬菌体和6.5 kb/BamHⅠ亚克隆质粒DNA进行扩增，得到一条0.9 kb的扩增产物，从而证实其中含有完整的p35Nck5a 基因编码区。
2.2.3 序列测定 为排除E15-4噬菌体克隆中小鼠p35Nck5a基因可能出现的重组、突变或缺失现象，用鸟枪法将6.5 kb/BamHⅠ亚克隆的所有PstⅠ酶切片段，再构建成不同的亚克隆质粒; 另将E15-4噬菌体DNA用PstⅠ和KpnⅠ双酶切,回收1.126 kb片段制成亚克隆质粒,使用表1所列引物进行测序，获得了完整的p35Nck5a基因编码区序列(图2)及部分5′及 3′端侧翼序列(因篇幅所限侧翼序列图略)。
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图2 小鼠p35Nck5a基因的核苷酸序列
Fig 2 Nucleotide sequence of the mouse p35Nck5a gene
Uppercase letters indicates the deduced amino acid sequence； *** indicates the stop codon
由图2可见，p35Nck5a基因编码区全长924 bp,编码含307个氨基酸残基的蛋白质。在测定的5′端侧翼序列中，有一段208 bp的内含子序列；其启动子序列富含GC，在+90至-1 020 bp范围内GC含量达到73%，无TAAT盒和CAAT盒，但有几个转录调控因子的结合序列，如Sp1,AP2,MRE和NGFIA。在3′端侧翼序列中具有polyA的信号序列。测定的序列与Ohshima[7]报道的结果基本一致, 仅在-135和-295位各插入一个碱基G。
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2.2.4 限制性内切酶酶切图谱分析 用不同的限制性内切酶对E15-4噬菌体DNA进行单酶切和双酶切鉴定(图3)，并结合测定的部分序列和已知的酶切图谱进行综合分析，获得长约11 kb的小鼠p35Nck5a基因组DNA片段(图4)。
图3 E15-4噬菌体DNA的限制性内切酶酶切电泳图
Fig 3 Restriction mapping of E15-4 phage DNA
, 百拇医药
M1 and M2 present λDNA/HindⅢ and λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker, respectively； 1: Bam HⅠ; 2: EcoRⅠ; 3: PstⅠ; 4: KpnⅠ; 5: HindⅢ; 6: XbaⅠ; 7: BamHⅠ/Pst Ⅰ; 8: Bam HⅠ /KpnⅠ; 9: BamHⅠ/XbaⅠ; 10: BamHⅠ/EcoRⅠ; 11: HindⅢ/KpnⅠ; 12: PstⅠ/KpnⅠ
图4 小鼠p35Nck5a基因组DNA结构图谱
Fig 4 Restriction endonuclease mapping of mouse p35Nck5a genomic DNA
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B: BamHⅠ; K: KpnⅠ; R: EcoRⅠ; Sm: SmaⅠ; P: PstⅠ; N: NotⅠ; Sp: SpeⅠ; Bg: BglⅡ; H: HindⅢ
3 讨 论
通过筛选小鼠基因组DNA噬菌体文库获得用于构建基因打靶载体的DNA片段，是进行基因打靶研究的基础性工作之一。由于Nclk有两个调节亚基即p35Nck5a和p39Nck5ai,它们都参与决定Nclk的激酶活性。根据人的p39Nck5ai cDNA与小鼠的p39Nck5ai和p35Nck5a cDNA序列的同源性分别为98%和60%的特点，我们在筛库过程中，适当降低洗膜的严格性，希望同时获得p39Nck5ai和/或p35Nck5a两个基因，我们选择人p39Nck5ai cDNA作为筛库的探针，经筛选大约2×105个噬菌斑，获得了p35Nck5a基因，表明这种筛选方法是可行的。 在基因重复性打靶研究中，为确保被重复的基因拷贝完全具有功能，应获得足够长的基因组DNA片段，以便包括所有已知的或可能的调控序列。我们得到的p35Nck5a基因组DNA长约11 kb，比Ohshima[7]和Chae[8]等报道的该基因片段更为完整，其5′端包括了一些已知的调控序列，3′端含有polyA的终止信号序列，因此，满足了构建基因重复性打靶载体的要求。
, 百拇医药
文章编号：0258-879X(1999)10-0716-04
参考文献
1 Lee KY, Qi Z, Yu YP,et al. Neuronal cdc2-like kinases: neuron-specific forms of Cdk5[J]. Int J Biochem Cell Biol,1997,29(7):951
2 Roush W. Protein studies try to puzzle out Alzheimer′s tangles[J]. Science, 1995,267(5199):793
3 Valancius V, Smithies O. Double-strand gap repair in a mammalian gene targeting reaction[J]. Mol Cell Biol, 1991, 11(9):4389
, 百拇医药
4 Nehls M, Messerle M, Sirulnik A, et al. Two large insert vectors, PS and KO, facilitate rapid mapping and targeted disruption of mammalian genes[J]. BioTechniques,1994, 17(4):770
5 萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T，主编.金冬雁，黎孟枫，译.《分子克隆》，第2版[M].北京:科学出版社,1995.127～162
6 戴旭明，薛 红，杨 桦，等. MAPPING 重组噬菌体中插入片段的“分/合” 策 略[J]. 生物化学与生物物理进展,1998,25(5):454
7 Ohshima T, Kozak CA, Nagle JW, et al. Molecular cloning and chromosomal mapping of the mouse gene encoding cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit p35[J]. Genomics,1996,35(2):372
8 Chae T,Kwon YT,Bronson R, et al. Mice lacking p35, a neuronal specific activator of cdk5,display cortical lamination defects,seizures and adult lethality[J]. Neuron,1997,18(1):29
(1999-06-28收稿, 1999-08-30修回), 百拇医药
单位：第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海，200433；周常文：兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所，新疆乌鲁木齐市，830000；薛 红：香港科技大学生物化学系
关键词：p35Nck5a基因；克隆；序列分析
摘要 目的摘要 目的： 获取小鼠神经细胞cdc2类激酶(Nclk)调节亚基p35Nck5a基因组DNA，用于构建基因重复性打靶载体。方法： 用噬斑原位杂交法从λPS基因文库中克隆小鼠p35Nck5a基因；用限制性内切酶酶切图谱分析和序列测定进行基因组结构分析。结果： 获得较完整的p35Nck5a基因组DNA酶切图谱；该基因由一个外显子组成，长924 bp，编码307个氨基酸的蛋白质，内含子长208 bp，位于5′端侧翼序列中。测定的序列(-1 080至+924 bp和+3 721至+4 222 bp)与已报道的序列基本一致，仅在-135和-295位各插入一个碱基G。结论： 得到的 p35Nck5a基因组DNA片段长约11 kb, 其5′端侧翼序列含有一些已知的调控序列，3′端含有poly A的信号序列，满足了构建基因重复性打靶载体的要求。
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中图分类号 Q 785 文献标识码：A
Cloning and identification of mouse neuronal cdc2-like kinase regulatory subunit p35Nck5a gene
Zhou Changwen, Dai Xuming, Xue Hong, Fu Jiliang
(Department of Medical Genetics, Department of Basic Medicine,Second Military Medical University, Shanghai，200433)
ABSTRACT Objective: To construct gene targeting vector for duplicating the regulatory subunit p35Nck5a gene of mouse neuronal cdc2-like kinase(Nclk) and study the relationship between increased Nclk activity and hyperphosphorylated protein tau of Alzheimer′s disease(AD). Methods: Bacteriophage plaque in situ hybridization was used for cloning p35Nck5a gene from λPS library . The analysis of p35Nck5a genomic DNA structure was carried out by restriction endonuclease mapping and sequencing. Results: p35Nck5a gene mapping was obtained. The gene consisted of only an exon which was 924 bp in length and encoded a protein which contained 307 amino acids. A 208 bp intron was located in 5′-flanking region. The determined sequence(-1 080 to +924 bp and +3 721 to +4 222 bp) was basically consistent with that reported, except a base G was inserted at -135 site and -295 site, respectively. Conclusion: About 11 kb of genomic DNA fragment is obtained, in which there are some known regulatory elements in 5′-flanking region and the polyadenylation signal in 3′-flanking region. This DNA fragment meets the requirement of constructing gene targeting vector for gene duplication.
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KEY WORDS genes, p35Nck5a; cloning; sequence analysis
神经细胞cdc2类激酶(Nclk)由催化亚基Cdk5和调节亚基p35Nck5a或p39nck5ai组成, Nclk的活性是由调节亚基决定的[1]。p35Nck5a和p39Nck5ai基因的同源性为60%。体外研究发现，Nclk可使微管相关蛋白——tau蛋白的正常和异常位点发生磷酸化。异常过度磷酸化的tau蛋白的存在是Alzheimer病(AD)重要的病理特征之一[2]，因此，Nclk可能与AD的发生密切相关。为了在活体内验证Nclk激酶活性增高与NFTs形成之间的联系，根据“DNA双链缺口修复”的原理[3]，在保持其他遗传背景相同的情况下，通过基因打靶技术制备p35Nck5a基因定点重复的小鼠模型可能是一条最佳途径。本研究报道小鼠Nclk调节亚基p35Nck5a基因的克隆及其结构分析，为下一步研究奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 主要材料 pHP39Nck5ai 质粒和λPS基因组文库[4]由薛红博士提供。pBluescript SK+ 质粒系Stratagene公司产品。C600和DH5α菌株由本室保存。实验中使用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等分别购自Gibco BRL和USB等公司。α-32P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。WizardTM质粒抽提试剂盒购自Promega公司。QIAEX Ⅱ凝胶纯化试剂盒购自QIAGENE公司。Ready-to-go探针标记试剂盒和T7测序试剂盒购自Pharmacia 公司。 ABI PRISMTM 荧光测序试剂盒购自PE公司。根据小鼠p35Nck5a基因序列和Stratagene公司序列资料，用PCGENE软件包自行设计了PCR和测序引物，由上海生工生物工程公司合成。引物序列及其结合位点见表1。
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表1 实验中所用的测序引物
Tab 1 Sequencing primers used in the experiment
Primer name
Nucleotide sequence
Binding site
p35f
5′-ATGGGCACGGTGCTGTCCCTATC-3′
1～23 bp
p35r
5′-TCACCGATCCAGCCCCAGGAGGA-3′
, 百拇医药
924～901 bp
p35-1
5′-GCTAGACTTAAGTGTTCGAGC-3′
4 247～4 268 bp
p35-2
5′-CCAAACTGAGCTTCATGACTC-3′
4 885～4 864 bp
pT3
5′-TCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACA-3′
T3 promoter sequence
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pT7
5′-AATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAAT-3′
T7 promoter sequence
1.2 方法
1.2.1 λPS基因文库的筛选 参照文献[5]介绍的方法进行。以C600为宿主菌，采用人的p39Nck5ai cDNA为探针，共筛选约2×105个噬斑。用杂交阳性单斑制备噬菌体原种，然后，用PEG沉淀法提取噬菌体DNA。
1.2.2 亚克隆的制备 噬菌体和pBluescript SK+质粒DNA的酶切、连接和转化等按常规方法进行；DNA片段的回收和质粒DNA的小量制备按试剂盒说明书进行；用酶切或杂交方法鉴定阳性亚克隆质粒。
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1.2.3 限制性内切酶酶切图谱分析 采用单酶/双酶组合酶切分析法[6]进行。
1.2.4 PCR扩增 依据引物的Tm值不同，采用相应的反应条件，按常规进行。
1.2.5 Southern 印迹杂交 用Pharmacia 公司真空转移仪按说明书进行DNA转移；按Ready-to-go试剂盒说明书进行探针标记；用杂交仪按常规方法进行杂交反应。
1.2.6 序列测定 核素测序按T7测序试剂盒说明书进行；荧光测序按ABI公司测序试剂盒说明书进行。
2 结 果
2.1 λPS基因文库的筛选 根据人p39Nck5ai与小鼠p39Nck5ai和p35Nck5a基因的同源性分别为98%和60%，适当降低洗膜的严格性，通过一次筛选，希望同时获得小鼠p39Nck5ai和p35Nck5a两个基因。pHP39Nck5ai 质粒DNA经EcoRⅠ酶切，得到1.1 kb长的人p39Nck5ai cDNA作为筛库探针，经4轮筛选，共获得7个阳性克隆(E11-1, E11-2，E13-7, E14-1，E15-4，E16-2，E17-5)。参照已知的部分限制性内切酶酶切图谱，对其进行酶切分析，初步判定E15-4克隆中含有Nclk的主要调节亚基p35Nck5a基因。
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2.2 小鼠p35Nck5a基因组DNA的鉴定
2.2.1 Southern印迹杂交 用BamHⅠ对E15-4噬菌体DNA进行酶切分析，电泳后出现5条带，其中，20 kb 和9 kb 2条带分别是λ2001载体的长、短臂,插入片段得到长约6.5，5和3 kb的3条带(图1a)。经探针杂交后，6.5 kb条带呈杂交阳性(图1b)，回收该片段，将其克隆于pBluescript SK+质粒上, 制成6.5 kb/BamHⅠ亚克隆质粒作进一步验证。
图1 E15-4噬菌体DNA的BamHⅠ酶切和杂交结果
Fig 1 Results of BamHⅠ digestion and
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hybridization of E15-4 phage DNA
a：Restriction endonuclease (BamHⅠ) mapping of E15-4 phage DNA；M:λDNA/Hind Ⅲ Marker；1: BamHⅠ-digested DNA fragments；b: Southern blotting of BamHⅠ-digested DNA fragments
2.2.2 PCR扩增 用位于p35Nck5a基因起始密码处的正向引物p35f和终止密码处的反向引物p35r, 对E15-4噬菌体和6.5 kb/BamHⅠ亚克隆质粒DNA进行扩增，得到一条0.9 kb的扩增产物，从而证实其中含有完整的p35Nck5a 基因编码区。
2.2.3 序列测定 为排除E15-4噬菌体克隆中小鼠p35Nck5a基因可能出现的重组、突变或缺失现象，用鸟枪法将6.5 kb/BamHⅠ亚克隆的所有PstⅠ酶切片段，再构建成不同的亚克隆质粒; 另将E15-4噬菌体DNA用PstⅠ和KpnⅠ双酶切,回收1.126 kb片段制成亚克隆质粒,使用表1所列引物进行测序，获得了完整的p35Nck5a基因编码区序列(图2)及部分5′及 3′端侧翼序列(因篇幅所限侧翼序列图略)。
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图2 小鼠p35Nck5a基因的核苷酸序列
Fig 2 Nucleotide sequence of the mouse p35Nck5a gene
Uppercase letters indicates the deduced amino acid sequence； *** indicates the stop codon
由图2可见，p35Nck5a基因编码区全长924 bp,编码含307个氨基酸残基的蛋白质。在测定的5′端侧翼序列中，有一段208 bp的内含子序列；其启动子序列富含GC，在+90至-1 020 bp范围内GC含量达到73%，无TAAT盒和CAAT盒，但有几个转录调控因子的结合序列，如Sp1,AP2,MRE和NGFIA。在3′端侧翼序列中具有polyA的信号序列。测定的序列与Ohshima[7]报道的结果基本一致, 仅在-135和-295位各插入一个碱基G。
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2.2.4 限制性内切酶酶切图谱分析 用不同的限制性内切酶对E15-4噬菌体DNA进行单酶切和双酶切鉴定(图3)，并结合测定的部分序列和已知的酶切图谱进行综合分析，获得长约11 kb的小鼠p35Nck5a基因组DNA片段(图4)。
图3 E15-4噬菌体DNA的限制性内切酶酶切电泳图
Fig 3 Restriction mapping of E15-4 phage DNA
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M1 and M2 present λDNA/HindⅢ and λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker, respectively； 1: Bam HⅠ; 2: EcoRⅠ; 3: PstⅠ; 4: KpnⅠ; 5: HindⅢ; 6: XbaⅠ; 7: BamHⅠ/Pst Ⅰ; 8: Bam HⅠ /KpnⅠ; 9: BamHⅠ/XbaⅠ; 10: BamHⅠ/EcoRⅠ; 11: HindⅢ/KpnⅠ; 12: PstⅠ/KpnⅠ
图4 小鼠p35Nck5a基因组DNA结构图谱
Fig 4 Restriction endonuclease mapping of mouse p35Nck5a genomic DNA
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B: BamHⅠ; K: KpnⅠ; R: EcoRⅠ; Sm: SmaⅠ; P: PstⅠ; N: NotⅠ; Sp: SpeⅠ; Bg: BglⅡ; H: HindⅢ
3 讨 论
通过筛选小鼠基因组DNA噬菌体文库获得用于构建基因打靶载体的DNA片段，是进行基因打靶研究的基础性工作之一。由于Nclk有两个调节亚基即p35Nck5a和p39Nck5ai,它们都参与决定Nclk的激酶活性。根据人的p39Nck5ai cDNA与小鼠的p39Nck5ai和p35Nck5a cDNA序列的同源性分别为98%和60%的特点，我们在筛库过程中，适当降低洗膜的严格性，希望同时获得p39Nck5ai和/或p35Nck5a两个基因，我们选择人p39Nck5ai cDNA作为筛库的探针，经筛选大约2×105个噬菌斑，获得了p35Nck5a基因，表明这种筛选方法是可行的。 在基因重复性打靶研究中，为确保被重复的基因拷贝完全具有功能，应获得足够长的基因组DNA片段，以便包括所有已知的或可能的调控序列。我们得到的p35Nck5a基因组DNA长约11 kb，比Ohshima[7]和Chae[8]等报道的该基因片段更为完整，其5′端包括了一些已知的调控序列，3′端含有polyA的终止信号序列，因此，满足了构建基因重复性打靶载体的要求。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0716-04
参考文献
1 Lee KY, Qi Z, Yu YP,et al. Neuronal cdc2-like kinases: neuron-specific forms of Cdk5[J]. Int J Biochem Cell Biol,1997,29(7):951
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(1999-06-28收稿, 1999-08-30修回), 百拇医药