定量RT-PCR法检测脯氨酰4-羟化酶mRNA的表达
作者：李 舰 李 石 傅卫军 杨秀疆 沈健伟
单位：第二军医大学长征医院神经外科，上海，200433
关键词：脯氨酰4-羟化酶；表达
第二军医大学学报991036
脯氨酰4-羟化酶(P4H)是胶原合成过程中的关键酶，在肝纤维化时肝组织中P4H的表达明显升高，抑制P4H活性对于纤维化病变具有很大的治疗价值[1，2]。若通过抑制P4H基因的表达来达到抑制P4H活性、减少胶原合成，有可能成为抗纤维化治疗的一种有效途径。为了检测靶细胞或靶组织中P4H的两种亚基的基因表达水平及观察某些药物对其表达的影响，我们建立了检测P4H mRNA的定量RT-PCR方法。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料 AMV逆转录酶(AMV-RT)为Promega产品；Taq酶、dNTP,OligdT(15),RNasin及相应的缓冲液均购自华美公司。
1.2 细胞培养 取人皮肤活检标本作原代培养，置含10%小牛血清的DMEM(Gibco产品)中，传代5～10代。
1.3 引物 根据P4Hα,β亚基cDNA序列分别设计一对引物。P4Hα：上游引物为5′-GAGTGAGTTGGAGAATCTGGTCC-3′，下游引物为5′-CAATTGTTAGGTATCCTGGAGACG-3′，其扩增产物为198 bp。P4Hβ：上游引物为5′-TCTGACTATGACGGCAAACTGAGC-3′，下游引物为5′-CCGATTCGGGCTTGTACTTGG-3′，其扩增产物为148 bp。内参照引物，即β2-微球蛋白(β2-MG):上游为5′-CACCCCCACTGAAAAAGATG-3′，下游为5′-CTTCAAACCTCCATGATGCT-3′，扩增产物为104 bp。
, 百拇医药
1.4 总RNA抽提 采用Trizol抽提试剂盒(Gibco产品)，按产品说明书进行。对抽提所得总RNA用甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，紫外分光光度法测RNA含量和纯度。
1.5 总RNA逆转录 取细胞总RNA 0.5 μg作为模板，20 μl反应体系中含5×缓冲液4 μl，AMV-RT 15 μl，RNasin 20 U，OligdT(15)0.5 μg，1.0 mmol/L dNTP。反应条件：42℃ 60 min。于PCR仪(Biometra公司Uno-Thermous)中进行。
1.6 PCR 反应体系为25 μl， 含10×缓冲液2.5 μl， 10 mmol/L dNTP 0.5 μl， 20 μmol/L引物(P4Hα,P4Hβ,β2-MG)各1.2 μl。取cDNA产物2 μl作模板，阴性对照用未行逆转录的RNA作模板，空白对照用经DEPC处理的水作模板。 反应条件：95℃变性3 min，94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，最后一个循环延至7 min。
, 百拇医药
1.7 PCR产物分析 取10 μl PCR产物，DNA marker 4 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外分析仪(四星生物技术公司产品)上扫描记录，作条带密度扫描，取其积分值作为量化指标，以P4Hα或P4Hβ分别与β2-MG的比值来表示不同样本间的相对量。
2 结 果
2.1 扩增循环数对PCR产物的影响 取相当于100 ng人皮肤成纤维细胞的总RNA的逆转录产物，于25 μl PCR扩增体系中进行不同循环数(18～35)扩增。当20～35个循环时，P4Hα扩增产物与循环数之间有良好的线性关系；当20～30个循环时，P4Hβ扩增产物与循环数之间有良好的线性关系。重复3次，所得结果一致。故在RT-PCR时选用22～24个循环。结果如图1所示。
图1 P4Hβ和β2-MG的扩增产物与循环次数的关系
, 百拇医药
M：标志物；1～7：分别为20，22，24，26，28，30，32个循环
2.2 模板量与PCR产物的关系 取50～200 ng人皮肤成纤维细胞总RNA的反转录产物于25 μl体系中进行22个循环。在所用模板量的范围内，模板的投入量与PCR产量之间有良好的线性关系，重复3次结果近似。
3 讨 论
P4H是前胶原合成过程中的关键酶，它是由α和β两种亚基构成的四聚体。α亚基与β亚基的功能有所不同，两者结合后具有P4H的催化活性。准确地了解P4H基因表达情况，对于纤维化疾病的诊断与治疗均有重要价值。检测mRNA表达水平的主要手段有分子杂交和PCR扩增。前者灵敏度低，作者曾以地高辛标记的RNA探针检测4×106个人皮肤成纤维细胞中的RNA，仅得到微弱信号(未发表资料)；后者则缺乏定量的概念。本实验采用定量RT-PCR技术[3]，所建立的检测方法可在1 000个人皮肤成纤维细胞中的总RNA中检测P4H mRNA的表达，并可相对定量。β2-MG是MHCI类抗原，在所有组织中的表达恒定，本实验选用β2-MG作为内对照，可监控操作过程的质量，又可免除因组织种类不同造成的在解释结果时的困难。通过计算机辅助设计P4H的引物，使其PCR产物的长度接近于内参照扩增产物的长度，有利于电泳分析结果的准确性。选用适当的循环数可保证用PCR指数增长期的P4H/β2-MG表示P4H表达水平的相对高低。本方法的建立为开展P4H基因调控的研究提供了一种有效的手段。
, 百拇医药
中图分类号 Q 786 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(1999)10-0810-02
参考文献
1 Pihlajaniemi T, Myllyla R, Kivirkko KL, et al. Prolyl 4-hydroxylase and its role in collagen synthesis[J]. J Hepatol,1991,13(Suppl 3):S2
2 Kivirikko KI, Helaakoski T, Tasanen K, et al. Molecular biology of prolyl 4-hydroxylase[J]. Ann NY Acad Sci, 1990,580:132
3 Foley KP, Leonard MW, Engel JD, et al. Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction[J]. Trends Genet, 1993,9(11):380
(1999-03-19收稿，1999-08-11修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院神经外科，上海，200433
关键词：脯氨酰4-羟化酶；表达
第二军医大学学报991036
脯氨酰4-羟化酶(P4H)是胶原合成过程中的关键酶，在肝纤维化时肝组织中P4H的表达明显升高，抑制P4H活性对于纤维化病变具有很大的治疗价值[1，2]。若通过抑制P4H基因的表达来达到抑制P4H活性、减少胶原合成，有可能成为抗纤维化治疗的一种有效途径。为了检测靶细胞或靶组织中P4H的两种亚基的基因表达水平及观察某些药物对其表达的影响，我们建立了检测P4H mRNA的定量RT-PCR方法。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料 AMV逆转录酶(AMV-RT)为Promega产品；Taq酶、dNTP,OligdT(15),RNasin及相应的缓冲液均购自华美公司。
1.2 细胞培养 取人皮肤活检标本作原代培养，置含10%小牛血清的DMEM(Gibco产品)中，传代5～10代。
1.3 引物 根据P4Hα,β亚基cDNA序列分别设计一对引物。P4Hα：上游引物为5′-GAGTGAGTTGGAGAATCTGGTCC-3′，下游引物为5′-CAATTGTTAGGTATCCTGGAGACG-3′，其扩增产物为198 bp。P4Hβ：上游引物为5′-TCTGACTATGACGGCAAACTGAGC-3′，下游引物为5′-CCGATTCGGGCTTGTACTTGG-3′，其扩增产物为148 bp。内参照引物，即β2-微球蛋白(β2-MG):上游为5′-CACCCCCACTGAAAAAGATG-3′，下游为5′-CTTCAAACCTCCATGATGCT-3′，扩增产物为104 bp。
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1.4 总RNA抽提 采用Trizol抽提试剂盒(Gibco产品)，按产品说明书进行。对抽提所得总RNA用甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，紫外分光光度法测RNA含量和纯度。
1.5 总RNA逆转录 取细胞总RNA 0.5 μg作为模板，20 μl反应体系中含5×缓冲液4 μl，AMV-RT 15 μl，RNasin 20 U，OligdT(15)0.5 μg，1.0 mmol/L dNTP。反应条件：42℃ 60 min。于PCR仪(Biometra公司Uno-Thermous)中进行。
1.6 PCR 反应体系为25 μl， 含10×缓冲液2.5 μl， 10 mmol/L dNTP 0.5 μl， 20 μmol/L引物(P4Hα,P4Hβ,β2-MG)各1.2 μl。取cDNA产物2 μl作模板，阴性对照用未行逆转录的RNA作模板，空白对照用经DEPC处理的水作模板。 反应条件：95℃变性3 min，94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，最后一个循环延至7 min。
, 百拇医药
1.7 PCR产物分析 取10 μl PCR产物，DNA marker 4 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外分析仪(四星生物技术公司产品)上扫描记录，作条带密度扫描，取其积分值作为量化指标，以P4Hα或P4Hβ分别与β2-MG的比值来表示不同样本间的相对量。
2 结 果
2.1 扩增循环数对PCR产物的影响 取相当于100 ng人皮肤成纤维细胞的总RNA的逆转录产物，于25 μl PCR扩增体系中进行不同循环数(18～35)扩增。当20～35个循环时，P4Hα扩增产物与循环数之间有良好的线性关系；当20～30个循环时，P4Hβ扩增产物与循环数之间有良好的线性关系。重复3次，所得结果一致。故在RT-PCR时选用22～24个循环。结果如图1所示。
图1 P4Hβ和β2-MG的扩增产物与循环次数的关系
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M：标志物；1～7：分别为20，22，24，26，28，30，32个循环
2.2 模板量与PCR产物的关系 取50～200 ng人皮肤成纤维细胞总RNA的反转录产物于25 μl体系中进行22个循环。在所用模板量的范围内，模板的投入量与PCR产量之间有良好的线性关系，重复3次结果近似。
3 讨 论
P4H是前胶原合成过程中的关键酶，它是由α和β两种亚基构成的四聚体。α亚基与β亚基的功能有所不同，两者结合后具有P4H的催化活性。准确地了解P4H基因表达情况，对于纤维化疾病的诊断与治疗均有重要价值。检测mRNA表达水平的主要手段有分子杂交和PCR扩增。前者灵敏度低，作者曾以地高辛标记的RNA探针检测4×106个人皮肤成纤维细胞中的RNA，仅得到微弱信号(未发表资料)；后者则缺乏定量的概念。本实验采用定量RT-PCR技术[3]，所建立的检测方法可在1 000个人皮肤成纤维细胞中的总RNA中检测P4H mRNA的表达，并可相对定量。β2-MG是MHCI类抗原，在所有组织中的表达恒定，本实验选用β2-MG作为内对照，可监控操作过程的质量，又可免除因组织种类不同造成的在解释结果时的困难。通过计算机辅助设计P4H的引物，使其PCR产物的长度接近于内参照扩增产物的长度，有利于电泳分析结果的准确性。选用适当的循环数可保证用PCR指数增长期的P4H/β2-MG表示P4H表达水平的相对高低。本方法的建立为开展P4H基因调控的研究提供了一种有效的手段。
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中图分类号 Q 786 文献标识码：B
文章编号：0258-879X(1999)10-0810-02
参考文献
1 Pihlajaniemi T, Myllyla R, Kivirkko KL, et al. Prolyl 4-hydroxylase and its role in collagen synthesis[J]. J Hepatol,1991,13(Suppl 3):S2
2 Kivirikko KI, Helaakoski T, Tasanen K, et al. Molecular biology of prolyl 4-hydroxylase[J]. Ann NY Acad Sci, 1990,580:132
3 Foley KP, Leonard MW, Engel JD, et al. Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction[J]. Trends Genet, 1993,9(11):380
(1999-03-19收稿，1999-08-11修回), 百拇医药