胃脘舒冲剂三维高效液相色谱鉴定及指标性成分的定量
作者：宋洪杰* 胡晋红 全山丛
单位：上海长海医院临床药理室 200433
关键词：指标性成分；胃脘舒冲剂；三维高效液相色谱法；甘草酸；橙皮苷；芍药苷
胃脘舒冲剂三维高效液相色谱鉴定及指标性成分的定量 摘 要 采用3D-HPLC对胃脘舒冲剂进行了定性鉴别并建立其指标性成分的定量分析方法。色谱柱：CLC-ODS(6.0mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液系统；洗脱方式：二元高压梯度洗脱；检测方式：二级管阵列检测器多通道检测；测定波长：芍药苷230nm，甘草酸254nm，橙皮苷283nm；各指标性成分的线性范围分别为：芍药苷4.23～67.68μg/mL(r=0.9999,n=5)，橙皮苷7.50～119.20μg/mL(r=0.9998,n=5)，甘草酸10.50～168.00μg/mL(r=0.9994,n=5)；加样回收率及RSD分别为：芍药苷89.46%，2.87%，橙皮苷93.76%，2.48%，甘草酸90.22%，1.79%。同时用三维HPLC图谱对胃脘舒冲剂进行了定性鉴别。
, 百拇医药
Identification and Determination of Marker Substances in
Weiwanshu Chongji by Three Dimensional HPLC
Song Hongjie, Hu Jinhong and Quan Shancong
(Department of Clinical Pharmacology, Changhai Hospital, Shanghai 200433)
Abstract The Weiwanshu Chongji was analyzed by three dimensional HPLC. Some of the Chinese herbal drugs could be identified and the contents of the marker substances could be determined. Column:Shim-pack CLC-ODS (6.0 mm×150 mm， 5 μm). Mobile phase: acetonitrile-0.1% acetic acid solution； Elution mode: binary high pressure gradient system； Detector: UV/Vis photodiode array detector, the detection was performed by multi-channel chromatograms with different wavelengths, the detection wavelengths were 230 nm for paeonflorin, 254 nm for glycyrrhizic acid and 283 nm for hesperidin. The marker substances were identified by three dimensional chromatogram.The linear ranges were: 4.23～67.68 μg/mL (r=0.9999, n=5) for paeoniflorin, 7.50～119.20 μg/mL (r=0.9998, n=5) for hesperidin, and 10.50～168.00 μg/mL (r=0.9994, n=5) for glycyrrhizic acid. The recoveries and RSD were: 89.46%, 2.87% for paeoniflorin, 93.76%, 2.48% for hesperidin and 90.22%, 1.79% for glycyrrhizic acid. The Weiwanshu Chongji was identified by three dimensional chromatograms.
, 百拇医药
Key words marker substance Weiwanshu Chongji three dimensional HPLC
paeoniflorin hesperidin glycyrrhizic acid
胃脘舒冲剂主要由党参、甘草、白芍、山楂、陈皮和延胡索等中药组成，临床主要用于治疗萎缩性胃炎。单味中药中某种特定成分并不能反映其内在质量，因此作者试图尝试测定胃脘舒冲剂中芍药苷、橙皮苷和甘草酸的含量，从而探索指标性成分分析的可行性，并利用三维高效液相色谱法对胃脘舒冲剂进行了定性鉴别，以达到控制其质量的目的。
1 材料和方法
1.1 仪器及试药：岛津液相色谱仪(泵：LC-10AD，二极管阵列检测器：SPD-10Avp，LC工作站：CLASS-LC10)，超声波振荡器(上海必能信超声有限公司，SB5200，频率50 kHz)，乙腈(HPLC级)，冰醋酸(分析纯)，甲醇(HPLC级)，甘草酸单铵盐、芍药苷、橙皮苷标准品均由中国药品生物制品检定所提供，药材及制剂由上海长海医院提供。
, 百拇医药
1.2 标准贮备液的制备：分别精密称取甘草酸单铵盐10.50mg、芍药苷8.4mg和橙皮苷7.45mg，放入10 mL量瓶中，用甲醇定容。
1.3 供试品药液的制备：取胃脘舒冲剂粉末约0.5g，放入25mL量瓶中，加入50%甲醇20mL，超声振荡提取1h，冷却后3000r/min离心6min，取2.5mL放10mL量瓶中，加甲醇定容后1×104r/min离心4min，微孔滤膜(0.45μm)过滤；各单味中药及缺一味的模拟冲剂，按制备工艺处理，以同样方法提取，分别制备成供试品药液。
1.4 色谱条件：色谱柱：Shim-pack CLC-ODS(6.0 mm×150mm，5μm)，流速：1.2mL/min，流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液，梯度洗脱程序如下：0→15min，乙腈20%；15→25min，乙腈20%→50%，线性洗脱；25→35min，乙腈50%，分离结果见图1。
, 百拇医药
A-芍药苷、橙皮苷和甘草酸标准品 B-阴性药液 C-胃脘舒冲剂
1-芍药苷 2-橙皮苷 3-甘草酸
图1 样品HPLC图
2 结果
2.1 定性鉴别：按上述所选的色谱条件，分别绘制单味中药、缺一味中药的模拟药液及供试品药液的三维图谱，经对照分析，处方中的甘草、陈皮和芍药有特征吸收峰，可被确认。三维鉴定图谱见图2。山楂、党参在所选的波长范围无特征吸收峰，延胡索所含成分峰吸收强度较弱，有的峰被其它组分峰掩盖，故未被确认。
2.2 标准曲线制备：分别取甘草酸单铵盐、芍药苷和橙皮苷适量，置10 mL量瓶中，用甲醇定容配制成系列浓度，进样10 μL，进行梯度洗脱，以对照品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，各指标性成分的线性范围、检测波长及相关系数见表1。
, 百拇医药
由表1可见，各标准对照品在所选的浓度范围内线性关系良好。
2.3 干扰试验：为考察其他药材对所测定的3种组分有无干扰，我们制备了缺上述3种药材的阴性药液，从图1可见，其他药材对测定无干扰。
1、7-白芍 2-芍药苷 3，4，8，9，10，11，12，13-甘草 5-陈皮 6-橙皮苷 14-甘草酸
图2 胃脘舒冲剂三维HPLC图
, 百拇医药
表1 指标性成分的线性范围、检测波长、保留时间、回归方程及相关系数
指标性成分
线性范围(μg/mL)
检测波长(nm)
保留时间(min)
回归方程
芍药苷
4.23～67.68
230
6.40
A=-9594.04+21993.20C(r=0.9999)
, 百拇医药
橙皮苷
7.50～119.20
283
17.24
A=32201.04+6817.22C(r=0.9998)
甘草酸
10.50～168.00
254
27.76
A=30722.46+5062.23C(r=0.9994)
2.4 精密度试验：取供试品药液10μL进样，重复测定5次，各组分的RSD分别为：甘草酸1.66%，芍药苷2.03%，橙皮苷0.85%。
, 百拇医药
2.5 加样回收率：取已知含量同一批号样品的0.5g，分别加入各标准对照品适量，按供试品药液的制备方法提取，进样10μL，按色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表2。
表2 芍药苷、橙皮苷、甘草酸的加样回收率
组分
已知含量
(mg)
加入量
(mg)
测得总量
(mg)
回收率
(%)
, 百拇医药
平均回收率
(%)
RSD(n=3)
(%)
0.5016
1.1343
88.47
芍药苷
0.5491
0.7152
1.2098
92.38
89.46±2.57
, http://www.100md.com
2.87
0.5026
1.1287
87.54
1.0314
1.8966
96.31
橙皮苷
1.1291
0.8983
1.9665
93.22
93.76±2.32
, 百拇医药
2.48
1.0335
1.8578
91.76
1.5799
2.5265
90.15
甘草酸
1.7296
1.0500
2.6603
88.64
90.22±1.61
, 百拇医药
1.79
1.5831
2.5476
91.86
2.6 样品测定：取两个批号的供试品液，进样10μL，按标准曲线计算含量，结果见表3。
表3 样品测定结果(n=3)
批号
甘草酸
(mg/g)
RSD
(%)
芍药苷
, 百拇医药
(mg/g)
RSD
(%)
橙皮苷
(mg/g)
RSD
(%)
980121
3.1616±0.0747
2.36
0.9298±0.0238
2.56
2.2061±0.0394
, 百拇医药
1.78
980331
3.1373±0.2157
6.87
0.9960±0.0217
2.18
2.0481±0.0792
3.86
3 讨论
3.1 本文采用乙腈-0.1%醋酸水溶液作为洗脱系统，应用二元高压梯度洗脱方式使待测组分30 min内出峰，一次进样即可完成3种性质不同组分的定性、定量，缩短了分析时间，提高了分析效率。
3.2 中药复方是由多种指标性成分协同作用而发挥效应，作者应用二极管阵列检测器的多通道检测功能，选择各个待测指标性成分的最大吸收波长检测，达到了多种成分同时定量的目的，同时也避免了常用UV检测器只能在单一波长下同时检测几种物质所引起的灵敏度低的问题。本文选择了230 nm测定芍药苷，254 nm测定甘草酸，283 nm测定橙皮苷。
3.3 在实验过程中发现，各单味药材按工艺制备提取后，三维图谱有特定吸收峰的位置在供试品药液相应位置上出现了无峰和峰变小现象，这也说明各味药材在工艺制备中存在着相互作用。
收稿日期：1998-11-25, http://www.100md.com(宋洪杰* 胡晋红 全山丛)
单位：上海长海医院临床药理室 200433
关键词：指标性成分；胃脘舒冲剂；三维高效液相色谱法；甘草酸；橙皮苷；芍药苷
胃脘舒冲剂三维高效液相色谱鉴定及指标性成分的定量 摘 要 采用3D-HPLC对胃脘舒冲剂进行了定性鉴别并建立其指标性成分的定量分析方法。色谱柱：CLC-ODS(6.0mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液系统；洗脱方式：二元高压梯度洗脱；检测方式：二级管阵列检测器多通道检测；测定波长：芍药苷230nm，甘草酸254nm，橙皮苷283nm；各指标性成分的线性范围分别为：芍药苷4.23～67.68μg/mL(r=0.9999,n=5)，橙皮苷7.50～119.20μg/mL(r=0.9998,n=5)，甘草酸10.50～168.00μg/mL(r=0.9994,n=5)；加样回收率及RSD分别为：芍药苷89.46%，2.87%，橙皮苷93.76%，2.48%，甘草酸90.22%，1.79%。同时用三维HPLC图谱对胃脘舒冲剂进行了定性鉴别。
, 百拇医药
Identification and Determination of Marker Substances in
Weiwanshu Chongji by Three Dimensional HPLC
Song Hongjie, Hu Jinhong and Quan Shancong
(Department of Clinical Pharmacology, Changhai Hospital, Shanghai 200433)
Abstract The Weiwanshu Chongji was analyzed by three dimensional HPLC. Some of the Chinese herbal drugs could be identified and the contents of the marker substances could be determined. Column:Shim-pack CLC-ODS (6.0 mm×150 mm， 5 μm). Mobile phase: acetonitrile-0.1% acetic acid solution； Elution mode: binary high pressure gradient system； Detector: UV/Vis photodiode array detector, the detection was performed by multi-channel chromatograms with different wavelengths, the detection wavelengths were 230 nm for paeonflorin, 254 nm for glycyrrhizic acid and 283 nm for hesperidin. The marker substances were identified by three dimensional chromatogram.The linear ranges were: 4.23～67.68 μg/mL (r=0.9999, n=5) for paeoniflorin, 7.50～119.20 μg/mL (r=0.9998, n=5) for hesperidin, and 10.50～168.00 μg/mL (r=0.9994, n=5) for glycyrrhizic acid. The recoveries and RSD were: 89.46%, 2.87% for paeoniflorin, 93.76%, 2.48% for hesperidin and 90.22%, 1.79% for glycyrrhizic acid. The Weiwanshu Chongji was identified by three dimensional chromatograms.
, 百拇医药
Key words marker substance Weiwanshu Chongji three dimensional HPLC
paeoniflorin hesperidin glycyrrhizic acid
胃脘舒冲剂主要由党参、甘草、白芍、山楂、陈皮和延胡索等中药组成，临床主要用于治疗萎缩性胃炎。单味中药中某种特定成分并不能反映其内在质量，因此作者试图尝试测定胃脘舒冲剂中芍药苷、橙皮苷和甘草酸的含量，从而探索指标性成分分析的可行性，并利用三维高效液相色谱法对胃脘舒冲剂进行了定性鉴别，以达到控制其质量的目的。
1 材料和方法
1.1 仪器及试药：岛津液相色谱仪(泵：LC-10AD，二极管阵列检测器：SPD-10Avp，LC工作站：CLASS-LC10)，超声波振荡器(上海必能信超声有限公司，SB5200，频率50 kHz)，乙腈(HPLC级)，冰醋酸(分析纯)，甲醇(HPLC级)，甘草酸单铵盐、芍药苷、橙皮苷标准品均由中国药品生物制品检定所提供，药材及制剂由上海长海医院提供。
, 百拇医药
1.2 标准贮备液的制备：分别精密称取甘草酸单铵盐10.50mg、芍药苷8.4mg和橙皮苷7.45mg，放入10 mL量瓶中，用甲醇定容。
1.3 供试品药液的制备：取胃脘舒冲剂粉末约0.5g，放入25mL量瓶中，加入50%甲醇20mL，超声振荡提取1h，冷却后3000r/min离心6min，取2.5mL放10mL量瓶中，加甲醇定容后1×104r/min离心4min，微孔滤膜(0.45μm)过滤；各单味中药及缺一味的模拟冲剂，按制备工艺处理，以同样方法提取，分别制备成供试品药液。
1.4 色谱条件：色谱柱：Shim-pack CLC-ODS(6.0 mm×150mm，5μm)，流速：1.2mL/min，流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液，梯度洗脱程序如下：0→15min，乙腈20%；15→25min，乙腈20%→50%，线性洗脱；25→35min，乙腈50%，分离结果见图1。
, 百拇医药
A-芍药苷、橙皮苷和甘草酸标准品 B-阴性药液 C-胃脘舒冲剂
1-芍药苷 2-橙皮苷 3-甘草酸
图1 样品HPLC图
2 结果
2.1 定性鉴别：按上述所选的色谱条件，分别绘制单味中药、缺一味中药的模拟药液及供试品药液的三维图谱，经对照分析，处方中的甘草、陈皮和芍药有特征吸收峰，可被确认。三维鉴定图谱见图2。山楂、党参在所选的波长范围无特征吸收峰，延胡索所含成分峰吸收强度较弱，有的峰被其它组分峰掩盖，故未被确认。
2.2 标准曲线制备：分别取甘草酸单铵盐、芍药苷和橙皮苷适量，置10 mL量瓶中，用甲醇定容配制成系列浓度，进样10 μL，进行梯度洗脱，以对照品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，各指标性成分的线性范围、检测波长及相关系数见表1。
, 百拇医药
由表1可见，各标准对照品在所选的浓度范围内线性关系良好。
2.3 干扰试验：为考察其他药材对所测定的3种组分有无干扰，我们制备了缺上述3种药材的阴性药液，从图1可见，其他药材对测定无干扰。
1、7-白芍 2-芍药苷 3，4，8，9，10，11，12，13-甘草 5-陈皮 6-橙皮苷 14-甘草酸
图2 胃脘舒冲剂三维HPLC图
, 百拇医药
表1 指标性成分的线性范围、检测波长、保留时间、回归方程及相关系数
指标性成分
线性范围(μg/mL)
检测波长(nm)
保留时间(min)
回归方程
芍药苷
4.23～67.68
230
6.40
A=-9594.04+21993.20C(r=0.9999)
, 百拇医药
橙皮苷
7.50～119.20
283
17.24
A=32201.04+6817.22C(r=0.9998)
甘草酸
10.50～168.00
254
27.76
A=30722.46+5062.23C(r=0.9994)
2.4 精密度试验：取供试品药液10μL进样，重复测定5次，各组分的RSD分别为：甘草酸1.66%，芍药苷2.03%，橙皮苷0.85%。
, 百拇医药
2.5 加样回收率：取已知含量同一批号样品的0.5g，分别加入各标准对照品适量，按供试品药液的制备方法提取，进样10μL，按色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表2。
表2 芍药苷、橙皮苷、甘草酸的加样回收率
组分
已知含量
(mg)
加入量
(mg)
测得总量
(mg)
回收率
(%)
, 百拇医药
平均回收率
(%)
RSD(n=3)
(%)
0.5016
1.1343
88.47
芍药苷
0.5491
0.7152
1.2098
92.38
89.46±2.57
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2.87
0.5026
1.1287
87.54
1.0314
1.8966
96.31
橙皮苷
1.1291
0.8983
1.9665
93.22
93.76±2.32
, 百拇医药
2.48
1.0335
1.8578
91.76
1.5799
2.5265
90.15
甘草酸
1.7296
1.0500
2.6603
88.64
90.22±1.61
, 百拇医药
1.79
1.5831
2.5476
91.86
2.6 样品测定：取两个批号的供试品液，进样10μL，按标准曲线计算含量，结果见表3。
表3 样品测定结果(n=3)
批号
甘草酸
(mg/g)
RSD
(%)
芍药苷
, 百拇医药
(mg/g)
RSD
(%)
橙皮苷
(mg/g)
RSD
(%)
980121
3.1616±0.0747
2.36
0.9298±0.0238
2.56
2.2061±0.0394
, 百拇医药
1.78
980331
3.1373±0.2157
6.87
0.9960±0.0217
2.18
2.0481±0.0792
3.86
3 讨论
3.1 本文采用乙腈-0.1%醋酸水溶液作为洗脱系统，应用二元高压梯度洗脱方式使待测组分30 min内出峰，一次进样即可完成3种性质不同组分的定性、定量，缩短了分析时间，提高了分析效率。
3.2 中药复方是由多种指标性成分协同作用而发挥效应，作者应用二极管阵列检测器的多通道检测功能，选择各个待测指标性成分的最大吸收波长检测，达到了多种成分同时定量的目的，同时也避免了常用UV检测器只能在单一波长下同时检测几种物质所引起的灵敏度低的问题。本文选择了230 nm测定芍药苷，254 nm测定甘草酸，283 nm测定橙皮苷。
3.3 在实验过程中发现，各单味药材按工艺制备提取后，三维图谱有特定吸收峰的位置在供试品药液相应位置上出现了无峰和峰变小现象，这也说明各味药材在工艺制备中存在着相互作用。
收稿日期：1998-11-25, http://www.100md.com(宋洪杰* 胡晋红 全山丛)