10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ羟基保护反应过程的研究
作者：韩晓燕* 刘 斌 李培凡** 元英进***
单位：天津大学化工学院 300072
关键词：紫杉醇；10-DAB；羟基保护；连串反应
10 摘 要 对半合成紫杉醇类化合物的关键步骤10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的羟基保护反应进行了研究。结果表明，利用氯甲酸(2，2，2-三氯)乙酯作为羟基保护基，获得7，10-二(三氯乙氧羰基)-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ〔7，10-di(Troc)-10-DAB〕的反应为连串反应，受反应时间和温度影响较大。当反应温度为80 ℃，反应时间为2 min时，目的产物7，10-di(Troc)-10-DAB的反应选择性最好。
Studies on the Protection of Hydroxy Groups in 10-deacetyl Baccatin Ⅲ
, 百拇医药
Han Xiaoyan, Liu Bin, Li Peifan, et al
(College of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072)
Abstract The use of 2,2,2-trichloroethyl chloroformate as the hydroxy protecting group of 10-deacetyl baccatin Ⅲ was studied to give 7, 10-di(2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl)-10-deacetyl baccatin Ⅲ, the key intermediate for the semisynthesis of taxanes. Result of the study showed that it is a consecutive reaction which could be significantly effected by reaction conditions of temperature and time. It was found that at 80℃ for 2 min the selectivity of 7，10-di(2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl)-10-deacetyl baccatin Ⅲ is at its best.
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Key words 10-deacetyl baccatin Ⅲ hydroxy group protection consecutive reaction 2,2,2-trichloroethyl chloroformate
Paclitaxel(I,taxol)是从红豆杉属植物树皮中分离得到的一种二萜化合物，其结构新颖，抗癌机制独特，是近年来国际上公认的最好的抗癌药物之一。但它天然含量甚微，远远不能满足临床及基础研究的需要。因此，多年来人们不断努力试图通过细胞培养和化学合成的方法得到紫杉醇，以解决其供应不足的问题。到目前，细胞培养生产紫杉醇已取得了一定的成果[1，2]。1994年，紫杉醇的化学全合成也获得了成功[3，4]，但全合成路线复杂，成本昂贵，目前仅具有理论意义。而从可再生的植物枝叶中提取含量相对较高的紫杉烷二萜成分作为化学合成的前体，进行紫杉醇的半合成不仅可以缓解紫杉醇的供应危机，还可通过半合成的研究获得有关构效关系的信息，对紫杉醇进行结构改造以期寻找活性更大、毒副作用小，抗癌谱略有不同或更广的紫杉醇类抗癌药物，被认为是最有前途的方法。docetaxel(Ⅱ,taxotere)就是通过半合成的方法得到的一种紫杉醇类似物，其抗癌活性及水溶性均略优于紫杉醇。
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化学半合成的方法是通过从天然提取含量较丰富的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)(Ⅲ)，将其活性基团进行保护后再与合成的侧链偶联，然后脱去保护基得到紫杉醇。10-DAB中含有4个游离的羟基，早期研究表明[5]，这4个游离羟基的反应活性顺序为7-OH>10-OH>13-OH>1-OH。如何选择性地保护7-OH，10-OH，使侧链选择性地与10-DAB中13-OH偶联，是半合成Ⅰ及Ⅱ的关键步骤。Gueritte-Voegelein等人从有机合成的角度对该反应进行了探讨[5]，提出温度为80 ℃，反应时间为5 min的反应条件，但他们对于该反应的动力学未做任何研究。显然，这些信息对于大规模工业生产来说还是远远不够的。同时，我们在研究中还发现，该条件下反应体系中有大量的7，10，13-三羟基保护10-DAB生成，这无疑降低了10-DAB转变为7，10-双羟基保护10-DAB的转化率。同时，增加了产物的分离、纯化难度，增大了半合成的成本。所以，我们从反应工程角度对该反应的动力学进行了研究。结果表明，该反应为一连串反应，最佳反应条件为反应温度80 ℃，反应时间2min。这对于设计反应器，优化合成操作，进行大规模工业生产有十分重要的意义。Ⅰ和Ⅱ的化学结构式见图1，10-DAB的化学结构式见图2。
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图1 化合物Ⅰ和Ⅱ的化学结构式
图2 10-DAB的化学结构式
1 材料与方法
1.1 实验材料：10-DAB纯品由本实验室从红豆杉枝叶浸膏中提取分离得到(纯度99%以上)；氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯购自Aldrich Chemical Company,Inc；其它试剂均为市售分析纯试剂，使用前经常规无水干燥处理。
10-DAB用高效液相色谱仪(HPLC.Spectra-Physics)进行测定，色谱柱是C18反相硅胶柱(Kromasil C18，5μm，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(65∶35)，流速1 mL/min，洗脱时间60 min，在227 nm下用紫外检测器检测，每次进样量为10 μL，进样之前用0.4 μm的滤膜过滤。双蒸水由上海徐新生化仪器厂生产的SZ-93自动双重纯水蒸馏器制备。
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1.2 保护基的选择：在有机合成中对醇羟基的保护可以采取将其转化为醚类、缩醛或缩酮类、酯类的方法[6，7]。按照保护基应具有的引入方便、在所需反应条件下稳定和易于除去的要求，同时考虑到紫杉醇在碱性介质中不稳定，我们选择氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯作为其羟基保护基，在无水吡啶溶液中形成相应的2，2，2-三氯乙基碳酸酯，该保护基在比较强的酸性介质中稳定，并且可以用锌粉或铜-锌偶在较温和的条件下还原除去[6]。
1.3 实验方法：称取10-DAB 100 mg(0.184 mmol)，溶于2 mL无水吡啶中，搅拌，油浴加热，数分钟后加入ClCOOCH2CCl3 0.085 mL(0.617 mmol),每隔1 min取样100 μL，加入盛有3 mL H2O的50 mL容量瓶中使其反应停止，然后用甲醇稀释至刻度。HPLC检测。
2 结果与讨论
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2.1 实验结果：图3～图5分别为反应温度为70 ℃、80 ℃、90 ℃时不同时间10-DAB羟基保护反应进程的测定结果。图中横坐标为反应时间，纵坐标为HPLC检测时产物浓度对应的色谱响应值。比较以上3个图我们可以发现，在不同的反应温度下，该反应的进程有如下的规律：
(1)单羟基保护的反应产物Ⅳ[7-(Troc)-10-DAB]仅在反应开始后很短的时间内可以检测得到，说明Ⅳ同样具有较高的反应活性，很快继续反应形成双羟基或三羟基保护的产物；
(2)双羟基保护的反应产物Ⅴ[7，10-di(Troc)-10-DAB]的色谱响应值均出现一个由小变大，然后再变小并趋于恒定的变化规律；
(3)三羟基保护的反应产物Ⅵ[7，10，13-tri(Troc)-10-DAB]在反应进行2min后才能检测到，3min后色谱响应值趋于恒定。
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图3 70 ℃ 10-DAB的羟基保护反应
图4 80 ℃ 10-DAB的羟基保护反应
图5 90 ℃ 10-DAB的羟基保护反应
但是，同时我们也可以发现目标产物Ⅴ出现的最大色谱响应值，在不同的反应温度下有明显的不同。在温度为70℃和90℃时，目标产物Ⅴ的色谱响应值出现最高点的同时，三羟基保护10-DAB(产物Ⅵ)也出现一个较大的色谱响应值。而反应温度为80℃时双羟基保护10-DAB(产物Ⅴ)在2 min时有一个明显的色谱响应值，而且与90℃的结果相比，80℃时三羟基保护产物稳定在一个较低的水平上。说明反应体系中双羟基保护10-DAB(Ⅴ)最多，三羟基保护10-DAB(Ⅵ)生成的极少，单羟基保护10-DAB(Ⅳ)几乎已全部转化为双羟基保护10-DAB。此时停止反应，可以使10-DAB有较高的转化率，减少产物的分离、纯化难度，降低半合成的成本。通过以上实验结果，我们认为在80℃的条件下，2min停止反应是获得半合成紫杉醇类化合物关键的中间体—双羟基保护10-DAB(Ⅴ)的最佳反应条件。
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2.2 结果分析：在图3、图4中，单羟基保护10-DAB(Ⅳ)在1 min时有一色谱响应值，2 min时该值明显下降。而3 min时才检测到三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的存在。因此，Ⅵ不可能由Ⅳ直接生成。这一点在图5中也有显示，由于反应温度的升高，反应速度增大，在反应1 min后间隔取样已经检测不到单羟基保护10-DAB的存在；而反应产物Ⅵ在2 min取样时才检测到，这也说明Ⅵ不是由直接Ⅳ反应而来。根据文献中报道的10-DAB上4个羟基的反应活性顺序为：7-OH>10-OH>13-OH>1-OH，因此反应过程具备连串反应的条件。图3和图4中均可看到，在间隔时间取样时，单羟基保护10-DABⅣ均出现一峰值，然后很快降低到零，符合连串反应的特征。因此，可以得到以下结论：用氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯作为保护基，进行10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)羟基保护的反应为一连串反应，反应方程式见图6。
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图6 10-DAB羟基保护反应示意图
在图3～5中上单羟基保护10-DAB的色谱响应值始终很低，说明上单羟基保护10-DAB非常活泼，迅速转化为双羟基保护10-DAB；且高温时更会加速这一反应。比较图3和图5可知，在反应温度为70 ℃，1 min时单羟基保护10-DAB出现一个峰值，但在90 ℃却始终检测不到该峰。这是由于随着反应温度增高，由Ⅲ转化为Ⅳ的反应逐渐加快的结果。可见单羟基保护10-DAB的生成反应受温度影响较大。
另外，从以上3个图中我们还可以看出，反应进行3 min后，双羟基保护10-DAB(Ⅴ)和三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的色谱响应值基本上均处于一个恒定值。即双羟基保护10-DAB(Ⅴ)并不完全转化为三羟基保护10-DAB(Ⅵ)，说明该反应为可逆反应，不能象单羟基保护10-DAB(Ⅳ)转化为双羟基保护10-DAB(Ⅴ)的反应那样进行的较完全。同时，图5与图4进行比较，我们还发现90 ℃时最终产物三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的色谱响应值稳定在一个较高的水平，说明双羟基保护10-DAB(Ⅴ)转化为三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的反应为吸热反应。所以，高温有利于10-DAB向最终产物三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的转化。定量的结果还有待于更详细的实验数据来证实。
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3 结论
氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯作为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的羟基保护基，与10-DAB反应，获得紫杉烷类化合物半合成的前体7，10-二(三氯乙氧羰基)-10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的反应为连串反应，反应受温度和浓度影响显著。对于目的产物7，10-二(三氯乙氧羰基)-10-去乙酰巴卡亭Ⅲ，反应温度为80 ℃，反应2 min的反应选择性最好。
参考文献
1 元英进，等.中草药，1997，28(增)：9
2 元英进，等.中草药，1997，28(增)：12
3 Holton R A, et al. J Am Chem,1994,116:1597
4 Nicolaon K C, et al. Nature,1994,367:630
5 Gueritte-Voegelein F, et al. Tetrahedron,1986,42:4451
6 Windholz T B, et al. Tetrahedron Lett,1967:2555
7 赵知中，等.有机化学中的保护基团.北京：科学出版社，1984：89
收稿日期：1999-04-05, 百拇医药(韩晓燕* 刘 斌 李培凡** 元英进***)
单位：天津大学化工学院 300072
关键词：紫杉醇；10-DAB；羟基保护；连串反应
10 摘 要 对半合成紫杉醇类化合物的关键步骤10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的羟基保护反应进行了研究。结果表明，利用氯甲酸(2，2，2-三氯)乙酯作为羟基保护基，获得7，10-二(三氯乙氧羰基)-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ〔7，10-di(Troc)-10-DAB〕的反应为连串反应，受反应时间和温度影响较大。当反应温度为80 ℃，反应时间为2 min时，目的产物7，10-di(Troc)-10-DAB的反应选择性最好。
Studies on the Protection of Hydroxy Groups in 10-deacetyl Baccatin Ⅲ
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Han Xiaoyan, Liu Bin, Li Peifan, et al
(College of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072)
Abstract The use of 2,2,2-trichloroethyl chloroformate as the hydroxy protecting group of 10-deacetyl baccatin Ⅲ was studied to give 7, 10-di(2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl)-10-deacetyl baccatin Ⅲ, the key intermediate for the semisynthesis of taxanes. Result of the study showed that it is a consecutive reaction which could be significantly effected by reaction conditions of temperature and time. It was found that at 80℃ for 2 min the selectivity of 7，10-di(2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl)-10-deacetyl baccatin Ⅲ is at its best.
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Key words 10-deacetyl baccatin Ⅲ hydroxy group protection consecutive reaction 2,2,2-trichloroethyl chloroformate
Paclitaxel(I,taxol)是从红豆杉属植物树皮中分离得到的一种二萜化合物，其结构新颖，抗癌机制独特，是近年来国际上公认的最好的抗癌药物之一。但它天然含量甚微，远远不能满足临床及基础研究的需要。因此，多年来人们不断努力试图通过细胞培养和化学合成的方法得到紫杉醇，以解决其供应不足的问题。到目前，细胞培养生产紫杉醇已取得了一定的成果[1，2]。1994年，紫杉醇的化学全合成也获得了成功[3，4]，但全合成路线复杂，成本昂贵，目前仅具有理论意义。而从可再生的植物枝叶中提取含量相对较高的紫杉烷二萜成分作为化学合成的前体，进行紫杉醇的半合成不仅可以缓解紫杉醇的供应危机，还可通过半合成的研究获得有关构效关系的信息，对紫杉醇进行结构改造以期寻找活性更大、毒副作用小，抗癌谱略有不同或更广的紫杉醇类抗癌药物，被认为是最有前途的方法。docetaxel(Ⅱ,taxotere)就是通过半合成的方法得到的一种紫杉醇类似物，其抗癌活性及水溶性均略优于紫杉醇。
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化学半合成的方法是通过从天然提取含量较丰富的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)(Ⅲ)，将其活性基团进行保护后再与合成的侧链偶联，然后脱去保护基得到紫杉醇。10-DAB中含有4个游离的羟基，早期研究表明[5]，这4个游离羟基的反应活性顺序为7-OH>10-OH>13-OH>1-OH。如何选择性地保护7-OH，10-OH，使侧链选择性地与10-DAB中13-OH偶联，是半合成Ⅰ及Ⅱ的关键步骤。Gueritte-Voegelein等人从有机合成的角度对该反应进行了探讨[5]，提出温度为80 ℃，反应时间为5 min的反应条件，但他们对于该反应的动力学未做任何研究。显然，这些信息对于大规模工业生产来说还是远远不够的。同时，我们在研究中还发现，该条件下反应体系中有大量的7，10，13-三羟基保护10-DAB生成，这无疑降低了10-DAB转变为7，10-双羟基保护10-DAB的转化率。同时，增加了产物的分离、纯化难度，增大了半合成的成本。所以，我们从反应工程角度对该反应的动力学进行了研究。结果表明，该反应为一连串反应，最佳反应条件为反应温度80 ℃，反应时间2min。这对于设计反应器，优化合成操作，进行大规模工业生产有十分重要的意义。Ⅰ和Ⅱ的化学结构式见图1，10-DAB的化学结构式见图2。
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图1 化合物Ⅰ和Ⅱ的化学结构式
图2 10-DAB的化学结构式
1 材料与方法
1.1 实验材料：10-DAB纯品由本实验室从红豆杉枝叶浸膏中提取分离得到(纯度99%以上)；氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯购自Aldrich Chemical Company,Inc；其它试剂均为市售分析纯试剂，使用前经常规无水干燥处理。
10-DAB用高效液相色谱仪(HPLC.Spectra-Physics)进行测定，色谱柱是C18反相硅胶柱(Kromasil C18，5μm，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(65∶35)，流速1 mL/min，洗脱时间60 min，在227 nm下用紫外检测器检测，每次进样量为10 μL，进样之前用0.4 μm的滤膜过滤。双蒸水由上海徐新生化仪器厂生产的SZ-93自动双重纯水蒸馏器制备。
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1.2 保护基的选择：在有机合成中对醇羟基的保护可以采取将其转化为醚类、缩醛或缩酮类、酯类的方法[6，7]。按照保护基应具有的引入方便、在所需反应条件下稳定和易于除去的要求，同时考虑到紫杉醇在碱性介质中不稳定，我们选择氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯作为其羟基保护基，在无水吡啶溶液中形成相应的2，2，2-三氯乙基碳酸酯，该保护基在比较强的酸性介质中稳定，并且可以用锌粉或铜-锌偶在较温和的条件下还原除去[6]。
1.3 实验方法：称取10-DAB 100 mg(0.184 mmol)，溶于2 mL无水吡啶中，搅拌，油浴加热，数分钟后加入ClCOOCH2CCl3 0.085 mL(0.617 mmol),每隔1 min取样100 μL，加入盛有3 mL H2O的50 mL容量瓶中使其反应停止，然后用甲醇稀释至刻度。HPLC检测。
2 结果与讨论
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2.1 实验结果：图3～图5分别为反应温度为70 ℃、80 ℃、90 ℃时不同时间10-DAB羟基保护反应进程的测定结果。图中横坐标为反应时间，纵坐标为HPLC检测时产物浓度对应的色谱响应值。比较以上3个图我们可以发现，在不同的反应温度下，该反应的进程有如下的规律：
(1)单羟基保护的反应产物Ⅳ[7-(Troc)-10-DAB]仅在反应开始后很短的时间内可以检测得到，说明Ⅳ同样具有较高的反应活性，很快继续反应形成双羟基或三羟基保护的产物；
(2)双羟基保护的反应产物Ⅴ[7，10-di(Troc)-10-DAB]的色谱响应值均出现一个由小变大，然后再变小并趋于恒定的变化规律；
(3)三羟基保护的反应产物Ⅵ[7，10，13-tri(Troc)-10-DAB]在反应进行2min后才能检测到，3min后色谱响应值趋于恒定。
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图3 70 ℃ 10-DAB的羟基保护反应
图4 80 ℃ 10-DAB的羟基保护反应
图5 90 ℃ 10-DAB的羟基保护反应
但是，同时我们也可以发现目标产物Ⅴ出现的最大色谱响应值，在不同的反应温度下有明显的不同。在温度为70℃和90℃时，目标产物Ⅴ的色谱响应值出现最高点的同时，三羟基保护10-DAB(产物Ⅵ)也出现一个较大的色谱响应值。而反应温度为80℃时双羟基保护10-DAB(产物Ⅴ)在2 min时有一个明显的色谱响应值，而且与90℃的结果相比，80℃时三羟基保护产物稳定在一个较低的水平上。说明反应体系中双羟基保护10-DAB(Ⅴ)最多，三羟基保护10-DAB(Ⅵ)生成的极少，单羟基保护10-DAB(Ⅳ)几乎已全部转化为双羟基保护10-DAB。此时停止反应，可以使10-DAB有较高的转化率，减少产物的分离、纯化难度，降低半合成的成本。通过以上实验结果，我们认为在80℃的条件下，2min停止反应是获得半合成紫杉醇类化合物关键的中间体—双羟基保护10-DAB(Ⅴ)的最佳反应条件。
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2.2 结果分析：在图3、图4中，单羟基保护10-DAB(Ⅳ)在1 min时有一色谱响应值，2 min时该值明显下降。而3 min时才检测到三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的存在。因此，Ⅵ不可能由Ⅳ直接生成。这一点在图5中也有显示，由于反应温度的升高，反应速度增大，在反应1 min后间隔取样已经检测不到单羟基保护10-DAB的存在；而反应产物Ⅵ在2 min取样时才检测到，这也说明Ⅵ不是由直接Ⅳ反应而来。根据文献中报道的10-DAB上4个羟基的反应活性顺序为：7-OH>10-OH>13-OH>1-OH，因此反应过程具备连串反应的条件。图3和图4中均可看到，在间隔时间取样时，单羟基保护10-DABⅣ均出现一峰值，然后很快降低到零，符合连串反应的特征。因此，可以得到以下结论：用氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯作为保护基，进行10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)羟基保护的反应为一连串反应，反应方程式见图6。
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图6 10-DAB羟基保护反应示意图
在图3～5中上单羟基保护10-DAB的色谱响应值始终很低，说明上单羟基保护10-DAB非常活泼，迅速转化为双羟基保护10-DAB；且高温时更会加速这一反应。比较图3和图5可知，在反应温度为70 ℃，1 min时单羟基保护10-DAB出现一个峰值，但在90 ℃却始终检测不到该峰。这是由于随着反应温度增高，由Ⅲ转化为Ⅳ的反应逐渐加快的结果。可见单羟基保护10-DAB的生成反应受温度影响较大。
另外，从以上3个图中我们还可以看出，反应进行3 min后，双羟基保护10-DAB(Ⅴ)和三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的色谱响应值基本上均处于一个恒定值。即双羟基保护10-DAB(Ⅴ)并不完全转化为三羟基保护10-DAB(Ⅵ)，说明该反应为可逆反应，不能象单羟基保护10-DAB(Ⅳ)转化为双羟基保护10-DAB(Ⅴ)的反应那样进行的较完全。同时，图5与图4进行比较，我们还发现90 ℃时最终产物三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的色谱响应值稳定在一个较高的水平，说明双羟基保护10-DAB(Ⅴ)转化为三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的反应为吸热反应。所以，高温有利于10-DAB向最终产物三羟基保护10-DAB(Ⅵ)的转化。定量的结果还有待于更详细的实验数据来证实。
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3 结论
氯甲酸-(2，2，2-三氯)乙酯作为10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的羟基保护基，与10-DAB反应，获得紫杉烷类化合物半合成的前体7，10-二(三氯乙氧羰基)-10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的反应为连串反应，反应受温度和浓度影响显著。对于目的产物7，10-二(三氯乙氧羰基)-10-去乙酰巴卡亭Ⅲ，反应温度为80 ℃，反应2 min的反应选择性最好。
参考文献
1 元英进，等.中草药，1997，28(增)：9
2 元英进，等.中草药，1997，28(增)：12
3 Holton R A, et al. J Am Chem,1994,116:1597
4 Nicolaon K C, et al. Nature,1994,367:630
5 Gueritte-Voegelein F, et al. Tetrahedron,1986,42:4451
6 Windholz T B, et al. Tetrahedron Lett,1967:2555
7 赵知中，等.有机化学中的保护基团.北京：科学出版社，1984：89
收稿日期：1999-04-05, 百拇医药(韩晓燕* 刘 斌 李培凡** 元英进***)