反义寡脱氧核苷酸对脯氨酰4-羟化酶mRNA表达的抑制作用
作者：李 舰 李 石 杨秀疆 沈健伟
单位：第二军医大学长征医院消化内科，上海，200003
关键词：寡脱氧核苷酸；反义；脯氨酰4-羟化酶；肝纤维化
第二军医大学学报991007 摘要 目的：观察反义寡脱氧核苷酸(ODN)对脯氨酰4-羟化酶(P4H)两种亚基mRNA表达的影响。方法：采用定量RT-PCR技术检测培养的人皮肤成纤维细胞中P4H mRNA的相对含量。结果：不同浓度(0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/L)反义ODN处理组，人皮肤成纤维细胞中P4H mRNA表达水平均显著低于对照组及错配ODN处理组；其中0.1，0.2 μmol/L反义ODN作用20 h时，抑制效应达到最大，50～70 h后，逐渐恢复到对照组水平。正义ODN与错配ODN对P4H mRNA表达则无明显抑制作用。结论：反义ODN对P4H两种亚基的mRNA表达均有显著和特异的抑制作用。
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中图分类号 Q 786 文献标识码：A
The inhibitory effect of antisense oligodeoxynucleotides on prolyl 4-hydroxylase mRNA expression
Li Jian, Li Shi, Yang Xiujiang, Shen Jianwei
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To observe the effects of antisense oligodeoxynucleotides (ODN) on the 2 subunits of prolyl 4-hydroxylase (P4H) gene expression. Methods: Quantities of P4H mRNA in the cultured human skin fibroblasts was determined by quantitative RT-PCR technology. Results: The mRNA levels of antisense OND(0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/L) group were significantly lower than that of control and missense groups. The effective period of antisense ODN varied in 20～40 h and the greatest inhibition appeared at 20 h. After 50～70 h the inhibitory effectiveness reduced as the control. No significant inhibition was seen in the sense and missense ODN groups. Conclusion: The antisense ODN could inhibit gene expression of P4H (α and β subunit) significantly and specifically.
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KEY WORDS oligodeoxynucleotides，antisense; prolyl 4-hydroxylase; liver fibrosis
肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理改变， 其主要特征是细胞外基质(主要成分是胶原)的过度沉积， 迄今尚无理想治疗药物。 脯氨酰4-羟化酶(P4H)是胶原合成过程中的关键酶， 反义寡脱氧核苷酸抑制P4H的基因表达， 肝纤维化时肝组织P4H的表达明显增强。 已知P4H拮抗剂对肝纤维化具有防治作用， 但由于其副作用大， 难以用于临床[1]。 通过抑制P4H基因的表达来降低P4H活性、减少胶原合成， 有可能成为抗纤维化治疗的一种有效途径。
我们采用针对P4H基因的反义寡脱氧核苷酸(ODN)作用于培养的人皮肤成纤维细胞，并检测细胞P4H mRNA水平的变化，旨在观察P4H基因的反义ODN对P4H mRNA表达的影响及其条件和规律，为后续研究打下基础。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 DMEM培养基，Lipofectin Reagent (Gibco BRL)，小牛血清(上海实生生物技术公司)，DMSO(Amresco)，MTT(Sigma)，3H-TdR 37kBq/L(中科院北京核物理研究所)， AMV逆转录酶(Promega)，Taq酶，dNTP，Oligo dT(15)，RNasin 及相应的缓冲液均购自华美公司。 511酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)，液闪仪(Beckman LS 5000CE)。
1.2 反义ODN的设计与合成 根据人P4Hα，β两亚单位cDNA序列[2，3]，分别设计针对α亚单位5′非翻译区180～180 nt范围内和针对β亚单位5′非翻译区50～250 nt范围内的互补序列，ODN片段均为20 nt。ODN由中科院上海细胞研究所用美国ABI公司391型DNA合成仪以10 μmol起始合成，均以硫代磷酸修饰。各片段均设正义和随机错配片段作为对照。反义ODN及对照序列如下：P4Hα：正义链5′-ACGGGTGGGGGCAGCAGGGA-3′，反义链5′-TCCCTGCTGCCCCCACCCGT-3′，错配链5′-CCTGACCTCCGCCCACGCCT-3′；P4Hβ：正义链5′-GCGCCCCGCCTGAGCCGTGT-3′，反义链5′-ACACGGCTCAGGCGGGGCGC-3′，错配链5′-ACAGCCGCTAGGCGGGGCGC-3′。
, 百拇医药
1.3 定量RT-PCR法 根据P4Hα，P4Hα，β亚基cDNA序列分别设计合成一对引物(使用PCgene软件)。另设一对内参照引物，即P4Hα，β2微球蛋白(β2-MG)。引物序列、RT-PCR方法及PCR产物的分析参见文献[4]。
1.4 人皮肤成纤维细胞的分离培养 取意外死亡之33周龄胎儿股部皮片，切成1 mm3大小的碎片，间隔置于培养瓶底，37℃孵箱过夜。次日加入含10%小牛血清的DMEM，继续培养约1周。当细胞长成致密单层后，用胰蛋白酶消化传代，每2～3 d换液一次，进行传代培养。取其5～10代用于下述实验或液氮冻存。
1.5 反义ODN对人皮肤成纤维细胞增殖影响的研究 培养的成纤维细胞，按5×103个/孔的密度接种于96孔板。加含10%小牛血清的DMEM(含维生素C 50 μmol/ml)，37℃ 5% CO2培养8 h，弃去培养液，加入含设定浓度的ODN与Lipofectin的DMEM 100 μl/孔(不含小牛血清)。培养6 h，除去培养液，加入含10%小牛血清DMEM继续培养至相应时间，用MTT法检测增殖情况。以上每组3孔，重复2次。
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单用组：反义ODN、正义ODN、错配ODN均为0，5，10，25 μmol/L。 Lipofectin分别为：5，10，20 μg/ml。空白对照：等量不含小牛血清的DMEM。复合组：反义ODN、正义ODN、错配ODN分别为5，10，25 μmol/L，均溶于含Lipofectin 10 μg/ml的DMEM中。
1.6 MTT法检测人皮肤成纤维细胞增殖 在设定的时间点，于培养板上加MTT(5 mg/ml DMEM)20 μl/孔。置37℃，继续孵育4 h，弃上清。加100 μl DMSO(未经高压灭菌)，并于振荡器上振荡15 min。以空白孔加DMSO 100 μl作为本底，于540 nm测光密度值(D)。
1.7 人皮肤成纤维细胞DNA合成测定 细胞接种于24孔板，密度为1×104个/孔，分组同1.5。于选定时间点弃上清，各孔加入含3H-TdR 185 Bq/ml(5 Ci/ml)DMEM 200 μl/孔，继续孵育2 h。弃上清，用冷PBS洗2次，加甲醇200 μl/孔，固定10 min。弃上清，清洗，加0.2 mol/L NaOH 0.5 ml/孔，4℃，30 min，溶解细胞。吸取上述液体，再加闪烁液4.5 ml，用液闪仪记数。
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1.8 反义ODN对P4H mRNA的影响 原代培养的人皮肤成纤维细胞，接种于24孔板，1×104个/孔。加含10%小牛血清、50 mmol/L维生素C的DMEM培养液1.0 ml/孔。培养8 h后，除去培养液，PBS洗2遍。反义、正义和错配ODN按以下浓度： 0，0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/L溶于DMEM(不含小牛血清)，分别加Lipofectin使其终质量浓度为5 μg/ml。以上混合液加入各培养孔0.2 ml/孔，均设3复孔。6 h后，除去培养液，PBS洗2遍。加含10%小牛血清的DMEM 1.0 ml/孔，继续培养至设定时间(10，20，30，40，50，70 h)，除去培养液。各孔中加入Trizol试剂，抽提总RNA进行RT-PCR。
1.9 统计学处理 各组数据均以
表示，采用方差分析。
2 结 果
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2.1 对成纤维细胞增殖的影响 经不同剂量ODN(0，5，10，25 μmol/L)作用48 h，成纤维细胞的增殖率在各组之间均无显著差异(P>0.05)。单用Lipofectin (20 μg/ml)时细胞增殖率较对照组明显下降(作用24，48 h时P<0.05；作用72 h时P<0.01)，5.0和10 μg/ml组无显著差异。不同剂量ODN(0，5，10，25 μmol/L)与Lipofectin 10 μg/ml联合作用48 h，成纤维细胞的增殖率在各处理组之间及空白对照组之间均无显著差异(P>0.05)。
2.2 对DNA合成的影响 不同剂量ODN作用48 h对3H-TdR掺入值无明显影响，各组之间均无显著差异(P>0.05)。20 μg/ml Lipofectin对DNA合成有明显抑制作用(作用24 h时P<0.05；作用48，72 h时P<0.01)，5和10 μg/ml组无明显影响。中等剂量ODN(10 μmol/L)合用Lipofectin (10 μg/ml)，作用不同时间(24，48，72 h)对成纤维细胞DNA合成(3H-TdR掺入值)无显著的影响，各组之间相比无显著差异(P>0.05)。
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2.3 对P4H mRNA表达的影响 反义ODN组P4Hα mRNA明显低于各对照组(表1)，其中0.2 μmol/L反义组的降幅最大， P4H mRNA水平仅为空白对照组的24.6%，有非常显著的差异。不同剂量的反义ODN与mRNA水平之间无明确量-效依赖关系。反义ODN组P4Hβ mRNA水平明显降低(表2)，其中0.1 μmol/L组降幅最大，为空白组的30.0%。不同剂量组之间无显著差异，未见明确的量-效依赖关系。
表1 反义ODN对P4Hα mRNA的影响
Tab 1 The expression of P4Hα mRNA dealt with different concentrations of ODN and Lipofectin (5 μg/ml) for 20 h () Group
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ODN Concentration (cB/μmol.L-1)
0
0.1
0.2
0.5
1.0
Control
0.48±0.05
Antisense ODN
0.18±0.03*Δ
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0.12±0.02**Δ
0.19±0.05*Δ
0.22±0.05*Δ
Sense ODN
0.47±0.02
0.50±0.01
0.48±0.03
0.44±0.06
Missense ODN
0.41±0.05
0.46±0.04
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0.39±0.07
0.49±0.05
*P<0.05，**P<0.01 vs control group；ΔP<0.05 vs missense ODN group
表2 反义ODN对P4Hβ mRNA的影响
Tab 2 The expression of P4Hβ mRNA dealt with different concentrations of ODN and Lipofectin ( 5 μg/ml) for 20 h () Group
ODN Concentration (cB/μmol.L-1)
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0
0.1
0.2
0.5
1.0
Control
0.56±0.05
Antisense ODN
0.17±0.03**Δ
0.21±0.05*Δ
0.20±0.03*Δ
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0.24±0.04*Δ
Sense ODN
0.57±0.04
0.51±0.02
0.50±0.03
0.48±0.05
Missense ODN
0.54±0.04
0.56±0.01
0.53±0.04
0.59±0.03
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*P<0.05，**P<0.01 vs control group；ΔP<0.05 vs missense ODN group
反义ODN(0.2 μmol/L)与P4HβmRNA的时-效关系见表3。反义ODN作用后的10 h已可见mRNA水平的降低，并在20 h处达到最低点，50 h后mRNA水平恢复到接近对照组水平，随后的时段内无明显改变。
表3 反义ODN(0.2 μmol/L)与P4Hβ mRNA的时-效关系
Tab 3 The Time-effect relation of antisense ODN on P4Hβ mRNA expression () Group
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Time(t/h)
10
20
30
40
50
70
Antisense ODN
0.31±0.03*
0.21±0.05**
0.30±0.03**
0.41±0.05*
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0.58±0.02
0.59±0.04
Sense ODN
0.39±0.05
0.51±0.02
0.49±0.04
0.54±0.03
0.57±0.05
0.61±0.01
Missense ODN
0.41±0.06
0.56±0.01
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0.51±0.03
0.57±0.02
0.60±0.03
0.58±0.04
Control
0.38±0.03
0.55±0.04
0.59±0.05
0.62±0.03
0.58±0.03
0.60±0.01
*P<0.05，**P<0.01 vs control group
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3 讨 论
反义ODN作为一种选择性阻断特定基因表达的手段，其作用已日益广泛被认识和应用[5，6]，它可以抑制已知序列mRNA的表达。关于反义阻断位点的选择，目前尚无法事先判断哪一段序列其阻断效果最大，多数是对理论推断的几个区域进行探索[7]。人工合成的反义ODN抑制mRNA，主要是通过两者杂交后诱导RNA酶H，降解两者的复合体中RNA部分，这可能是导致靶mRNA水平降低的最重要途径。观察反义ODN对mRNA水平的影响，可反映反义ODN的直接效应和特异性。我们先后选用7个不同的位点做预实验(P4Hα3点、P4Hβ4点，未显示结果)，选择抑制效应最大的ODN片段(α，β各一)用于后续研究。近年来一些研究工作显示反义疗法ODN的作用不仅通过反义特异性机制，尚有非特异性作用，尤其是在ODN浓度较高时[8]。因此有必要选择适当的剂量，以便排除干扰。我们的研究显示，虽然单用ODN时，高达25 μmol/L的ODN并未抑制细胞增殖，但在合用脂质体时，同样剂量的ODN对细胞有一定非特异性抑制作用。
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反义ODN发挥效应的前提是有足够量的分子进入细胞内和细胞核内。一般而言，在细胞外液中的反义ODN是过量的，进入细胞内的部分是较少的。本实验所用的有效剂量是较低的，这与我们应用了脂质体Lipofectin有关。尽管脂质体有许多优点，但它的毒性作用也必须考虑。我们在实验过程中观察到高浓度的脂质体对细胞增殖是有明显抑制作用的，对细胞形态的观察也显示了相同的现象，这一点对我们如何选择适当的剂量以便在提高转移效率的同时避免脂质体的毒性作用有指导价值。
我们在实验中也观察到，不用脂质体时，需用更大剂量(25 μmol/L)ODN才能达合用脂质体时0.2 μmol/L 的抑制效果(未显示结果)。 应用脂质体时，在0.1～1.0 μmol/L的范围，反义ODN对P4H mRNA水平均有显著抑制作用，而且最大抑制效应在0.1～0.2 μmol/L时即出现，P4H mRNA水平与更高的反义ODN剂量似无明显量-效依赖关系。正义ODN与错配 ODN即使在较大剂量时也没有明显的抑制作用，提示反义ODN的作用具有明显的序列特异性。
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细胞与反义ODN共同孵育10 h，ODN处理的各组P4H mRNA水平与空白对照组差距不大。这可能与细胞接种后，较短时间内，细胞数量较少和基因的表达未达到高峰有关。最大的抑制效应可在20 h处观察到。此时，反义ODN组与空白对照的差异最显著，而这期间正是细胞数量呈指数增长期，在这一时期胶原的合成是最旺盛的。50 h后，24孔板内细胞已逐渐趋向融合，数量增长明显减慢，推测这可能是此时各不同处理组P4H mRNA水平趋于一致的原因之一。另外，反义ODN在细胞内的降解与消耗也可减少它的抑制作用。
随着肝纤维化发病机制研究的进展，肝纤维化治疗的策略也逐步明朗。抑制细胞外基质(胶原等)的合成是主要途径之一[9]。国外对使用P4H拮抗剂抑制P4H活性，从而减少胶原合成进行了较为完整的研究，曾进行到临床Ⅰ期实验[1]，后因P4H拮抗剂的毒性作用限制了临床应用。本文结果显示反义ODN能特异地抑制P4H的基因表达。相应地，P4H的蛋白含量及催化活性也将受到抑制。提示利用基因调控手段治疗肝纤维化是可能的，有必要对反义核酸抗肝纤维化以及其他纤维化疾病的潜在临床应用价值作进一步的研究。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0729-04
参考文献
1 Pihlajaniemi T,Myllyla R,Kivirikko KI. Proly 4-hydroxylase and its role in collagen Synthesis[J]. J Hepatol,1991,13(Suppl 3):S2
2 Helaakoski T,Veijola J,Vuori K, et al. Structure and expression of the human gene for the α subunit of proly 4-hydroxylase[J]. J Biol Chem, 1994,269(45):27847
3 Pihlajaniemi T, Helaakoski T, Tasanen K, et al. Molecular cloning of the β subunit of human proly 4-hydroxylase. These subunit and protein disulphide isomerase are products of the same gene[J]. EMBO J, 1987,6(3):643
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4 李 舰，李 石，傅卫军，等. 定量RT-PCR法检测脯氨酰4-羟化酶mRNA的表达[J]. 第二军医大学学报, 1999,20(10):810
5 Khanna A, Li B, Li P, et al. Regulation of transforming growth factor-β1(TGF-β1) expression with a novel TGF-β1 complementary DNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994,204(3):1061
6 Colige A, Sokolov BP，Nagent P，et al. Use of an antisense oligonucleotide to inhibit expression of a mutated human procollagen gene (COL1A1) in transfected mouse 3T3 cell[J]. Biochemistry，1993，32(1)：7
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7 Wagner RW. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides[J]. Nature, 1994, 372(6504):333
8 Burgess TL, Fisher EF, Ross SL, et al. The antiproliferative activity of c-myb and c-myc antisense oligodeoxynucleotides in smooth muscle cells is caused by a nonantisense mechanism[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(9):4051
9 Mavier P, Mallat A. Perspectives in the treatment of liver fibrosis[J]. J Hepatol,1995,22(Suppl 1/2):111
(1999-02-25收稿，1999-07-18修回), 百拇医药
单位：第二军医大学长征医院消化内科，上海，200003
关键词：寡脱氧核苷酸；反义；脯氨酰4-羟化酶；肝纤维化
第二军医大学学报991007 摘要 目的：观察反义寡脱氧核苷酸(ODN)对脯氨酰4-羟化酶(P4H)两种亚基mRNA表达的影响。方法：采用定量RT-PCR技术检测培养的人皮肤成纤维细胞中P4H mRNA的相对含量。结果：不同浓度(0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/L)反义ODN处理组，人皮肤成纤维细胞中P4H mRNA表达水平均显著低于对照组及错配ODN处理组；其中0.1，0.2 μmol/L反义ODN作用20 h时，抑制效应达到最大，50～70 h后，逐渐恢复到对照组水平。正义ODN与错配ODN对P4H mRNA表达则无明显抑制作用。结论：反义ODN对P4H两种亚基的mRNA表达均有显著和特异的抑制作用。
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中图分类号 Q 786 文献标识码：A
The inhibitory effect of antisense oligodeoxynucleotides on prolyl 4-hydroxylase mRNA expression
Li Jian, Li Shi, Yang Xiujiang, Shen Jianwei
(Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
ABSTRACT Objective: To observe the effects of antisense oligodeoxynucleotides (ODN) on the 2 subunits of prolyl 4-hydroxylase (P4H) gene expression. Methods: Quantities of P4H mRNA in the cultured human skin fibroblasts was determined by quantitative RT-PCR technology. Results: The mRNA levels of antisense OND(0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/L) group were significantly lower than that of control and missense groups. The effective period of antisense ODN varied in 20～40 h and the greatest inhibition appeared at 20 h. After 50～70 h the inhibitory effectiveness reduced as the control. No significant inhibition was seen in the sense and missense ODN groups. Conclusion: The antisense ODN could inhibit gene expression of P4H (α and β subunit) significantly and specifically.
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KEY WORDS oligodeoxynucleotides，antisense; prolyl 4-hydroxylase; liver fibrosis
肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理改变， 其主要特征是细胞外基质(主要成分是胶原)的过度沉积， 迄今尚无理想治疗药物。 脯氨酰4-羟化酶(P4H)是胶原合成过程中的关键酶， 反义寡脱氧核苷酸抑制P4H的基因表达， 肝纤维化时肝组织P4H的表达明显增强。 已知P4H拮抗剂对肝纤维化具有防治作用， 但由于其副作用大， 难以用于临床[1]。 通过抑制P4H基因的表达来降低P4H活性、减少胶原合成， 有可能成为抗纤维化治疗的一种有效途径。
我们采用针对P4H基因的反义寡脱氧核苷酸(ODN)作用于培养的人皮肤成纤维细胞，并检测细胞P4H mRNA水平的变化，旨在观察P4H基因的反义ODN对P4H mRNA表达的影响及其条件和规律，为后续研究打下基础。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 DMEM培养基，Lipofectin Reagent (Gibco BRL)，小牛血清(上海实生生物技术公司)，DMSO(Amresco)，MTT(Sigma)，3H-TdR 37kBq/L(中科院北京核物理研究所)， AMV逆转录酶(Promega)，Taq酶，dNTP，Oligo dT(15)，RNasin 及相应的缓冲液均购自华美公司。 511酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)，液闪仪(Beckman LS 5000CE)。
1.2 反义ODN的设计与合成 根据人P4Hα，β两亚单位cDNA序列[2，3]，分别设计针对α亚单位5′非翻译区180～180 nt范围内和针对β亚单位5′非翻译区50～250 nt范围内的互补序列，ODN片段均为20 nt。ODN由中科院上海细胞研究所用美国ABI公司391型DNA合成仪以10 μmol起始合成，均以硫代磷酸修饰。各片段均设正义和随机错配片段作为对照。反义ODN及对照序列如下：P4Hα：正义链5′-ACGGGTGGGGGCAGCAGGGA-3′，反义链5′-TCCCTGCTGCCCCCACCCGT-3′，错配链5′-CCTGACCTCCGCCCACGCCT-3′；P4Hβ：正义链5′-GCGCCCCGCCTGAGCCGTGT-3′，反义链5′-ACACGGCTCAGGCGGGGCGC-3′，错配链5′-ACAGCCGCTAGGCGGGGCGC-3′。
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1.3 定量RT-PCR法 根据P4Hα，P4Hα，β亚基cDNA序列分别设计合成一对引物(使用PCgene软件)。另设一对内参照引物，即P4Hα，β2微球蛋白(β2-MG)。引物序列、RT-PCR方法及PCR产物的分析参见文献[4]。
1.4 人皮肤成纤维细胞的分离培养 取意外死亡之33周龄胎儿股部皮片，切成1 mm3大小的碎片，间隔置于培养瓶底，37℃孵箱过夜。次日加入含10%小牛血清的DMEM，继续培养约1周。当细胞长成致密单层后，用胰蛋白酶消化传代，每2～3 d换液一次，进行传代培养。取其5～10代用于下述实验或液氮冻存。
1.5 反义ODN对人皮肤成纤维细胞增殖影响的研究 培养的成纤维细胞，按5×103个/孔的密度接种于96孔板。加含10%小牛血清的DMEM(含维生素C 50 μmol/ml)，37℃ 5% CO2培养8 h，弃去培养液，加入含设定浓度的ODN与Lipofectin的DMEM 100 μl/孔(不含小牛血清)。培养6 h，除去培养液，加入含10%小牛血清DMEM继续培养至相应时间，用MTT法检测增殖情况。以上每组3孔，重复2次。
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单用组：反义ODN、正义ODN、错配ODN均为0，5，10，25 μmol/L。 Lipofectin分别为：5，10，20 μg/ml。空白对照：等量不含小牛血清的DMEM。复合组：反义ODN、正义ODN、错配ODN分别为5，10，25 μmol/L，均溶于含Lipofectin 10 μg/ml的DMEM中。
1.6 MTT法检测人皮肤成纤维细胞增殖 在设定的时间点，于培养板上加MTT(5 mg/ml DMEM)20 μl/孔。置37℃，继续孵育4 h，弃上清。加100 μl DMSO(未经高压灭菌)，并于振荡器上振荡15 min。以空白孔加DMSO 100 μl作为本底，于540 nm测光密度值(D)。
1.7 人皮肤成纤维细胞DNA合成测定 细胞接种于24孔板，密度为1×104个/孔，分组同1.5。于选定时间点弃上清，各孔加入含3H-TdR 185 Bq/ml(5 Ci/ml)DMEM 200 μl/孔，继续孵育2 h。弃上清，用冷PBS洗2次，加甲醇200 μl/孔，固定10 min。弃上清，清洗，加0.2 mol/L NaOH 0.5 ml/孔，4℃，30 min，溶解细胞。吸取上述液体，再加闪烁液4.5 ml，用液闪仪记数。
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1.8 反义ODN对P4H mRNA的影响 原代培养的人皮肤成纤维细胞，接种于24孔板，1×104个/孔。加含10%小牛血清、50 mmol/L维生素C的DMEM培养液1.0 ml/孔。培养8 h后，除去培养液，PBS洗2遍。反义、正义和错配ODN按以下浓度： 0，0.1，0.2，0.5，1.0 μmol/L溶于DMEM(不含小牛血清)，分别加Lipofectin使其终质量浓度为5 μg/ml。以上混合液加入各培养孔0.2 ml/孔，均设3复孔。6 h后，除去培养液，PBS洗2遍。加含10%小牛血清的DMEM 1.0 ml/孔，继续培养至设定时间(10，20，30，40，50，70 h)，除去培养液。各孔中加入Trizol试剂，抽提总RNA进行RT-PCR。
1.9 统计学处理 各组数据均以
表示，采用方差分析。2 结 果
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2.1 对成纤维细胞增殖的影响 经不同剂量ODN(0，5，10，25 μmol/L)作用48 h，成纤维细胞的增殖率在各组之间均无显著差异(P>0.05)。单用Lipofectin (20 μg/ml)时细胞增殖率较对照组明显下降(作用24，48 h时P<0.05；作用72 h时P<0.01)，5.0和10 μg/ml组无显著差异。不同剂量ODN(0，5，10，25 μmol/L)与Lipofectin 10 μg/ml联合作用48 h，成纤维细胞的增殖率在各处理组之间及空白对照组之间均无显著差异(P>0.05)。
2.2 对DNA合成的影响 不同剂量ODN作用48 h对3H-TdR掺入值无明显影响，各组之间均无显著差异(P>0.05)。20 μg/ml Lipofectin对DNA合成有明显抑制作用(作用24 h时P<0.05；作用48，72 h时P<0.01)，5和10 μg/ml组无明显影响。中等剂量ODN(10 μmol/L)合用Lipofectin (10 μg/ml)，作用不同时间(24，48，72 h)对成纤维细胞DNA合成(3H-TdR掺入值)无显著的影响，各组之间相比无显著差异(P>0.05)。
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2.3 对P4H mRNA表达的影响 反义ODN组P4Hα mRNA明显低于各对照组(表1)，其中0.2 μmol/L反义组的降幅最大， P4H mRNA水平仅为空白对照组的24.6%，有非常显著的差异。不同剂量的反义ODN与mRNA水平之间无明确量-效依赖关系。反义ODN组P4Hβ mRNA水平明显降低(表2)，其中0.1 μmol/L组降幅最大，为空白组的30.0%。不同剂量组之间无显著差异，未见明确的量-效依赖关系。
表1 反义ODN对P4Hα mRNA的影响
Tab 1 The expression of P4Hα mRNA dealt with different concentrations of ODN and Lipofectin (5 μg/ml) for 20 h (
) Group, http://www.100md.com
ODN Concentration (cB/μmol.L-1)
0
0.1
0.2
0.5
1.0
Control
0.48±0.05
Antisense ODN
0.18±0.03*Δ
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0.12±0.02**Δ
0.19±0.05*Δ
0.22±0.05*Δ
Sense ODN
0.47±0.02
0.50±0.01
0.48±0.03
0.44±0.06
Missense ODN
0.41±0.05
0.46±0.04
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0.39±0.07
0.49±0.05
*P<0.05，**P<0.01 vs control group；ΔP<0.05 vs missense ODN group
表2 反义ODN对P4Hβ mRNA的影响
Tab 2 The expression of P4Hβ mRNA dealt with different concentrations of ODN and Lipofectin ( 5 μg/ml) for 20 h (
) GroupODN Concentration (cB/μmol.L-1)
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0
0.1
0.2
0.5
1.0
Control
0.56±0.05
Antisense ODN
0.17±0.03**Δ
0.21±0.05*Δ
0.20±0.03*Δ
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0.24±0.04*Δ
Sense ODN
0.57±0.04
0.51±0.02
0.50±0.03
0.48±0.05
Missense ODN
0.54±0.04
0.56±0.01
0.53±0.04
0.59±0.03
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*P<0.05，**P<0.01 vs control group；ΔP<0.05 vs missense ODN group
反义ODN(0.2 μmol/L)与P4HβmRNA的时-效关系见表3。反义ODN作用后的10 h已可见mRNA水平的降低，并在20 h处达到最低点，50 h后mRNA水平恢复到接近对照组水平，随后的时段内无明显改变。
表3 反义ODN(0.2 μmol/L)与P4Hβ mRNA的时-效关系
Tab 3 The Time-effect relation of antisense ODN on P4Hβ mRNA expression (
) Group, 百拇医药
Time(t/h)
10
20
30
40
50
70
Antisense ODN
0.31±0.03*
0.21±0.05**
0.30±0.03**
0.41±0.05*
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0.58±0.02
0.59±0.04
Sense ODN
0.39±0.05
0.51±0.02
0.49±0.04
0.54±0.03
0.57±0.05
0.61±0.01
Missense ODN
0.41±0.06
0.56±0.01
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0.51±0.03
0.57±0.02
0.60±0.03
0.58±0.04
Control
0.38±0.03
0.55±0.04
0.59±0.05
0.62±0.03
0.58±0.03
0.60±0.01
*P<0.05，**P<0.01 vs control group
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3 讨 论
反义ODN作为一种选择性阻断特定基因表达的手段，其作用已日益广泛被认识和应用[5，6]，它可以抑制已知序列mRNA的表达。关于反义阻断位点的选择，目前尚无法事先判断哪一段序列其阻断效果最大，多数是对理论推断的几个区域进行探索[7]。人工合成的反义ODN抑制mRNA，主要是通过两者杂交后诱导RNA酶H，降解两者的复合体中RNA部分，这可能是导致靶mRNA水平降低的最重要途径。观察反义ODN对mRNA水平的影响，可反映反义ODN的直接效应和特异性。我们先后选用7个不同的位点做预实验(P4Hα3点、P4Hβ4点，未显示结果)，选择抑制效应最大的ODN片段(α，β各一)用于后续研究。近年来一些研究工作显示反义疗法ODN的作用不仅通过反义特异性机制，尚有非特异性作用，尤其是在ODN浓度较高时[8]。因此有必要选择适当的剂量，以便排除干扰。我们的研究显示，虽然单用ODN时，高达25 μmol/L的ODN并未抑制细胞增殖，但在合用脂质体时，同样剂量的ODN对细胞有一定非特异性抑制作用。
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反义ODN发挥效应的前提是有足够量的分子进入细胞内和细胞核内。一般而言，在细胞外液中的反义ODN是过量的，进入细胞内的部分是较少的。本实验所用的有效剂量是较低的，这与我们应用了脂质体Lipofectin有关。尽管脂质体有许多优点，但它的毒性作用也必须考虑。我们在实验过程中观察到高浓度的脂质体对细胞增殖是有明显抑制作用的，对细胞形态的观察也显示了相同的现象，这一点对我们如何选择适当的剂量以便在提高转移效率的同时避免脂质体的毒性作用有指导价值。
我们在实验中也观察到，不用脂质体时，需用更大剂量(25 μmol/L)ODN才能达合用脂质体时0.2 μmol/L 的抑制效果(未显示结果)。 应用脂质体时，在0.1～1.0 μmol/L的范围，反义ODN对P4H mRNA水平均有显著抑制作用，而且最大抑制效应在0.1～0.2 μmol/L时即出现，P4H mRNA水平与更高的反义ODN剂量似无明显量-效依赖关系。正义ODN与错配 ODN即使在较大剂量时也没有明显的抑制作用，提示反义ODN的作用具有明显的序列特异性。
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细胞与反义ODN共同孵育10 h，ODN处理的各组P4H mRNA水平与空白对照组差距不大。这可能与细胞接种后，较短时间内，细胞数量较少和基因的表达未达到高峰有关。最大的抑制效应可在20 h处观察到。此时，反义ODN组与空白对照的差异最显著，而这期间正是细胞数量呈指数增长期，在这一时期胶原的合成是最旺盛的。50 h后，24孔板内细胞已逐渐趋向融合，数量增长明显减慢，推测这可能是此时各不同处理组P4H mRNA水平趋于一致的原因之一。另外，反义ODN在细胞内的降解与消耗也可减少它的抑制作用。
随着肝纤维化发病机制研究的进展，肝纤维化治疗的策略也逐步明朗。抑制细胞外基质(胶原等)的合成是主要途径之一[9]。国外对使用P4H拮抗剂抑制P4H活性，从而减少胶原合成进行了较为完整的研究，曾进行到临床Ⅰ期实验[1]，后因P4H拮抗剂的毒性作用限制了临床应用。本文结果显示反义ODN能特异地抑制P4H的基因表达。相应地，P4H的蛋白含量及催化活性也将受到抑制。提示利用基因调控手段治疗肝纤维化是可能的，有必要对反义核酸抗肝纤维化以及其他纤维化疾病的潜在临床应用价值作进一步的研究。
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文章编号：0258-879X(1999)10-0729-04
参考文献
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2 Helaakoski T,Veijola J,Vuori K, et al. Structure and expression of the human gene for the α subunit of proly 4-hydroxylase[J]. J Biol Chem, 1994,269(45):27847
3 Pihlajaniemi T, Helaakoski T, Tasanen K, et al. Molecular cloning of the β subunit of human proly 4-hydroxylase. These subunit and protein disulphide isomerase are products of the same gene[J]. EMBO J, 1987,6(3):643
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4 李 舰，李 石，傅卫军，等. 定量RT-PCR法检测脯氨酰4-羟化酶mRNA的表达[J]. 第二军医大学学报, 1999,20(10):810
5 Khanna A, Li B, Li P, et al. Regulation of transforming growth factor-β1(TGF-β1) expression with a novel TGF-β1 complementary DNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994,204(3):1061
6 Colige A, Sokolov BP，Nagent P，et al. Use of an antisense oligonucleotide to inhibit expression of a mutated human procollagen gene (COL1A1) in transfected mouse 3T3 cell[J]. Biochemistry，1993，32(1)：7
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7 Wagner RW. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides[J]. Nature, 1994, 372(6504):333
8 Burgess TL, Fisher EF, Ross SL, et al. The antiproliferative activity of c-myb and c-myc antisense oligodeoxynucleotides in smooth muscle cells is caused by a nonantisense mechanism[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(9):4051
9 Mavier P, Mallat A. Perspectives in the treatment of liver fibrosis[J]. J Hepatol,1995,22(Suppl 1/2):111
(1999-02-25收稿，1999-07-18修回), 百拇医药