深低温保存对猪二尖瓣蛋白聚糖含量的影响
作者：高光强 任 兵 朱晓东 谢 宁
单位：第二军医大学长征医院胸心外科，上海，200003；任 兵 朱晓东 谢 宁：北京阜外心血管病医院心脏瓣膜研究室
关键词：深低温保存；二尖瓣；蛋白聚糖
第二军医大学学报991039 同种瓣膜基质中的蛋白聚糖对维持瓣膜正常的生理结构起到重要作用。本实验通过测定深低温保存猪二尖瓣组织中蛋白聚糖含量，了解低温保存对蛋白聚糖含量的影响。
1 材料和方法
1.1 蛋白聚糖提取
1.1.1 盐酸胍提取 取深低温保存1个月的猪二尖瓣(本研究室保存，n=9)，解冻后生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取1 g组织，剪成碎末，转移至盛有5 ml 4 mol/L盐酸胍(Sigma公司)提取液的离心管内，盐酸胍提取液中含有蛋白酶抑制剂(0.1 mol/L氨基己酸, 0.01 mol/L EDTA, 0.05 mol/L 乙基顺丁烯二酰亚胺, 0.001 mol/L碘代乙酰胺, 0.001 mol/L苯*****)。4℃摇床上提取30 min， 置4℃冰箱24 h，4℃离心30 min (1×104×g)，取上清得提取液1，待测蛋白聚糖含量。离心后的残渣用盐酸胍经同样方法再提取两次，得提取液2，3。
, http://www.100md.com
1.1.2 胶原酶提取 经3次盐酸胍提取后的残渣，加入10 ml 胶原酶水解液(1 mg胶原酶，10 mmol CaCl2, 50 mmol Tris-HCl, pH 7.6 )，37℃孵育48 h后，4℃离心30 min (6 000×g)，取上清液得提取液4。
1.1.3 碱处理分解糖胺聚糖 上述4份上清液各加200 mmol KOH 和400 mmol四硼酸钠，补充体积至30 ml，45℃水浴放置12 h。用4 mol/L乙酸调至pH 5.0，纯水4℃透析24 h。
1.2 蛋白聚糖含量测定
1.2.1 制作标准物葡萄糖醛酸内酯标准曲线 配制葡萄糖醛酸内酯溶液50 μg (200 μl)。取100 μl依次对半稀释成每200 μl含25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78 μg。各加入含 25 mmol四硼酸钠和3 mmol咔唑的浓硫酸 3 ml，100℃煮沸 5 min，冷却后在分光光度计上 (530 nm)测定光密度(D)值。以标准品含量为横坐标，D值为纵坐标，绘制标准曲线。
, 百拇医药
1.2.2 样品蛋白聚糖含量测定 取每份样品的4种提取液各200 μl，水200 μl为空白管，以同样方法测定样品的D值，根据标准曲线查出样品的蛋白聚糖含量。同样方法测定9份新鲜瓣膜蛋白聚糖含量。采用SPSS软件对实验数据进行t检验。
2 结 果
表1所示为新鲜和低温保存瓣膜经第1次盐酸胍提取的蛋白聚糖含量。以测定的糖醛酸量表示分别为 622.2和270.1 μg/g，两者相比有显著性差异(P<0.01)，经第2，3次提取的量与总量相比甚少。经胶原酶消化后，又提取更多的蛋白聚糖，分别为280 和55.5 μg/g，两者相比差异显著(P<0.01)。
表1 新鲜与深低温保存猪二尖瓣内蛋白聚糖含量比较 (n=9,
, mB/μg.g-1) 保存方式
, 百拇医药
提取1
提取2
提取3
提取4
总量
新鲜
622.2±
46.4±
27.4±
280±
976±
38.9
19.9
, 百拇医药
12.0
26.3
68.2
深低温
270.1±
40.8±
14.2±
55.5±
380.6±
36.4**
19.2
12.5*
, http://www.100md.com
39.6**
41.8**
*P<0.05, **P<0.01 与新鲜瓣膜比较
3 讨 论
蛋白聚糖分子量大，亲水性强，是保持结缔组织水分的重要成分。蛋白聚糖在结缔组织基质中填充在胶原纤维之间或周围，借助某些次级键依附于胶原纤维之间，在生理状态下对维持结缔组织的完整性，使其保持组织特有的机械性能，起到不可缺少的作用。蛋白聚糖与骨盐结晶生成有关。连接在核心蛋白上硫酸软骨素分子带有丰富的硫酸基团，能与基质中的Ca2+结合，同时蛋白聚糖有很强的亲水性，占有一定空间，使结合在其中的Ca2+与磷酸根处于稳定的胶体状态，不致析出沉淀。
本实验采用盐酸胍提取低温保存猪二尖瓣瓣叶组织中的蛋白聚糖，发现深低温保存1个月瓣膜的蛋白聚糖较新鲜瓣膜含量显著减少；与胶原纤维结合的蛋白聚糖，深低温保存组也低于新鲜瓣膜组。推测同种瓣膜替换术后引起的瓣膜钙化可能与深低温保存的同种瓣膜基质中的蛋白聚糖含量的减少有关。
中图分类号 R 654.2 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(1999)10-0722-01
(1999-03-17收稿，1999-08-16修回), http://www.100md.com
单位：第二军医大学长征医院胸心外科，上海，200003；任 兵 朱晓东 谢 宁：北京阜外心血管病医院心脏瓣膜研究室
关键词：深低温保存；二尖瓣；蛋白聚糖
第二军医大学学报991039 同种瓣膜基质中的蛋白聚糖对维持瓣膜正常的生理结构起到重要作用。本实验通过测定深低温保存猪二尖瓣组织中蛋白聚糖含量，了解低温保存对蛋白聚糖含量的影响。
1 材料和方法
1.1 蛋白聚糖提取
1.1.1 盐酸胍提取 取深低温保存1个月的猪二尖瓣(本研究室保存，n=9)，解冻后生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取1 g组织，剪成碎末，转移至盛有5 ml 4 mol/L盐酸胍(Sigma公司)提取液的离心管内，盐酸胍提取液中含有蛋白酶抑制剂(0.1 mol/L氨基己酸, 0.01 mol/L EDTA, 0.05 mol/L 乙基顺丁烯二酰亚胺, 0.001 mol/L碘代乙酰胺, 0.001 mol/L苯*****)。4℃摇床上提取30 min， 置4℃冰箱24 h，4℃离心30 min (1×104×g)，取上清得提取液1，待测蛋白聚糖含量。离心后的残渣用盐酸胍经同样方法再提取两次，得提取液2，3。
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1.1.2 胶原酶提取 经3次盐酸胍提取后的残渣，加入10 ml 胶原酶水解液(1 mg胶原酶，10 mmol CaCl2, 50 mmol Tris-HCl, pH 7.6 )，37℃孵育48 h后，4℃离心30 min (6 000×g)，取上清液得提取液4。
1.1.3 碱处理分解糖胺聚糖 上述4份上清液各加200 mmol KOH 和400 mmol四硼酸钠，补充体积至30 ml，45℃水浴放置12 h。用4 mol/L乙酸调至pH 5.0，纯水4℃透析24 h。
1.2 蛋白聚糖含量测定
1.2.1 制作标准物葡萄糖醛酸内酯标准曲线 配制葡萄糖醛酸内酯溶液50 μg (200 μl)。取100 μl依次对半稀释成每200 μl含25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78 μg。各加入含 25 mmol四硼酸钠和3 mmol咔唑的浓硫酸 3 ml，100℃煮沸 5 min，冷却后在分光光度计上 (530 nm)测定光密度(D)值。以标准品含量为横坐标，D值为纵坐标，绘制标准曲线。
, 百拇医药
1.2.2 样品蛋白聚糖含量测定 取每份样品的4种提取液各200 μl，水200 μl为空白管，以同样方法测定样品的D值，根据标准曲线查出样品的蛋白聚糖含量。同样方法测定9份新鲜瓣膜蛋白聚糖含量。采用SPSS软件对实验数据进行t检验。
2 结 果
表1所示为新鲜和低温保存瓣膜经第1次盐酸胍提取的蛋白聚糖含量。以测定的糖醛酸量表示分别为 622.2和270.1 μg/g，两者相比有显著性差异(P<0.01)，经第2，3次提取的量与总量相比甚少。经胶原酶消化后，又提取更多的蛋白聚糖，分别为280 和55.5 μg/g，两者相比差异显著(P<0.01)。
表1 新鲜与深低温保存猪二尖瓣内蛋白聚糖含量比较 (n=9,
, mB/μg.g-1) 保存方式, 百拇医药
提取1
提取2
提取3
提取4
总量
新鲜
622.2±
46.4±
27.4±
280±
976±
38.9
19.9
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12.0
26.3
68.2
深低温
270.1±
40.8±
14.2±
55.5±
380.6±
36.4**
19.2
12.5*
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39.6**
41.8**
*P<0.05, **P<0.01 与新鲜瓣膜比较
3 讨 论
蛋白聚糖分子量大，亲水性强，是保持结缔组织水分的重要成分。蛋白聚糖在结缔组织基质中填充在胶原纤维之间或周围，借助某些次级键依附于胶原纤维之间，在生理状态下对维持结缔组织的完整性，使其保持组织特有的机械性能，起到不可缺少的作用。蛋白聚糖与骨盐结晶生成有关。连接在核心蛋白上硫酸软骨素分子带有丰富的硫酸基团，能与基质中的Ca2+结合，同时蛋白聚糖有很强的亲水性，占有一定空间，使结合在其中的Ca2+与磷酸根处于稳定的胶体状态，不致析出沉淀。
本实验采用盐酸胍提取低温保存猪二尖瓣瓣叶组织中的蛋白聚糖，发现深低温保存1个月瓣膜的蛋白聚糖较新鲜瓣膜含量显著减少；与胶原纤维结合的蛋白聚糖，深低温保存组也低于新鲜瓣膜组。推测同种瓣膜替换术后引起的瓣膜钙化可能与深低温保存的同种瓣膜基质中的蛋白聚糖含量的减少有关。
中图分类号 R 654.2 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(1999)10-0722-01
(1999-03-17收稿，1999-08-16修回), http://www.100md.com