lacⅠ靶基因突变子的一种正向选择系统的建立
作者：黎怀星 卢 洋 姚真真 傅继梁
单位：第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海，200433
关键词：正向选择；lacⅠ靶基因；突变
第二军医大学学报991002 摘要 目的：建立一种能正向选择lacⅠ靶基因突变子的选择系统。方法：比较了分别携带有lacⅠ-/lacZα型质粒和lacⅠ+/lacZα型质粒的DH10B菌在LB完全培养基、以葡萄糖为碳源的M9基本培养基和以乳糖为碳源的M9/L基本培养基内的生长情况。结果：组成型DH10B菌在M9/L固体培养基中只需培养23 h便可观察到生长，而诱导型DH10B菌则需培养88 h才可观察到生长，但在LB和M9培养基内两者的生长速度却相同；当将少量的组成型DH10B菌与大量的诱导型DH10B菌混合接种于M9/L固体培养基上培养时, M9/L固体培养基能从约2.7×106的lacⅠ+型DH10B菌中将少量的lacⅠ- 型DH10B菌筛选出来。结论：本研究建立了一种在特定时间内只选择生长携带有lacⅠ-/lacZα型质粒的DH10B菌落，从而达到正向选择lacⅠ靶基因突变子的正向选择系统。
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中图分类号 Q 754 文献标识码：A
Development of a selective system for lacⅠ gene mutants
Li Huaixing，Lu Yang，Yao Zhenzhen，Fu Jiliang
(Department of Medical Genetics，Department of Basic Medicine，Second Military Medical University，Shanghai，200433)
ABSTRACT Objective：To develop a selective system for positive selection of lacⅠ mutants. Methods: Investigations on the growth of DH10B cells harboring lacⅠ- or lacⅠ+ genes in LB, M9 and M9/L culture media were carried out in this study. Results: After 23 h of culture DH10B cells harboring lacⅠ- genes could grow and form colonies in the M9/L solid medium, and 88 h culture was essential for the DH10B cells harboring lacⅠ+ gene to grow into colonies in the M9/L solid media. However, no obvious difference was observed on the growth of DH10B cells harboring lacⅠ- genes or lacⅠ+ genes. The results also showed that isolated DH10B cells harboring lacⅠ- genes could be screened from 2.7×106 of DH10B cells with lacⅠ+ genes based on the M9/L solid media. Conclusion：A selective system, based on the M9/L medium and DH10B host cells, for positive selection of lacⅠ mutants is established in our study.
, 百拇医药
KEY WORDS positive selection；genes, lacⅠ；mutation
体内基因突变是一种低频事件，因此突变基因的体外检测方法的有效性和实用性便成了体内突变研究的一个制约因素。在以lacⅠ作为突变靶基因，而以lacZ作为报告基因的突变研究系统中，虽然可以通过常规的蓝白颜色筛选实验来鉴定lacⅠ靶基因的突变，但是这种根据菌落的颜色来筛选靶基因突变的方法是一种非选择性方法，在进行大量分析时要消耗大量的原材料和劳动力[1,2]。
本研究建立了一种在特定时间内只选择性生长携带有lacⅠ-/lacZα型质粒的DH10B菌落，从而达到正向选择lacⅠ靶基因突变子的正向选择系统。当将携带有lacⅠ-/lacZα型质粒和携带有lacⅠ+/lacZα型质粒的DH10B菌混合接种于以乳糖为唯一碳源的基本培养基中培养时，在特定时间内只有lacⅠ-型菌落能利用乳糖而生长，并形成菌落，从而达到正向选择lacⅠ-靶基因突变子的目的。
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1 材料和方法
1.1 宿主菌、质粒及显色剂 DH10B宿主菌，pUC19和pSPORT1质粒以及显色剂X-gal和IPTG均购自Gibco BRL公司。由于pUC19质粒上的lacⅠ基因已被缺失突变，而pSPORT1质粒上的lacⅠ基因则为野生型，因此含有pUC19质粒的DH10B菌能组成性地表达β-半乳糖苷酶(以下称组成型)；而含pSPORT1质粒的DH10B菌则需诱导才能表达β-半乳糖苷酶(以下称诱导型)。
1.2 培养基 M9培养基：按10∶1的比例将适量的盐溶液(取12.8 g Na2HPO4.H2O，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，1.0 g NH4Cl溶于双蒸水至终体积1 000 ml，然后过滤除菌)和20%的葡萄糖溶液(取20 g葡萄糖溶于适量的双蒸水至终体积100 ml，然后过滤除菌)进行混合即可；M9/L培养基：将M9培养基的葡萄糖溶液换成相同浓度的乳糖溶液即可。
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我们设想，当将诱导型和组成型DH10B菌接种在以乳糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时，由于诱导型DH10B菌需要经过一段时间的诱导才能利用乳糖而生长，而组成型DH10B菌则不需要诱导便能利用乳糖而生长。因此，只要掌握细菌在这种培养基上生长的时间差异，就能有效地将少量的lacⅠ-型DH10B菌落从大量的lacⅠ+型DH10B菌中筛选出来。
1.3 感受态细胞的制备、转化和质粒DNA的提取 均按“分子克隆”所述的方法[3]进行。每一批实验所用的感受态细胞均来自同一菌落。
1.4 细菌种子液的制备 由于诱导型和组成型DH10B菌的种子液的制备、在固体或液体培养基中的培养和生长记录所用的方法均相同或相似，为了节省篇幅，以下只介绍通用的实验过程。
挑取相应的单菌落接种于一支盛有2 ml LB培养基(含氨苄青霉素)的试管中，于37℃振荡培养至D(600)＝0.3，然后取500 μl培养液在1.5 ml Eppendorf管内於1×104 r/min离心30 s后弃上清，然后用1×盐溶液(见1.3)稀释至1 ml待用。
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1.5 细菌在固体培养基和液体培养基中的培养、观察和生长记录 分别取100 μl或50 μl实验用的种子液涂布3块相同的平板或3支分别盛有5 ml相同的培养液的试管中(根据实验的要求决定培养基的性质以及是否含X-gal，IPTG和氨苄青霉素)，然后将平板放置于37℃温箱内培养12～168 h，每1 h观察记录1次细菌生长情况(在LB培养基每0.5 h观察1次)，详细记录菌落的出现时间和变蓝的时间；而试管则放置于37℃摇床内按210 r/min的速度振荡培养6～168 h，每0.5 h测定1次培养液的D(600)值，当D(600)值达到0.1时即确定为细菌开始生长，记录下此时的培养时间。然后继续培养并每1 h观察1次菌液的颜色，记录下菌液变蓝的培养时间。
2 结果和讨论
2.1 诱导型和组成型DH10B菌在M9/L培养基中的生长情况 诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中的生长是否具有明显的时间差异是本研究是否成立的关键。为此我们做了几组实验(表1的1～4)，其结果表明，(1)诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中的生长具有明显的时间差异，其中组成型DH10B菌只需培养8～23 h便可观察到生长，而诱导型DH10B菌则需培养74～88 h才可观察到生长；(2)组成型和诱导型DH10B菌在固体培养基中生长比其在液体培养基中生长要慢得多，这主要是因固体培养基中营养成分的渗透能力较差和振荡培养更利于细菌生长的缘故；(3)组成型DH10B菌在M9/L培养基中从见到生长到使培养基中的X-gal分解变蓝所需的时间比诱导型DH10B菌所需的时间要短，其中组成型DH10B菌所需的时间是20～22 h，而诱导型DH10B菌则需38～41 h。有报道认为，大肠杆菌经乳糖诱导所产生的β-半乳糖苷酶的活性只有来源于组成型大肠杆菌所表达的β-半乳糖苷酶活性的10%[4]，本研究认为这可能是导致这种时间差异的主要原因。
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表1 诱导型和组成型DH10B菌在M9/L，LB和M9培养基中的生长情况
Tab 1 The growth of DH10B cells harboring lacⅠ-
or lacⅠ+ genes in M9/L, LB and M9 culture media No.
Plasmid-
bearing
DH10B strain
Culture media
containing
ampicillin
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and X-gal
Agitation
Times of
E. coli
growing/bluing
(t/h)
1
lacⅠ-/DH10B
M9/L plates
-
23/43
2
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lacⅠ-/DH10B
M9/L medium
+
8/30
3
lacⅠ+/DH10B
M9/L plates
-
88/129
4
lacⅠ+/DH10B
M9/L medium
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+
74/112
5
lacⅠ-/DH10B
LB plates
-
8/12
6
lacⅠ-/DH10B
LB medium
+
1.5/5
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7
lacⅠ+/DH10B
LB plates
-
8/no bluinga
8
lacⅠ+/DH10B
LB medium
+
1.5/no bluinga
9
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lacⅠ-/DH10B
M9 plates
-
22/34
10
lacⅠ-/DH10B
M9 medium
+
8/12
11
lacⅠ+/DH10B
M9 plates
, 百拇医药
-
22/no bluinga
12
lacⅠ+/DH10B
M9 medium
+
8/no bluinga
aThe colonies or the liquid media were still colorless after 168 h of culture 接下来需要回答的问题是，诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中培养时，在生长上所观察到的如此巨大的时间差异到底是因为诱导型DH10B菌所需要的诱导时间呢，还是因为这两种细菌本身在生长上就具有的差异所造成的呢？两方面的证据表明，这种时间差异不是由于细菌本身在生长上就具有的差异所造成的，一是每一批实验用于转化lacⅠ-型质粒和lacⅠ+型质粒的感受态细胞均来源于同一DH10B单菌落，在生长上不可能存在着差异；二是诱导型和组成型DH10B菌在LB完全营养培养基中的生长没有时间差异(表1的5～8)，均为1.5 h或8 h，但两者在分解X-gal的能力上却有巨大的差异，组成型DH10B菌在LB平板上或LB培养液中培养12 h或5 h即可以使X-gal分解而使菌落或培养液变蓝，而诱导型DH10B菌在LB培养基中即使培养1周(168 h)也不能分解X-gal而使菌落或培养液变蓝。说明诱导型DH10B菌在没有诱导物的存在时，不能表达β-半乳糖苷酶，因而不能分解培养基中的X-gal。此外在M9培养基内也获得了相似的结果(表1的9～12)，即诱导型和组成型DH10B菌在生长上没有时间差异，均为8 h或22 h，但在分解X-gal的能力上却有巨大的差异。
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为了防止因乳糖质量的原因而导致其对实验结果的影响，本研究观察了诱导型DH10β菌在含有IPTG诱导物的Mq/L培养基中的生长情况。其结果表明(限于篇幅，具体结果省略)，诱导型DH10B菌在含有IPTG诱导物的M9/L培养基内的生长情况与不含IPTG诱导物的M9/L培养基内的生长情况是基本一致的，说明组成型和诱导型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基内生长的时间差异不是由于乳糖的诱导能力低所造成的。
综上所述，本研究认为诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中的生长确实具有明显的时间差异，导致这种时间差异的原因有两个：一是由于诱导型DH10B菌需要经过一段时间的诱导才能表达β-半乳糖苷酶进而利用乳糖而生长，而组成型DH10B菌则不需要诱导便能利用乳糖而生长；二是大肠杆菌经乳糖诱导所产生的β-半乳糖苷酶的活性只有来源于组成型大肠杆菌所表达的β-半乳糖苷酶活性的10%[4]。这种时间差异为突变研究时正向选择lacⅠ靶基因突变子打下了坚实的基础，即在基于lacⅠ靶基因和DH10B宿主菌的突变研究系统中，在经过诱变处理后，将含lacⅠ靶基因的质粒载体从来源于相应的哺乳动物细胞或转基因小鼠组织器官的基因组DNA中回收出来，导入DH10B宿主菌中，最后接种在M9/L平板上培养，87 h内生长出来的菌落应该都是lacⅠ靶基因突变子。但由于诱导型DH10B菌在M9/L液体培养基内培养72 h便也可看到生长，并且72 h以前所有的组成型DH10B菌都已长出菌落，因此本研究将正向筛选lacⅠ靶基因突变子的时间定为72 h，即72 h以前生长出来的菌落为lacⅠ靶基因突变子。
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2.2 M9/L平板对组成型DH10B菌的敏感性 M9/L培养基对组成型DH10B菌的敏感性高低是制约M9/L是否能用作为lacⅠ-型DH10B菌的选择性培养基的一个重要的因素。本研究将浓度相同的诱导型和组成型DH10B菌培养液按一定的比例混合后，取1%～10%的混合液涂布LB平板，以确定菌落总数，其余混合液涂布M9/L平板培养72 h，以筛选出组成型DH10B菌落。结果M9/L平板从1∶100 (lacⅠ-∶lacⅠ+)的混合液中筛选出了507个菌落(总菌落数为51 156)，从1∶1 000(lacⅠ-∶lacⅠ+)和1∶5 000(lacⅠ- ∶lacⅠ+)的混合液中也分别筛选出了540个和560个菌落(其菌落总数分别为549 990和2 750 000)。最后从经M9/L平板筛选出的菌落中随机挑取10个接种于含X-gal的LB平板用于lacⅠ基因功能分析，并抽提其质粒DNA作进一步的酶切分析，结果证实这些菌落均为lacⅠ-型菌落(组成型)。这说明M9/L平板是一种很灵敏的选择性培养基，能从约2.7×106的lacⅠ+型DH10B菌中将少量的lacⅠ-型DH10B菌筛选出来，因而可以有效地用于诱变研究时lacⅠ靶基因突变子的正向选择。该选择系统已经被成功地应用于转基因小鼠体内诱变研究[5]。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0713-03
参考文献
1 Boerrigter ME. High sensitivity for color mutants in lacZ plasmid-based transgenics mice, as detected by positive selection[J]. Environ Mol Mutagen，1998，32(2)：148
2 Provost GS，Kretz PL，Hamner RT，et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis[J]. Mutat Res，1993，228(1)：133
3 Sambrook JE，Fritsch F，Maniatis T. eds. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd, New York：Cold Spring Harbor Press，1989. 121～152
4 Jacob F，Monod J. On the regulation of gene activity[J]. Cold Spring Harbor Symp Quantit Biol，1961,26(2)：193
5 黎怀星，杨 桦，李建秀，等. EMS以D6-2转基因小鼠骨髓组织细胞内lacⅠ靶基因的诱变率和诱变谱[J]. 中国科学(C辑)，1998，28(3)：264
(1999-07-30收稿，1999-09-16修回), 百拇医药
单位：第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室，上海，200433
关键词：正向选择；lacⅠ靶基因；突变
第二军医大学学报991002 摘要 目的：建立一种能正向选择lacⅠ靶基因突变子的选择系统。方法：比较了分别携带有lacⅠ-/lacZα型质粒和lacⅠ+/lacZα型质粒的DH10B菌在LB完全培养基、以葡萄糖为碳源的M9基本培养基和以乳糖为碳源的M9/L基本培养基内的生长情况。结果：组成型DH10B菌在M9/L固体培养基中只需培养23 h便可观察到生长，而诱导型DH10B菌则需培养88 h才可观察到生长，但在LB和M9培养基内两者的生长速度却相同；当将少量的组成型DH10B菌与大量的诱导型DH10B菌混合接种于M9/L固体培养基上培养时, M9/L固体培养基能从约2.7×106的lacⅠ+型DH10B菌中将少量的lacⅠ- 型DH10B菌筛选出来。结论：本研究建立了一种在特定时间内只选择生长携带有lacⅠ-/lacZα型质粒的DH10B菌落，从而达到正向选择lacⅠ靶基因突变子的正向选择系统。
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中图分类号 Q 754 文献标识码：A
Development of a selective system for lacⅠ gene mutants
Li Huaixing，Lu Yang，Yao Zhenzhen，Fu Jiliang
(Department of Medical Genetics，Department of Basic Medicine，Second Military Medical University，Shanghai，200433)
ABSTRACT Objective：To develop a selective system for positive selection of lacⅠ mutants. Methods: Investigations on the growth of DH10B cells harboring lacⅠ- or lacⅠ+ genes in LB, M9 and M9/L culture media were carried out in this study. Results: After 23 h of culture DH10B cells harboring lacⅠ- genes could grow and form colonies in the M9/L solid medium, and 88 h culture was essential for the DH10B cells harboring lacⅠ+ gene to grow into colonies in the M9/L solid media. However, no obvious difference was observed on the growth of DH10B cells harboring lacⅠ- genes or lacⅠ+ genes. The results also showed that isolated DH10B cells harboring lacⅠ- genes could be screened from 2.7×106 of DH10B cells with lacⅠ+ genes based on the M9/L solid media. Conclusion：A selective system, based on the M9/L medium and DH10B host cells, for positive selection of lacⅠ mutants is established in our study.
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KEY WORDS positive selection；genes, lacⅠ；mutation
体内基因突变是一种低频事件，因此突变基因的体外检测方法的有效性和实用性便成了体内突变研究的一个制约因素。在以lacⅠ作为突变靶基因，而以lacZ作为报告基因的突变研究系统中，虽然可以通过常规的蓝白颜色筛选实验来鉴定lacⅠ靶基因的突变，但是这种根据菌落的颜色来筛选靶基因突变的方法是一种非选择性方法，在进行大量分析时要消耗大量的原材料和劳动力[1,2]。
本研究建立了一种在特定时间内只选择性生长携带有lacⅠ-/lacZα型质粒的DH10B菌落，从而达到正向选择lacⅠ靶基因突变子的正向选择系统。当将携带有lacⅠ-/lacZα型质粒和携带有lacⅠ+/lacZα型质粒的DH10B菌混合接种于以乳糖为唯一碳源的基本培养基中培养时，在特定时间内只有lacⅠ-型菌落能利用乳糖而生长，并形成菌落，从而达到正向选择lacⅠ-靶基因突变子的目的。
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1 材料和方法
1.1 宿主菌、质粒及显色剂 DH10B宿主菌，pUC19和pSPORT1质粒以及显色剂X-gal和IPTG均购自Gibco BRL公司。由于pUC19质粒上的lacⅠ基因已被缺失突变，而pSPORT1质粒上的lacⅠ基因则为野生型，因此含有pUC19质粒的DH10B菌能组成性地表达β-半乳糖苷酶(以下称组成型)；而含pSPORT1质粒的DH10B菌则需诱导才能表达β-半乳糖苷酶(以下称诱导型)。
1.2 培养基 M9培养基：按10∶1的比例将适量的盐溶液(取12.8 g Na2HPO4.H2O，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，1.0 g NH4Cl溶于双蒸水至终体积1 000 ml，然后过滤除菌)和20%的葡萄糖溶液(取20 g葡萄糖溶于适量的双蒸水至终体积100 ml，然后过滤除菌)进行混合即可；M9/L培养基：将M9培养基的葡萄糖溶液换成相同浓度的乳糖溶液即可。
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我们设想，当将诱导型和组成型DH10B菌接种在以乳糖作为唯一碳源的基本培养基中培养时，由于诱导型DH10B菌需要经过一段时间的诱导才能利用乳糖而生长，而组成型DH10B菌则不需要诱导便能利用乳糖而生长。因此，只要掌握细菌在这种培养基上生长的时间差异，就能有效地将少量的lacⅠ-型DH10B菌落从大量的lacⅠ+型DH10B菌中筛选出来。
1.3 感受态细胞的制备、转化和质粒DNA的提取 均按“分子克隆”所述的方法[3]进行。每一批实验所用的感受态细胞均来自同一菌落。
1.4 细菌种子液的制备 由于诱导型和组成型DH10B菌的种子液的制备、在固体或液体培养基中的培养和生长记录所用的方法均相同或相似，为了节省篇幅，以下只介绍通用的实验过程。
挑取相应的单菌落接种于一支盛有2 ml LB培养基(含氨苄青霉素)的试管中，于37℃振荡培养至D(600)＝0.3，然后取500 μl培养液在1.5 ml Eppendorf管内於1×104 r/min离心30 s后弃上清，然后用1×盐溶液(见1.3)稀释至1 ml待用。
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1.5 细菌在固体培养基和液体培养基中的培养、观察和生长记录 分别取100 μl或50 μl实验用的种子液涂布3块相同的平板或3支分别盛有5 ml相同的培养液的试管中(根据实验的要求决定培养基的性质以及是否含X-gal，IPTG和氨苄青霉素)，然后将平板放置于37℃温箱内培养12～168 h，每1 h观察记录1次细菌生长情况(在LB培养基每0.5 h观察1次)，详细记录菌落的出现时间和变蓝的时间；而试管则放置于37℃摇床内按210 r/min的速度振荡培养6～168 h，每0.5 h测定1次培养液的D(600)值，当D(600)值达到0.1时即确定为细菌开始生长，记录下此时的培养时间。然后继续培养并每1 h观察1次菌液的颜色，记录下菌液变蓝的培养时间。
2 结果和讨论
2.1 诱导型和组成型DH10B菌在M9/L培养基中的生长情况 诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中的生长是否具有明显的时间差异是本研究是否成立的关键。为此我们做了几组实验(表1的1～4)，其结果表明，(1)诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中的生长具有明显的时间差异，其中组成型DH10B菌只需培养8～23 h便可观察到生长，而诱导型DH10B菌则需培养74～88 h才可观察到生长；(2)组成型和诱导型DH10B菌在固体培养基中生长比其在液体培养基中生长要慢得多，这主要是因固体培养基中营养成分的渗透能力较差和振荡培养更利于细菌生长的缘故；(3)组成型DH10B菌在M9/L培养基中从见到生长到使培养基中的X-gal分解变蓝所需的时间比诱导型DH10B菌所需的时间要短，其中组成型DH10B菌所需的时间是20～22 h，而诱导型DH10B菌则需38～41 h。有报道认为，大肠杆菌经乳糖诱导所产生的β-半乳糖苷酶的活性只有来源于组成型大肠杆菌所表达的β-半乳糖苷酶活性的10%[4]，本研究认为这可能是导致这种时间差异的主要原因。
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表1 诱导型和组成型DH10B菌在M9/L，LB和M9培养基中的生长情况
Tab 1 The growth of DH10B cells harboring lacⅠ-
or lacⅠ+ genes in M9/L, LB and M9 culture media No.
Plasmid-
bearing
DH10B strain
Culture media
containing
ampicillin
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Agitation
Times of
E. coli
growing/bluing
(t/h)
1
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M9/L plates
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lacⅠ-/DH10B
M9/L medium
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M9/L plates
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LB medium
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LB plates
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M9 plates
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M9 medium
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M9 medium
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aThe colonies or the liquid media were still colorless after 168 h of culture 接下来需要回答的问题是，诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中培养时，在生长上所观察到的如此巨大的时间差异到底是因为诱导型DH10B菌所需要的诱导时间呢，还是因为这两种细菌本身在生长上就具有的差异所造成的呢？两方面的证据表明，这种时间差异不是由于细菌本身在生长上就具有的差异所造成的，一是每一批实验用于转化lacⅠ-型质粒和lacⅠ+型质粒的感受态细胞均来源于同一DH10B单菌落，在生长上不可能存在着差异；二是诱导型和组成型DH10B菌在LB完全营养培养基中的生长没有时间差异(表1的5～8)，均为1.5 h或8 h，但两者在分解X-gal的能力上却有巨大的差异，组成型DH10B菌在LB平板上或LB培养液中培养12 h或5 h即可以使X-gal分解而使菌落或培养液变蓝，而诱导型DH10B菌在LB培养基中即使培养1周(168 h)也不能分解X-gal而使菌落或培养液变蓝。说明诱导型DH10B菌在没有诱导物的存在时，不能表达β-半乳糖苷酶，因而不能分解培养基中的X-gal。此外在M9培养基内也获得了相似的结果(表1的9～12)，即诱导型和组成型DH10B菌在生长上没有时间差异，均为8 h或22 h，但在分解X-gal的能力上却有巨大的差异。
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为了防止因乳糖质量的原因而导致其对实验结果的影响，本研究观察了诱导型DH10β菌在含有IPTG诱导物的Mq/L培养基中的生长情况。其结果表明(限于篇幅，具体结果省略)，诱导型DH10B菌在含有IPTG诱导物的M9/L培养基内的生长情况与不含IPTG诱导物的M9/L培养基内的生长情况是基本一致的，说明组成型和诱导型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基内生长的时间差异不是由于乳糖的诱导能力低所造成的。
综上所述，本研究认为诱导型和组成型DH10B菌在以乳糖为唯一碳源的M9/L培养基中的生长确实具有明显的时间差异，导致这种时间差异的原因有两个：一是由于诱导型DH10B菌需要经过一段时间的诱导才能表达β-半乳糖苷酶进而利用乳糖而生长，而组成型DH10B菌则不需要诱导便能利用乳糖而生长；二是大肠杆菌经乳糖诱导所产生的β-半乳糖苷酶的活性只有来源于组成型大肠杆菌所表达的β-半乳糖苷酶活性的10%[4]。这种时间差异为突变研究时正向选择lacⅠ靶基因突变子打下了坚实的基础，即在基于lacⅠ靶基因和DH10B宿主菌的突变研究系统中，在经过诱变处理后，将含lacⅠ靶基因的质粒载体从来源于相应的哺乳动物细胞或转基因小鼠组织器官的基因组DNA中回收出来，导入DH10B宿主菌中，最后接种在M9/L平板上培养，87 h内生长出来的菌落应该都是lacⅠ靶基因突变子。但由于诱导型DH10B菌在M9/L液体培养基内培养72 h便也可看到生长，并且72 h以前所有的组成型DH10B菌都已长出菌落，因此本研究将正向筛选lacⅠ靶基因突变子的时间定为72 h，即72 h以前生长出来的菌落为lacⅠ靶基因突变子。
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2.2 M9/L平板对组成型DH10B菌的敏感性 M9/L培养基对组成型DH10B菌的敏感性高低是制约M9/L是否能用作为lacⅠ-型DH10B菌的选择性培养基的一个重要的因素。本研究将浓度相同的诱导型和组成型DH10B菌培养液按一定的比例混合后，取1%～10%的混合液涂布LB平板，以确定菌落总数，其余混合液涂布M9/L平板培养72 h，以筛选出组成型DH10B菌落。结果M9/L平板从1∶100 (lacⅠ-∶lacⅠ+)的混合液中筛选出了507个菌落(总菌落数为51 156)，从1∶1 000(lacⅠ-∶lacⅠ+)和1∶5 000(lacⅠ- ∶lacⅠ+)的混合液中也分别筛选出了540个和560个菌落(其菌落总数分别为549 990和2 750 000)。最后从经M9/L平板筛选出的菌落中随机挑取10个接种于含X-gal的LB平板用于lacⅠ基因功能分析，并抽提其质粒DNA作进一步的酶切分析，结果证实这些菌落均为lacⅠ-型菌落(组成型)。这说明M9/L平板是一种很灵敏的选择性培养基，能从约2.7×106的lacⅠ+型DH10B菌中将少量的lacⅠ-型DH10B菌筛选出来，因而可以有效地用于诱变研究时lacⅠ靶基因突变子的正向选择。该选择系统已经被成功地应用于转基因小鼠体内诱变研究[5]。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0713-03
参考文献
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2 Provost GS，Kretz PL，Hamner RT，et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis[J]. Mutat Res，1993，228(1)：133
3 Sambrook JE，Fritsch F，Maniatis T. eds. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd, New York：Cold Spring Harbor Press，1989. 121～152
4 Jacob F，Monod J. On the regulation of gene activity[J]. Cold Spring Harbor Symp Quantit Biol，1961,26(2)：193
5 黎怀星，杨 桦，李建秀，等. EMS以D6-2转基因小鼠骨髓组织细胞内lacⅠ靶基因的诱变率和诱变谱[J]. 中国科学(C辑)，1998，28(3)：264
(1999-07-30收稿，1999-09-16修回), 百拇医药