高血压患者及大鼠线粒体ATPase 6基因的克隆、表达与突变研究
作者：周林 万大方 张国元 李宏年 张萍萍 赵新泰 顾健人 Liew C C
单位：万大方 李宏年 张萍萍 赵新泰 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 上海，200032)；张国元(第二军医大学长征医院心血管内科 上海，200003)；周林(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第四研究室) 重庆，400042；Liew C C(Laboratory for molecular cardiology,University of Toronto, Ontario,M5G 1L5,Canada)
关键词：高血压；线粒体；ATPase；6基因
第三军医大学学报991010
提 要 目的：研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因。方法：用差别杂交法(Differential hybridization)筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠(SHR)心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR-SSCP和测序，进行基因突变分析。结果：SHR鼠心肌线粒体ATPase 6基因构象改变，8701位碱基由G→A(G8701A)，编码的第59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；A8708G，编码的第61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸。高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase 6基因8584位碱基突变(G8584A)，编码的第20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸，这一变化与SHR线粒体ATPase 6基因改变相一致。结论：高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase 6基因G8584A突变很可能在高血压病心肌肥厚的发生、发展中具有意义，并可能是高血压病的特异性改变。
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中图法分类号 R544.1;Q785 文献标识码：A
Cloning, expression and mutation of mitochondrial ATPase gene of hypertensive patients and rats
Zhou Lin, Wan Dafang, Zhang Guoyuan, Li Hongnian, Zhang Pingping, Zhao Xintai, Gu Jianren, Liew C C (Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400042)
Abstract Objective： To study the different expression of mitochondrial ATPase gene in normotensive and hypertensive human beings and rats. Methods: Partial cDNA clones were screened from human heart cDNA library with differential hybridization. Several mitochondrial genes were highly expressed in the DNA of the cardiac muscle of rats with spontaneous hypertension (SHRs) and in that of peripheral blood leukocytes of patients with hypertension. PCR-SSCP and sequencing were used to study the mutation of the genes. Results: There was polymorphism of mitochondrial ATPase 6 gene in the myocardium of SHR. The base of 8701 changed from G to A (G8701A) and the coden of 59 changed from alanine to threonine and the base of 8708 from A to G and the coden of 61 from histidine to arginine. The mitochondrial ATPase 6 gene in the leucocytes of hepertensive patients underwent similar mutations of G8584A and from alanine to threonine in coden 20. Conclusion: The mutation of G8584A in hypertensive patients is a specific change in hypertension and!may be responsible for the initiation and development of myocardial hypertrophy.
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Key words hypertension; mitochondrium; ATPase 6 gene; cloning; mutation
目前认为高血压病是一种多基因病。寻找与高血压病相关的基因，对研究其发病机制和指导防治都有重要意义。本文以自发性高血压大鼠为材料，采用差别杂交法筛选正常人心脏文库中cDNA部分克隆，研究高血压鼠的表达差异基因，并分析其结构，结合观察临床高血压患者外周血白细胞的变化，探讨其与高血压病发生、发展的可能关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织和标本来源 成年(3～4月龄)自发性高血压鼠(Spontaneous hypertension rats,SHR)，收缩压为28.6～33.3 kPa，平均(30.6±3.3)kPa和成年正常血压对照鼠(Wistar kyoto rats,WKY)均购自上海市高血压研究所，体重180～200 g。取心脏和其它脏器，-70°C保存备用。
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取18例人外周血白细胞为检测标本。正常人6例，为健康查体者，年龄35～60岁；高血压病与冠心病心肌梗塞住院病人各6例。均为汉族，籍贯上海、江苏和浙江。高血压病男4例，女2例，48～65岁，最高血压22～29/14.7～17.3 kPa，其中3例有明确高血压家族史。临床ECG、X线片和UCG检查示左室肥厚及左室重量指数超过正常(140～153 g/m2)4例，冠状动脉造影冠脉正常。冠心病心肌梗塞6例，均为男性，62～84岁，血压13.9～20.5/8～11.7 kPa，无高血压病史，检查无心肌肥厚，冠状动脉造影发现有1支或多支冠脉狭窄病变。
1.1.2 正常人心脏文库cDNA克隆 206个克隆由Dr.Liew C C馈赠，分别由λgtll和Zap Express载体构建。
1.1.3 主要化学试剂及生物试剂 均为进口、国产分析纯试剂和试剂盒。DNA分析软件系统为HIBIO DNASISTEM，碱基序列查询为Internet网络美国NIH GenBank数据库最新信息。
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1.2 方法
1.2.1差别杂交法筛选正常人心脏cDA克隆 用PCR扩增cDNA克隆的phage DNA片段，λgtll载体的引物是：
正向链5′-ATTGGTGGGACGACTCCTTGGA-3′，反向链5′-TTGACACCAGACCAACTGGTA-3′。
Zap ExpressTM载体引物为通用引物T3和T7。反应条件为94°C变性4 min，进入循环，94°C 36 s，55°C 1 min，72°C 1.5 min共35个循环。最后72°C继续延伸10 min。接着分别取PCR产物经1%琼脂糖电泳分离后作Southern吸印。
1.2.2 RNA的抽提，cDNA探针的制备与标记及Southern杂交 采用Siebert等[1]的一步法加以改进，分别提取WKY、SHR心肌RNA。用紫外分光光度计定量，并作RNA电泳检测后，加oligo[dT]12～18，随机引物，α-32P-[dCTP]和RT(AMV逆转录酶)，制备并标记cDNA探针，比放射线活性在1.0×108 dpm/μg DNA以上。分别与心脏cDNA克隆的PCR产物作Southern Blot，确认阳性信号，并经比较找出差异克隆。
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1.2.3 差异克隆的Northern Blot进一步鉴定 将Sou-thern Blot杂交中有差异的克隆分别用PCR扩增后，进行放射性探针同位素标记，并以此为探针，与WKY和SHR心肌RNA作Northern Blot。取同一张RNA膜片，去净探针后，用β-actin杂交对照。
1.2.4 噬菌体DNA的提取、亚克隆及序列测定 液体培养法扩增差异克隆噬菌体并用超速离心法提取噬菌体DNA，用SalⅠ和NotⅠ内切酶消化并回收片段，重组pBK-CMV质粒，转化XL1-Blue感受态细胞，用X-gal、IPTG诱导，37°C培养。取白色克隆抽提质粒DNA，经酶切分析和Southern鉴定。纯化质粒DNA按照USB Sequenase Version 2.0 DNA序列测定试剂盒推荐的操作程序进行DNA序列测定。将碱基序列输入微机DNA分析软件系统进行分析处理，通过网络与GenBank查询。
1.2.5 PCR-SSCP(Single strand conformation polymor-phism)[2]及测序进行基因突变分析 提取WKY和SHR心肌组织及高血压病患者和正常人的白细胞DNA，从克隆出的有表达差异的ATPase 6基因中设计一对引物，正向链5′端加BamHⅠ切点5′-GGGATCCATGAACGAAAATCTGTTCGC-T-3′。反向链中包含PstⅠ切点，5′-GGTGGCCTGCAG-TAATGTTAGCGG-3′。用同位素法进行PCR-SSCP，并用此PCR产物直接测序。
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2 结果
2.1 差别杂交法克隆在SHR心肌中表达差异的基因
2.1.1 PCR扩增正常人心脏cDNA克隆的片段 以1%琼脂凝胶电泳检测大小在0.5～4.3 kb之间，均为单一条带。每份样品进行2次电泳和转膜，分别与WKY和SHR心肌RNA反转录成的cDNA第一链探针池作Southern杂交。对应的PCR产物杂交结果的两两比较，发现3、6号克隆在SHR中强于WKY，见图1。
图1 WKY(A)与SHR(B) cDNA探针和phage克隆PCR产物的Southern Blot结果
Fig 1 Southern Blot of PCR products with cDNA probes of WKY(A) and SHR(B)
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2.1.2 WKY和SHR心肌组织的Northern Blot 对Southern Blot筛选有差异的克隆进行PCR扩增，并分别标记同位素，对WKY和SHR心肌RNA进行Northern Blot，经β-actin对照，挑选表达差异的探针，此探针所对应的基因即为高血压病相关基因，见图2，它们均在高血压心肌mRNA中高表达。
图2 以phage cDNA克隆为探针与WKY和SHR mRNA的Northern Blot结果 SHR(H) mRNA表达明显强于WKY(N)
Fig 2 Northern Blot of phage cDNA probes with WKY and SHR mRNA The lines are obvious in SHR(H) than in WKY(N)
, http://www.100md.com 2.1.3 Phage DNA的抽提、亚克隆及序列测定结果 将Northern Blot中有表达差异的克隆，分别提取phage DNA，经酶切分离纯化释放片段，与pBK-CMV质粒酶切后的片段做连接，转化，重组质粒进行扩增后，进行测序，从而确定基因的碱基序列，经计算机GenBank查询，发现其中一个基因与线粒体ATPase 6基因同源性在98%，确定为线粒体基因，其在线粒体基因中的碱基位置为8483～9288。一个为细胞色素C氧化酶1基因，碱基位置为5210～7461。
由于ATPase 6基因和细胞色素C氧化酶1基因分别参与线粒体的能量代谢和氧化磷酸化过程，与心肌代谢的能量供应直接有关，其基因构成的改变，可能是高血压心肌中的高表达的原因，因此对二者进行PCR-SSCP突变分析。
2.2 PCR-SSCP及测序发现突变基因
2.2.1 细胞色素C氧化酶1和ATPase 6基因单链构象多态性分析 分别用细胞色素C氧化酶1基因的2对引物，对WKY和SHR进行DNA单链构象多态性分析，条带无差异，初步表明无基因突变。而用ATP合成酶6的引物进行PCR-SSCP分析时，每组均有明显差异，提示可能存在突变基因，引起构象改变。
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2.2.2 WKY和SHR线粒体ATPase 6基因序列 用心肌DNA的PCR产物直接测序，发现ATPase 6基因8701位碱基G(WKY)→A(SHR)；编码的59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；8708位碱基A(WKY)→G(SHR)，编码的61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸，见图3，表1。
图3 线粒体ATPase 6基因突变的部分序列
Fig 3 Part of the sequence of mutated mitochondria
ATPase 6 gene
表1 SHR线粒体ATPase 6基因突变和编码氨基酸改变
Tab 1 Mutation of ATPase 6 gene and change of codon in mitochondria of SHR rats(n=8)
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Base site
Codon site
8701
8708
59
61
WKY
G
A
Ala
His
SHR
A
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G
Thr
Arg
2.2.3 SHR不同组织的ATPase 6基因序列 对SHR肝、脾组织线粒体ATPase 6基因进行PCR序列测定，结果发现8701位碱基G(WKY)→A(SHR)，编码氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸。而8708位无变化，仍为A，与正常相同。
2.3 正常人和病人ATPase 6基因的PCR-SSCP分析和序列分析
12例患者中4例高血压病和1例冠心病心肌梗塞患者，SSCP与正常人有明显差异。通过人ATPase 6基因PCR产物直接序列分析发现，正常人8584位碱基均为G，与文献[3]发表的序列一致。4例高血压病人突变成A，即G584A，编码的20位氨基酸亦由丙氨酸变成苏氨酸。冠心病心肌梗塞患者8584位碱基无变化，1例8575位碱基由C变成T，但编码的氨基酸仍为亮氨酸，为同义突变，见表2。其余病例均无突变发生。表2 高血压患者线粒体ATPase 6
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基因突变和编码氨基酸改变
Tab 2 Mutation of ATPase 6 gene and change of codon
in mitochondria of hypertensive patients Cases
Base site
Codon site
8584
20
Normal(n=6)
G
Ala
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Hypertension(n=4)
A
Thr
3 讨论
3.1 ATPase 6基因高表达与高血压病的关系
过去的10年人们已证实引起高血压有2类型基因。一类是编码酶、激素或底物的基因；另一类是涉及高血压的遗传病基因[4]。近年来又发现几种与高血压相关的新基因，如在肾近曲小管上的SA基因[5]，在血管平滑肌上的Gax基因[6]和rHRG-1基因[7]等。本研究发现线粒体基因在高血压心肌中高表达，包括细胞色素C氧化酶亚单位1基因和ATPase 6基因，ATP酶6基因在高血压鼠中的DNA构象改变以及碱基突变、编码氨基酸的改变均属首次发现。同时还发现高血压患者亦存在类似的改变，说明ATPase 6基因突变在高血压发病中可能起一定作用。
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线粒体基因的高表达发生在高血压之前还是之后，以及与心肌肥厚的关系是关键问题。从动物模型来看，SHR是一种遗传性高血压模型，是WKY的一种变异株，仔鼠可在出生后早期发生快速而严重的高血压，并且SHR鼠与同龄WKY鼠比在3周心肌肥厚即十分明显，3个月即可出现心肌僵硬(Stiffness)。由此看来是先由遗传性状的改变而后引起血压增高，可能包括ATPase 6基因和其它相关基因一起参与高血压发病的过程。本研究结果显示，ATPase 6基因在心肌线粒体中发生两处突变，即G8701A和A8708G，而在肝、脾线粒体中点突变只发生在G8701A位上，而8708位无碱基突变。心脏是高血压病的靶器官，而肝、脾非靶器官，因此8701突变可能是在高血压形成前就存在，而8708位突变可能是血压增高后的改变，从而推论ATPase 6基因在高血压病的改变具有因果两重性。因为选择的SHR和WKY年龄一致，排除了可能存在的不同年龄鼠线粒体之间的差异。有高血压家族史而本人血压正常的年轻人中，不少人左室肥厚，这提示心肌肥厚不一定是高血压动力增高的结果，而是原发性的改变，由此引起心肌收缩力改变，最终导致血压增高。心肌细胞是高度依赖线粒体能量供应的器官之一，ATPase 6基因又是编码ATP合成的F1F0-ATP酶复合物的一部分，因此ATPase 6基因的突变引起编码氨基酸的变化，必然导致蛋白质结构的变化，进而影响ATP的合成。自发性高血压火鸡心室异肌浆蛋白ATPase活性低，ATP产率下降，ATP减少到不能维持心肌细胞的正常功能，可能是引发心肌肥厚的原因之一。有报道ATPase 6 T8993G突变引起ATP产量减少和引起F1F0-ATPase结构的不稳定[8]。因此据ATPase 6碱基突变分析，它可能是导致心肌肥厚原因，而高血压对心肌靶器官的影响引起ATPase 6碱基进一步突变，导致编码氨基酸和蛋白质结构及酶活性的进一步变化。
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3.2 基因突变可能是ATPase 6基因高表达的原因
本研究发现ATPase 6基因在高血压心肌中高表达，进而比较高血压和正常心肌ATPase 6基因序列发现ATPase 6基因8701位碱基G(WKY)突变成A(SHR)(G8701A)，8708位碱基A突变成G(A8708G)。通过计算机分析，这2处突变均导致了编码氨基酸的改变，G8701A引起丙氨酸变成苏氨酸，A8708G使组氨酸变成精氨酸，两者均可引起ATPase蛋白的功能变化。
3.3 高血压人中的类似改变，提示ATPase 6基因突变具有临床意义
由于SHR与人类高血压有近似的发病机制，GenBank检测鼠、人线粒体基因同源性达70.4%，ATPase 6基因的同源性高达99%以上，如果此突变基因与高血压有关，则在高血压病人中也可能有此改变。白细胞DNA含有遗传的所有信息，大多数线粒体DNA点突变，都能从白细胞DNA中检出[9]，因此可检测外周血白细胞。我们对临床确诊为高血压病、冠心病心肌梗塞及正常人各6例进行ATPase 6基因点突变的检测，发现4例高血压病的线粒体ATPase 6基因8584位碱基由G突变成A(G8584A)，编码20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸；冠心病心肌梗塞8584位碱基无变化，1例8575位碱基由C变成T(C8575T)，但编码的氨基酸仍为亮氨酸，为同义突变。高血压病人ATPase 6基因在同一位点的相同突变很可能不是偶然的，它与高血压鼠中碱基突变和编码氨基酸的改变一致，提示这一突变很可能与高血压病有一定联系。由于采用直接测序方法，因此排除了PCR产生突变的可能性。
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由于线粒体基因具有一定特殊性，如因种族 、民族不同而有一些差异，随年龄增长基因缺失可能会增多。所以在选择临床病例时，就尽量考虑排除这些因素的影响，使不同组间具有可比性。线粒体基因突变可预示疾病的进展和恶化[10]，突变的线粒体DNA达到一定程度能引起组织器官的功能异常，症状的严重性与突变的线粒体DNA含量和组织对线粒体ATP依赖程度有关。心肌对线粒体供给能量的依赖程度高，氧化磷酸化功能缺陷表现也明显。
本研究4例G8584A突变的高血压患者中，都显示有左室肥厚的表现，3例有明确的家族史，母亲均为高血压病患者。鉴于正常人和冠心病患者都未出现8584位点的突变，以及有关文献报道在扩张性和肥厚性心肌病中无此突变发生，这一突变可能对高血压具有一定特异性。一些学者研究发现线粒体基因改变的区域与特定的心血管病有一定的对应关系。在临床高血压病人中发现ATPase 6基因的碱基突变和编码氨基酸的改变，可能提示其在高血压病的发生与发展中具有意义。
, 百拇医药 作者简介：周林，男，34岁，讲师，博士
参考文献
1 Siebert P D, Chemchik A. Modified acid guanidinium thiocynate-phenol-chloroform RNA extraction method which greatly reduces DNA contamination. Nucleic Acids Res,1993,21(8):2019
2 Hayashi K. PCR-SSCP：Asimple and sensitive method for detection of mutation in the genomic DNA. PCR Methods Appl,1991,1(1):34
, 百拇医药 3 Anderson S, Bankier A T, Barrell B G,et al. Sequence and organization of the human mitochondria. Nature,1981,9(290):457
4 Cruz Coke R. The genes of human hypertension. Rev Med Chil,1997,125(3):351
5 Yang T, Hassan S A, Singh I, et al. SA gene expression in the proximal tubule of normotensive and hypertensive rats. Hypertension,1996,27(3 part 2):541
6 Yamashita J, Itoh H, Ogawa Y, et al. Opposite regulation of Gax homeobox expression by Angiotensin Ⅱ and C type natriuretic peptide. Hypertension,1997,29(1 part 2):381
, 百拇医药
7 Chen G, Zhang C, Zhu Y. et al. Cloning and expression of a novel gene related to hypertension. Natl Med J China,1997,77(11):823
8 Houstek J, Klement P, Hermanska J,et al. Altered properties of mitochondrial ATP-synthase in patients with a T→G mutation in the ATPase 6(subunit a) gene at position 8993 of mtDNA. Biochim Biophys Acta,1995,1271(2～3)：349
9 Shoffner J M, Wallace D C. Mitochondrial genetics: Principles and practice. Am J Hum Genet,1993,51(6):1179
10 Holme E, Tulinius M H, Larsson N G,et al. Inheritance and expression of mitochondrial DNA point mutations. Biochim Biophys Acta,1995,1271(1):249
(收稿：1998-12-11；修回：1999-07-22), 百拇医药
单位：万大方 李宏年 张萍萍 赵新泰 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 上海，200032)；张国元(第二军医大学长征医院心血管内科 上海，200003)；周林(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第四研究室) 重庆，400042；Liew C C(Laboratory for molecular cardiology,University of Toronto, Ontario,M5G 1L5,Canada)
关键词：高血压；线粒体；ATPase；6基因
第三军医大学学报991010
提 要 目的：研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因。方法：用差别杂交法(Differential hybridization)筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠(SHR)心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR-SSCP和测序，进行基因突变分析。结果：SHR鼠心肌线粒体ATPase 6基因构象改变，8701位碱基由G→A(G8701A)，编码的第59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；A8708G，编码的第61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸。高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase 6基因8584位碱基突变(G8584A)，编码的第20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸，这一变化与SHR线粒体ATPase 6基因改变相一致。结论：高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase 6基因G8584A突变很可能在高血压病心肌肥厚的发生、发展中具有意义，并可能是高血压病的特异性改变。
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中图法分类号 R544.1;Q785 文献标识码：A
Cloning, expression and mutation of mitochondrial ATPase gene of hypertensive patients and rats
Zhou Lin, Wan Dafang, Zhang Guoyuan, Li Hongnian, Zhang Pingping, Zhao Xintai, Gu Jianren, Liew C C (Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400042)
Abstract Objective： To study the different expression of mitochondrial ATPase gene in normotensive and hypertensive human beings and rats. Methods: Partial cDNA clones were screened from human heart cDNA library with differential hybridization. Several mitochondrial genes were highly expressed in the DNA of the cardiac muscle of rats with spontaneous hypertension (SHRs) and in that of peripheral blood leukocytes of patients with hypertension. PCR-SSCP and sequencing were used to study the mutation of the genes. Results: There was polymorphism of mitochondrial ATPase 6 gene in the myocardium of SHR. The base of 8701 changed from G to A (G8701A) and the coden of 59 changed from alanine to threonine and the base of 8708 from A to G and the coden of 61 from histidine to arginine. The mitochondrial ATPase 6 gene in the leucocytes of hepertensive patients underwent similar mutations of G8584A and from alanine to threonine in coden 20. Conclusion: The mutation of G8584A in hypertensive patients is a specific change in hypertension and!may be responsible for the initiation and development of myocardial hypertrophy.
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Key words hypertension; mitochondrium; ATPase 6 gene; cloning; mutation
目前认为高血压病是一种多基因病。寻找与高血压病相关的基因，对研究其发病机制和指导防治都有重要意义。本文以自发性高血压大鼠为材料，采用差别杂交法筛选正常人心脏文库中cDNA部分克隆，研究高血压鼠的表达差异基因，并分析其结构，结合观察临床高血压患者外周血白细胞的变化，探讨其与高血压病发生、发展的可能关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织和标本来源 成年(3～4月龄)自发性高血压鼠(Spontaneous hypertension rats,SHR)，收缩压为28.6～33.3 kPa，平均(30.6±3.3)kPa和成年正常血压对照鼠(Wistar kyoto rats,WKY)均购自上海市高血压研究所，体重180～200 g。取心脏和其它脏器，-70°C保存备用。
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取18例人外周血白细胞为检测标本。正常人6例，为健康查体者，年龄35～60岁；高血压病与冠心病心肌梗塞住院病人各6例。均为汉族，籍贯上海、江苏和浙江。高血压病男4例，女2例，48～65岁，最高血压22～29/14.7～17.3 kPa，其中3例有明确高血压家族史。临床ECG、X线片和UCG检查示左室肥厚及左室重量指数超过正常(140～153 g/m2)4例，冠状动脉造影冠脉正常。冠心病心肌梗塞6例，均为男性，62～84岁，血压13.9～20.5/8～11.7 kPa，无高血压病史，检查无心肌肥厚，冠状动脉造影发现有1支或多支冠脉狭窄病变。
1.1.2 正常人心脏文库cDNA克隆 206个克隆由Dr.Liew C C馈赠，分别由λgtll和Zap Express载体构建。
1.1.3 主要化学试剂及生物试剂 均为进口、国产分析纯试剂和试剂盒。DNA分析软件系统为HIBIO DNASISTEM，碱基序列查询为Internet网络美国NIH GenBank数据库最新信息。
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1.2 方法
1.2.1差别杂交法筛选正常人心脏cDA克隆 用PCR扩增cDNA克隆的phage DNA片段，λgtll载体的引物是：
正向链5′-ATTGGTGGGACGACTCCTTGGA-3′，反向链5′-TTGACACCAGACCAACTGGTA-3′。
Zap ExpressTM载体引物为通用引物T3和T7。反应条件为94°C变性4 min，进入循环，94°C 36 s，55°C 1 min，72°C 1.5 min共35个循环。最后72°C继续延伸10 min。接着分别取PCR产物经1%琼脂糖电泳分离后作Southern吸印。
1.2.2 RNA的抽提，cDNA探针的制备与标记及Southern杂交 采用Siebert等[1]的一步法加以改进，分别提取WKY、SHR心肌RNA。用紫外分光光度计定量，并作RNA电泳检测后，加oligo[dT]12～18，随机引物，α-32P-[dCTP]和RT(AMV逆转录酶)，制备并标记cDNA探针，比放射线活性在1.0×108 dpm/μg DNA以上。分别与心脏cDNA克隆的PCR产物作Southern Blot，确认阳性信号，并经比较找出差异克隆。
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1.2.3 差异克隆的Northern Blot进一步鉴定 将Sou-thern Blot杂交中有差异的克隆分别用PCR扩增后，进行放射性探针同位素标记，并以此为探针，与WKY和SHR心肌RNA作Northern Blot。取同一张RNA膜片，去净探针后，用β-actin杂交对照。
1.2.4 噬菌体DNA的提取、亚克隆及序列测定 液体培养法扩增差异克隆噬菌体并用超速离心法提取噬菌体DNA，用SalⅠ和NotⅠ内切酶消化并回收片段，重组pBK-CMV质粒，转化XL1-Blue感受态细胞，用X-gal、IPTG诱导，37°C培养。取白色克隆抽提质粒DNA，经酶切分析和Southern鉴定。纯化质粒DNA按照USB Sequenase Version 2.0 DNA序列测定试剂盒推荐的操作程序进行DNA序列测定。将碱基序列输入微机DNA分析软件系统进行分析处理，通过网络与GenBank查询。
1.2.5 PCR-SSCP(Single strand conformation polymor-phism)[2]及测序进行基因突变分析 提取WKY和SHR心肌组织及高血压病患者和正常人的白细胞DNA，从克隆出的有表达差异的ATPase 6基因中设计一对引物，正向链5′端加BamHⅠ切点5′-GGGATCCATGAACGAAAATCTGTTCGC-T-3′。反向链中包含PstⅠ切点，5′-GGTGGCCTGCAG-TAATGTTAGCGG-3′。用同位素法进行PCR-SSCP，并用此PCR产物直接测序。
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2 结果
2.1 差别杂交法克隆在SHR心肌中表达差异的基因
2.1.1 PCR扩增正常人心脏cDNA克隆的片段 以1%琼脂凝胶电泳检测大小在0.5～4.3 kb之间，均为单一条带。每份样品进行2次电泳和转膜，分别与WKY和SHR心肌RNA反转录成的cDNA第一链探针池作Southern杂交。对应的PCR产物杂交结果的两两比较，发现3、6号克隆在SHR中强于WKY，见图1。
图1 WKY(A)与SHR(B) cDNA探针和phage克隆PCR产物的Southern Blot结果
Fig 1 Southern Blot of PCR products with cDNA probes of WKY(A) and SHR(B)
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2.1.2 WKY和SHR心肌组织的Northern Blot 对Southern Blot筛选有差异的克隆进行PCR扩增，并分别标记同位素，对WKY和SHR心肌RNA进行Northern Blot，经β-actin对照，挑选表达差异的探针，此探针所对应的基因即为高血压病相关基因，见图2，它们均在高血压心肌mRNA中高表达。
图2 以phage cDNA克隆为探针与WKY和SHR mRNA的Northern Blot结果 SHR(H) mRNA表达明显强于WKY(N)
Fig 2 Northern Blot of phage cDNA probes with WKY and SHR mRNA The lines are obvious in SHR(H) than in WKY(N)
, http://www.100md.com 2.1.3 Phage DNA的抽提、亚克隆及序列测定结果 将Northern Blot中有表达差异的克隆，分别提取phage DNA，经酶切分离纯化释放片段，与pBK-CMV质粒酶切后的片段做连接，转化，重组质粒进行扩增后，进行测序，从而确定基因的碱基序列，经计算机GenBank查询，发现其中一个基因与线粒体ATPase 6基因同源性在98%，确定为线粒体基因，其在线粒体基因中的碱基位置为8483～9288。一个为细胞色素C氧化酶1基因，碱基位置为5210～7461。
由于ATPase 6基因和细胞色素C氧化酶1基因分别参与线粒体的能量代谢和氧化磷酸化过程，与心肌代谢的能量供应直接有关，其基因构成的改变，可能是高血压心肌中的高表达的原因，因此对二者进行PCR-SSCP突变分析。
2.2 PCR-SSCP及测序发现突变基因
2.2.1 细胞色素C氧化酶1和ATPase 6基因单链构象多态性分析 分别用细胞色素C氧化酶1基因的2对引物，对WKY和SHR进行DNA单链构象多态性分析，条带无差异，初步表明无基因突变。而用ATP合成酶6的引物进行PCR-SSCP分析时，每组均有明显差异，提示可能存在突变基因，引起构象改变。
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2.2.2 WKY和SHR线粒体ATPase 6基因序列 用心肌DNA的PCR产物直接测序，发现ATPase 6基因8701位碱基G(WKY)→A(SHR)；编码的59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；8708位碱基A(WKY)→G(SHR)，编码的61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸，见图3，表1。
图3 线粒体ATPase 6基因突变的部分序列
Fig 3 Part of the sequence of mutated mitochondria
ATPase 6 gene
表1 SHR线粒体ATPase 6基因突变和编码氨基酸改变
Tab 1 Mutation of ATPase 6 gene and change of codon in mitochondria of SHR rats(n=8)
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Base site
Codon site
8701
8708
59
61
WKY
G
A
Ala
His
SHR
A
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G
Thr
Arg
2.2.3 SHR不同组织的ATPase 6基因序列 对SHR肝、脾组织线粒体ATPase 6基因进行PCR序列测定，结果发现8701位碱基G(WKY)→A(SHR)，编码氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸。而8708位无变化，仍为A，与正常相同。
2.3 正常人和病人ATPase 6基因的PCR-SSCP分析和序列分析
12例患者中4例高血压病和1例冠心病心肌梗塞患者，SSCP与正常人有明显差异。通过人ATPase 6基因PCR产物直接序列分析发现，正常人8584位碱基均为G，与文献[3]发表的序列一致。4例高血压病人突变成A，即G584A，编码的20位氨基酸亦由丙氨酸变成苏氨酸。冠心病心肌梗塞患者8584位碱基无变化，1例8575位碱基由C变成T，但编码的氨基酸仍为亮氨酸，为同义突变，见表2。其余病例均无突变发生。表2 高血压患者线粒体ATPase 6
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基因突变和编码氨基酸改变
Tab 2 Mutation of ATPase 6 gene and change of codon
in mitochondria of hypertensive patients Cases
Base site
Codon site
8584
20
Normal(n=6)
G
Ala
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Hypertension(n=4)
A
Thr
3 讨论
3.1 ATPase 6基因高表达与高血压病的关系
过去的10年人们已证实引起高血压有2类型基因。一类是编码酶、激素或底物的基因；另一类是涉及高血压的遗传病基因[4]。近年来又发现几种与高血压相关的新基因，如在肾近曲小管上的SA基因[5]，在血管平滑肌上的Gax基因[6]和rHRG-1基因[7]等。本研究发现线粒体基因在高血压心肌中高表达，包括细胞色素C氧化酶亚单位1基因和ATPase 6基因，ATP酶6基因在高血压鼠中的DNA构象改变以及碱基突变、编码氨基酸的改变均属首次发现。同时还发现高血压患者亦存在类似的改变，说明ATPase 6基因突变在高血压发病中可能起一定作用。
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线粒体基因的高表达发生在高血压之前还是之后，以及与心肌肥厚的关系是关键问题。从动物模型来看，SHR是一种遗传性高血压模型，是WKY的一种变异株，仔鼠可在出生后早期发生快速而严重的高血压，并且SHR鼠与同龄WKY鼠比在3周心肌肥厚即十分明显，3个月即可出现心肌僵硬(Stiffness)。由此看来是先由遗传性状的改变而后引起血压增高，可能包括ATPase 6基因和其它相关基因一起参与高血压发病的过程。本研究结果显示，ATPase 6基因在心肌线粒体中发生两处突变，即G8701A和A8708G，而在肝、脾线粒体中点突变只发生在G8701A位上，而8708位无碱基突变。心脏是高血压病的靶器官，而肝、脾非靶器官，因此8701突变可能是在高血压形成前就存在，而8708位突变可能是血压增高后的改变，从而推论ATPase 6基因在高血压病的改变具有因果两重性。因为选择的SHR和WKY年龄一致，排除了可能存在的不同年龄鼠线粒体之间的差异。有高血压家族史而本人血压正常的年轻人中，不少人左室肥厚，这提示心肌肥厚不一定是高血压动力增高的结果，而是原发性的改变，由此引起心肌收缩力改变，最终导致血压增高。心肌细胞是高度依赖线粒体能量供应的器官之一，ATPase 6基因又是编码ATP合成的F1F0-ATP酶复合物的一部分，因此ATPase 6基因的突变引起编码氨基酸的变化，必然导致蛋白质结构的变化，进而影响ATP的合成。自发性高血压火鸡心室异肌浆蛋白ATPase活性低，ATP产率下降，ATP减少到不能维持心肌细胞的正常功能，可能是引发心肌肥厚的原因之一。有报道ATPase 6 T8993G突变引起ATP产量减少和引起F1F0-ATPase结构的不稳定[8]。因此据ATPase 6碱基突变分析，它可能是导致心肌肥厚原因，而高血压对心肌靶器官的影响引起ATPase 6碱基进一步突变，导致编码氨基酸和蛋白质结构及酶活性的进一步变化。
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3.2 基因突变可能是ATPase 6基因高表达的原因
本研究发现ATPase 6基因在高血压心肌中高表达，进而比较高血压和正常心肌ATPase 6基因序列发现ATPase 6基因8701位碱基G(WKY)突变成A(SHR)(G8701A)，8708位碱基A突变成G(A8708G)。通过计算机分析，这2处突变均导致了编码氨基酸的改变，G8701A引起丙氨酸变成苏氨酸，A8708G使组氨酸变成精氨酸，两者均可引起ATPase蛋白的功能变化。
3.3 高血压人中的类似改变，提示ATPase 6基因突变具有临床意义
由于SHR与人类高血压有近似的发病机制，GenBank检测鼠、人线粒体基因同源性达70.4%，ATPase 6基因的同源性高达99%以上，如果此突变基因与高血压有关，则在高血压病人中也可能有此改变。白细胞DNA含有遗传的所有信息，大多数线粒体DNA点突变，都能从白细胞DNA中检出[9]，因此可检测外周血白细胞。我们对临床确诊为高血压病、冠心病心肌梗塞及正常人各6例进行ATPase 6基因点突变的检测，发现4例高血压病的线粒体ATPase 6基因8584位碱基由G突变成A(G8584A)，编码20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸；冠心病心肌梗塞8584位碱基无变化，1例8575位碱基由C变成T(C8575T)，但编码的氨基酸仍为亮氨酸，为同义突变。高血压病人ATPase 6基因在同一位点的相同突变很可能不是偶然的，它与高血压鼠中碱基突变和编码氨基酸的改变一致，提示这一突变很可能与高血压病有一定联系。由于采用直接测序方法，因此排除了PCR产生突变的可能性。
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由于线粒体基因具有一定特殊性，如因种族 、民族不同而有一些差异，随年龄增长基因缺失可能会增多。所以在选择临床病例时，就尽量考虑排除这些因素的影响，使不同组间具有可比性。线粒体基因突变可预示疾病的进展和恶化[10]，突变的线粒体DNA达到一定程度能引起组织器官的功能异常，症状的严重性与突变的线粒体DNA含量和组织对线粒体ATP依赖程度有关。心肌对线粒体供给能量的依赖程度高，氧化磷酸化功能缺陷表现也明显。
本研究4例G8584A突变的高血压患者中，都显示有左室肥厚的表现，3例有明确的家族史，母亲均为高血压病患者。鉴于正常人和冠心病患者都未出现8584位点的突变，以及有关文献报道在扩张性和肥厚性心肌病中无此突变发生，这一突变可能对高血压具有一定特异性。一些学者研究发现线粒体基因改变的区域与特定的心血管病有一定的对应关系。在临床高血压病人中发现ATPase 6基因的碱基突变和编码氨基酸的改变，可能提示其在高血压病的发生与发展中具有意义。
, 百拇医药 作者简介：周林，男，34岁，讲师，博士
参考文献
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10 Holme E, Tulinius M H, Larsson N G,et al. Inheritance and expression of mitochondrial DNA point mutations. Biochim Biophys Acta,1995,1271(1):249
(收稿：1998-12-11；修回：1999-07-22), 百拇医药