紫杉醇和三尖杉磷碱在多孔硅胶上的吸附及扩散研究△
作者：杨 军* 郝雅琳 元英进**
单位：天津大学天然产物工程研究中心 300072
关键词：紫杉醇；三尖杉磷碱；吸附；扩散
中草药991009 摘 要 吸附和扩散特性是进行色谱过程的基础，本文测定了紫杉醇及其类似物三尖杉磷碱在多孔硅胶上的吸附及扩散特性，结果表明：紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上的吸附不符合Langmuir单分子层吸附理论，但在低浓度下可用溶剂调整型Langmuir模型描述。扩散研究表明：紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上吸附较弱，表面扩散可以忽略。相同条件下，紫杉醇的吸附量受强溶剂影响较大，强溶剂组成的增加会造成紫杉醇吸附量很快下降，这和在正相色谱中紫杉醇先于三尖杉磷碱流出色谱柱的事实是相符的。
Studies on the Adsorption and Diffusivity of Paclitaxel and Cephalomanine on Porous Gel
, 百拇医药
Yang Jun, Hao Yalin and Yuan Yingjin
(The Natural Product Research Center of Tianjin University,Tianjin 300072)
Abstract Adsorption and diffusivity behavior of paclitaxel and cephalomanine on porous gel during chromatographic separation were studied. Results showed that their adsorption did not follow Langmuir model, but at low concentrations of the solute, the solvent modulated Langmuir model could be followed and gave satisfactory results. As to their diffusivity, the rate on the surface of the absorbent could be negelected due to the fact that both paclitaxel and cephalomanine were very little adsorbed. Under the same condition, the increase of strong solvent resulted in a greater influence on the adsorption of paclitaxel by decreasing its adsorption rapidly as compared with cephalomanine.
, 百拇医药
Key words paclitaxel cephalomanine adsorption diffusivity
紫杉醇是目前世界范围内广泛开展研究的一种新型抗癌药物[1]，在自然界分布稀少，分离纯化非常困难，色谱过程是这一问题的关键步骤。Wu[2]等人研究了反相系统中紫杉醇和三尖杉磷碱在树脂上的吸附特性，指出低浓度时可用溶剂调整型Langmuir模型描述，但没有报道正相系统的研究结果。吸附特性和多孔介质内的扩散行为是溶质进行色谱过程的基础，由于硅胶柱正相色谱的广泛应用(本实验室采用正相色谱提纯了紫杉醇及其一系列类似物)，我们对紫杉醇及其类似物三尖杉磷碱于有机溶剂中在硅胶上的吸附和扩散行为进行了研究。紫杉醇和三尖杉磷碱是紫杉烷类中分子结构最为接近的两个物质，这两种物质的分离也是紫杉醇分离纯化的主要问题。因此，本文的研究对于紫杉醇的正相色谱行为具有指导意义。
1 参数估计理论
, 百拇医药
为进行固定相粒子的表面和孔内扩散参数的预测，可做以下假设：①假定粒子中孔扩散和表面扩散同时存在；②孔扩散系数和表面扩散系数在吸附过程中保持恒定；③粒子的孔径和孔隙率在吸附过程中保持不变；④孔内溶质的浓度和孔壁上溶质浓度保持平衡；⑤吸附过程中液相主体浓度保持恒定。
根据上述假设，可得下面的物料衡算方程：
(1)
令X=C/C0,τp=Dpt/r20,ρ=r/r0,α=q0/εC0,β=αDs/Dp,Y=q/q0，将(1)式无因次化〔其中C为硅胶孔中溶质的浓度(mg/L)，r0为硅胶颗粒半径(m)，Dp为孔扩散系数(m2/s)，q为吸附量(mg/g)，Ds为表面扩散系数(m2/s)，τp为Dpt/r20，ρ为r/r0，ε为硅胶孔隙率，β为αDs/Dp，α为q0/εC0，q0是和溶质主体浓度(mg/L)C0成平衡的固相浓度(mg/g)〕，可得：
, 百拇医药
(2)
吸附等温线用Langmuir表示，则可得：
(3)
初始条件：τp=0,Y=0
边界条件：ρ=0时，
时，Y=1
由于能检测的一般是溶质在粒子内总的浓度Q，因此，可以通过下式定义一个平衡分数F：
Q=q+εC
(4)
(式Q为按式5定义的吸附量)
, 百拇医药
(5)
(式中Q0按式6定义的吸附量)
其中Q0=q0+εC0
如果假定具有孔扩散和表面扩散的过程可以用一个具有有效扩散系数的费克扩散来代替，则可获得在时间较短时平衡分数的解为：
(6)
(式中F为平衡分数)
式(6)显示在短时间内F和t1/2成正比，Deff可以通过对t1/2作图的斜率获得。
, 百拇医药
根据平行扩散(孔扩散和表面扩散同时存在的扩散)和费克扩散可以近似获得下式：
(7)
(Deff为孔内有效扩散系数，m2/s)
如果近似以C0/q0代替dc/dq，并将α=q0/εC0代入，则可得：
(8)
(Dpa为按斜率计算的近似孔扩散系数)
, 百拇医药
因为C0/q0并不等于dc/dq，所以上式中用Dpa代替Dp。如果等温线线性，则有Dpa=Dp。
如果式(8)描绘的直线截距是0，则为孔扩散控制，如果斜率是0，则为表面扩散控制。
2 材料与方法
2.1 材料：实验用的多孔硅胶购自青岛海洋化工厂，平均粒径为250目。紫杉醇和三尖杉磷碱由本实验室提供，纯度超过99%。有机溶剂二氯甲烷和乙酸乙酯工业级，用时自行蒸馏除去不挥发物并用氯化钙脱水。
2.2 实验方法
2.2.1 吸附等温线测定方法：在电子天平上精确称取定量溶质置于锥形瓶中，在其中加入定量溶剂，配成2，1，0.5，0.3，0.1和0.05 g/L浓度的溶液，HPLC上测定其吸收峰，做一条标准曲线，用于计算吸附后溶液中溶质的含量。将锥形瓶置于恒温摇床内，间隔取样直至溶液中溶质浓度不变为止。实验过程中发现，紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上吸附很快，约5 min就可达到平衡。将初始浓度减去平衡后浓度，乘以溶液体积可得吸附量，进而可得单位量硅胶上的平衡吸附量。
, 百拇医药
2.2.2 扩散系数计算方法：同样将不同量溶质溶于一定量溶剂配成不同浓度的溶液，内加适量硅胶，间隔1 min取样测定，计算不同时间的吸附量，按照上述理论计算平衡分数F，得出有效扩散系数Deff，从而可以作图计算孔扩散系数和表面扩散系数。
3 结果与讨论
3.1 硅胶的空隙率：硅胶空隙率用液氮法测定，利用氮气低温下在毛细管内凝结的特性可以测定定量硅胶的总孔体积，再根据硅胶的真密度可以算出硅胶的空隙率。实验用的硅胶经测定空隙率为0.39%。
3.2 紫杉醇和三尖杉磷碱的吸附等温线：见图1，2。
图1 紫杉醇的吸附等温曲线
, 百拇医药
图2 三尖杉磷碱的吸附等温曲线
上两图是紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上的吸附等温线，测定温度为16 ℃，4条线从上至下溶剂的配比二氯甲烷-乙酸乙酯为10∶0，9∶1，8∶2和7∶3。其中三尖杉磷碱的吸附等温线没有在7∶3配比的溶剂中测定，但规律已经能够显示出来。
由图上看，在整个浓度范围内，紫杉醇和三尖杉磷碱的吸附均不符合Langmuir单分子层吸附理论，呈现出比较复杂的吸附特性。在溶质浓度较低时，由于吸附较弱，吸附量较小，吸附过程可以看作单分子层吸附。按Snyder[3]等人的研究，吸附过程受溶剂相中强溶剂浓度的影响(所谓强溶剂，是指溶剂相组成中在固定相上吸附性较强的溶剂。例如，对于硅胶柱洗脱紫杉醇用的乙腈-水中的乙腈，丙酮-环己烷中的丙酮等，本实验溶剂配比中乙酸乙酯为强溶剂)，通常采用溶剂调整型Langmuir模型进行数据关联，在溶质浓度很低时，模型方程为：
, http://www.100md.com q(φ)=a0exp(-Saφ)C
(9)
较低浓度时的吸附关系以1/q对1/c作图如图3和4所示，可以看出在不同溶剂配比时均能获得直线关系，可见在低浓度时用(9)式描述是合适的。根据直线的斜率，做回归分析可以得到(9)式中常数a0和Sa的值，结果如下：
taxol：q(φ)=1.24exp(-16.59φ)c
(10)
ceph：q(φ)=0.37exp(-14.15φ)c
(11)
上两式显示，紫杉醇受强溶剂组成的影响较大，强溶剂组成增加会造成紫杉醇吸附量的快速下降，这和前面吸附等温线表现出来的趋势是一致的。
, 百拇医药
图3 低浓度时紫杉醇的吸附等温线
图4 低浓度时三尖杉磷碱的吸附等温线
3.3数F，将F对t1/2作图如图5和6所示。 有效扩散系数：按照前面理论中的方法计算平衡分
按照直线的斜率(Deff/r20π)1/2计算Deff，计算结果列于表1中。
表1 298K时紫杉醇和三尖杉磷碱在多孔硅胶孔内的有效扩散系数 taxol
cephalmonnine
c0
, http://www.100md.com
(g/L)
Deff×1013
(m/L)
co
(g/L)
Deff×1013
(m2/L)
2.0
4.09
0.5
28.6
, 百拇医药
1.5
3.26
0.4
28.5
1.0
0.98
0.3
26.5
0.5
0.46
0.1
155
, 百拇医药
图5 按方程(6)计算的F和t0.5关系曲线
表1显示，三尖杉磷碱在硅胶内的有效扩散系数要大于紫杉醇，而且两者的有效扩散系数都是随浓度的增加而增加。
图6 按方向(6)计算的三尖杉磷碱F和t0.5关系曲线
3.4 表面扩散和孔扩散系数：根据本文前面所述，用Deff(1+
)对作图，可得一直线关系，如图7所示：从图显示了较好的直线关系，其中紫杉醇的精度较差，可能是因为选择的溶质浓度较大，吸附等温线的线性关系较差的原因。由直线的斜率和截距可以求得孔和表面扩散系数，结果为：
, 百拇医药
taxol：Dp=4.61×10-11m2/s, Ds=0 m2/s
ceph：Dp=1.36×10-9，Ds=0.47×10-12
图7 按方程(8)计算的Deff和1/α关系曲线
前面已经述及，紫杉醇在硅胶内的扩散较弱，表面扩散可以忽略，而三尖杉磷碱的有效扩散系数较大，因此有表面扩散现象存在，但仍然很小，比孔扩散低三个数量级，这一点和Wang[4]的结论是相符的。可以推测，在增加强溶剂的组成时，由于吸附量大大下降，紫杉醇和三尖杉磷碱的扩散系数也会相应减小。在二氯甲烷-乙酸乙酯为9∶1的溶剂配比中紫杉醇的扩散结果为Dp=1.03×10-11，Ds=0证实了这一点。
, 百拇医药
4 结论
在整个浓度范围内紫杉醇和三尖杉磷碱的吸附等温线不遵从Langmuir单分子层吸附理论描述，但在溶质浓度较低时，溶剂调整型Langmuir模型可以很好地进行拟合。紫杉醇在硅胶中的扩散要弱于三尖杉磷碱，两者在硅胶中表现扩散系数均可以忽略。紫杉醇相比于三尖杉磷碱在硅胶上的吸附受强溶剂的影响较大，强溶剂组成的增加会造成紫杉醇吸附量的显著下降，这和在正相系统中采用二氯甲烷和乙酸乙酯作洗脱剂进行洗脱时紫杉醇先于三尖杉磷碱流出色谱柱的事实是相符合的。
参考文献
1 俞天骥.国外医学-药学分册，1993，(20)：27
2 Wu D J.AIChE Journal,1997,43:232
3 Synder L R. J Chromatog,1979,165:3
4 Ma Z, et al. AIChE Journal,1996，42：1244
收稿日期：1998-12-14, 百拇医药(杨 军* 郝雅琳 元英进**)
单位：天津大学天然产物工程研究中心 300072
关键词：紫杉醇；三尖杉磷碱；吸附；扩散
中草药991009 摘 要 吸附和扩散特性是进行色谱过程的基础，本文测定了紫杉醇及其类似物三尖杉磷碱在多孔硅胶上的吸附及扩散特性，结果表明：紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上的吸附不符合Langmuir单分子层吸附理论，但在低浓度下可用溶剂调整型Langmuir模型描述。扩散研究表明：紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上吸附较弱，表面扩散可以忽略。相同条件下，紫杉醇的吸附量受强溶剂影响较大，强溶剂组成的增加会造成紫杉醇吸附量很快下降，这和在正相色谱中紫杉醇先于三尖杉磷碱流出色谱柱的事实是相符的。
Studies on the Adsorption and Diffusivity of Paclitaxel and Cephalomanine on Porous Gel
, 百拇医药
Yang Jun, Hao Yalin and Yuan Yingjin
(The Natural Product Research Center of Tianjin University,Tianjin 300072)
Abstract Adsorption and diffusivity behavior of paclitaxel and cephalomanine on porous gel during chromatographic separation were studied. Results showed that their adsorption did not follow Langmuir model, but at low concentrations of the solute, the solvent modulated Langmuir model could be followed and gave satisfactory results. As to their diffusivity, the rate on the surface of the absorbent could be negelected due to the fact that both paclitaxel and cephalomanine were very little adsorbed. Under the same condition, the increase of strong solvent resulted in a greater influence on the adsorption of paclitaxel by decreasing its adsorption rapidly as compared with cephalomanine.
, 百拇医药
Key words paclitaxel cephalomanine adsorption diffusivity
紫杉醇是目前世界范围内广泛开展研究的一种新型抗癌药物[1]，在自然界分布稀少，分离纯化非常困难，色谱过程是这一问题的关键步骤。Wu[2]等人研究了反相系统中紫杉醇和三尖杉磷碱在树脂上的吸附特性，指出低浓度时可用溶剂调整型Langmuir模型描述，但没有报道正相系统的研究结果。吸附特性和多孔介质内的扩散行为是溶质进行色谱过程的基础，由于硅胶柱正相色谱的广泛应用(本实验室采用正相色谱提纯了紫杉醇及其一系列类似物)，我们对紫杉醇及其类似物三尖杉磷碱于有机溶剂中在硅胶上的吸附和扩散行为进行了研究。紫杉醇和三尖杉磷碱是紫杉烷类中分子结构最为接近的两个物质，这两种物质的分离也是紫杉醇分离纯化的主要问题。因此，本文的研究对于紫杉醇的正相色谱行为具有指导意义。
1 参数估计理论
, 百拇医药
为进行固定相粒子的表面和孔内扩散参数的预测，可做以下假设：①假定粒子中孔扩散和表面扩散同时存在；②孔扩散系数和表面扩散系数在吸附过程中保持恒定；③粒子的孔径和孔隙率在吸附过程中保持不变；④孔内溶质的浓度和孔壁上溶质浓度保持平衡；⑤吸附过程中液相主体浓度保持恒定。
根据上述假设，可得下面的物料衡算方程：
(1)
令X=C/C0,τp=Dpt/r20,ρ=r/r0,α=q0/εC0,β=αDs/Dp,Y=q/q0，将(1)式无因次化〔其中C为硅胶孔中溶质的浓度(mg/L)，r0为硅胶颗粒半径(m)，Dp为孔扩散系数(m2/s)，q为吸附量(mg/g)，Ds为表面扩散系数(m2/s)，τp为Dpt/r20，ρ为r/r0，ε为硅胶孔隙率，β为αDs/Dp，α为q0/εC0，q0是和溶质主体浓度(mg/L)C0成平衡的固相浓度(mg/g)〕，可得：
, 百拇医药
(2)
吸附等温线用Langmuir表示，则可得：
(3)
初始条件：τp=0,Y=0
边界条件：ρ=0时，
时，Y=1由于能检测的一般是溶质在粒子内总的浓度Q，因此，可以通过下式定义一个平衡分数F：
Q=q+εC
(4)
(式Q为按式5定义的吸附量)
, 百拇医药
(5)
(式中Q0按式6定义的吸附量)
其中Q0=q0+εC0
如果假定具有孔扩散和表面扩散的过程可以用一个具有有效扩散系数的费克扩散来代替，则可获得在时间较短时平衡分数的解为：
(6)
(式中F为平衡分数)
式(6)显示在短时间内F和t1/2成正比，Deff可以通过对t1/2作图的斜率获得。
, 百拇医药
根据平行扩散(孔扩散和表面扩散同时存在的扩散)和费克扩散可以近似获得下式：
(7)
(Deff为孔内有效扩散系数，m2/s)
如果近似以C0/q0代替dc/dq，并将α=q0/εC0代入，则可得：
(8)
(Dpa为按斜率计算的近似孔扩散系数)
, 百拇医药
因为C0/q0并不等于dc/dq，所以上式中用Dpa代替Dp。如果等温线线性，则有Dpa=Dp。
如果式(8)描绘的直线截距是0，则为孔扩散控制，如果斜率是0，则为表面扩散控制。
2 材料与方法
2.1 材料：实验用的多孔硅胶购自青岛海洋化工厂，平均粒径为250目。紫杉醇和三尖杉磷碱由本实验室提供，纯度超过99%。有机溶剂二氯甲烷和乙酸乙酯工业级，用时自行蒸馏除去不挥发物并用氯化钙脱水。
2.2 实验方法
2.2.1 吸附等温线测定方法：在电子天平上精确称取定量溶质置于锥形瓶中，在其中加入定量溶剂，配成2，1，0.5，0.3，0.1和0.05 g/L浓度的溶液，HPLC上测定其吸收峰，做一条标准曲线，用于计算吸附后溶液中溶质的含量。将锥形瓶置于恒温摇床内，间隔取样直至溶液中溶质浓度不变为止。实验过程中发现，紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上吸附很快，约5 min就可达到平衡。将初始浓度减去平衡后浓度，乘以溶液体积可得吸附量，进而可得单位量硅胶上的平衡吸附量。
, 百拇医药
2.2.2 扩散系数计算方法：同样将不同量溶质溶于一定量溶剂配成不同浓度的溶液，内加适量硅胶，间隔1 min取样测定，计算不同时间的吸附量，按照上述理论计算平衡分数F，得出有效扩散系数Deff，从而可以作图计算孔扩散系数和表面扩散系数。
3 结果与讨论
3.1 硅胶的空隙率：硅胶空隙率用液氮法测定，利用氮气低温下在毛细管内凝结的特性可以测定定量硅胶的总孔体积，再根据硅胶的真密度可以算出硅胶的空隙率。实验用的硅胶经测定空隙率为0.39%。
3.2 紫杉醇和三尖杉磷碱的吸附等温线：见图1，2。
图1 紫杉醇的吸附等温曲线
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图2 三尖杉磷碱的吸附等温曲线
上两图是紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上的吸附等温线，测定温度为16 ℃，4条线从上至下溶剂的配比二氯甲烷-乙酸乙酯为10∶0，9∶1，8∶2和7∶3。其中三尖杉磷碱的吸附等温线没有在7∶3配比的溶剂中测定，但规律已经能够显示出来。
由图上看，在整个浓度范围内，紫杉醇和三尖杉磷碱的吸附均不符合Langmuir单分子层吸附理论，呈现出比较复杂的吸附特性。在溶质浓度较低时，由于吸附较弱，吸附量较小，吸附过程可以看作单分子层吸附。按Snyder[3]等人的研究，吸附过程受溶剂相中强溶剂浓度的影响(所谓强溶剂，是指溶剂相组成中在固定相上吸附性较强的溶剂。例如，对于硅胶柱洗脱紫杉醇用的乙腈-水中的乙腈，丙酮-环己烷中的丙酮等，本实验溶剂配比中乙酸乙酯为强溶剂)，通常采用溶剂调整型Langmuir模型进行数据关联，在溶质浓度很低时，模型方程为：
, http://www.100md.com q(φ)=a0exp(-Saφ)C
(9)
较低浓度时的吸附关系以1/q对1/c作图如图3和4所示，可以看出在不同溶剂配比时均能获得直线关系，可见在低浓度时用(9)式描述是合适的。根据直线的斜率，做回归分析可以得到(9)式中常数a0和Sa的值，结果如下：
taxol：q(φ)=1.24exp(-16.59φ)c
(10)
ceph：q(φ)=0.37exp(-14.15φ)c
(11)
上两式显示，紫杉醇受强溶剂组成的影响较大，强溶剂组成增加会造成紫杉醇吸附量的快速下降，这和前面吸附等温线表现出来的趋势是一致的。
, 百拇医药
图3 低浓度时紫杉醇的吸附等温线
图4 低浓度时三尖杉磷碱的吸附等温线
3.3数F，将F对t1/2作图如图5和6所示。 有效扩散系数：按照前面理论中的方法计算平衡分
按照直线的斜率(Deff/r20π)1/2计算Deff，计算结果列于表1中。
表1 298K时紫杉醇和三尖杉磷碱在多孔硅胶孔内的有效扩散系数 taxol
cephalmonnine
c0
, http://www.100md.com
(g/L)
Deff×1013
(m/L)
co
(g/L)
Deff×1013
(m2/L)
2.0
4.09
0.5
28.6
, 百拇医药
1.5
3.26
0.4
28.5
1.0
0.98
0.3
26.5
0.5
0.46
0.1
155
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图5 按方程(6)计算的F和t0.5关系曲线
表1显示，三尖杉磷碱在硅胶内的有效扩散系数要大于紫杉醇，而且两者的有效扩散系数都是随浓度的增加而增加。
图6 按方向(6)计算的三尖杉磷碱F和t0.5关系曲线
3.4 表面扩散和孔扩散系数：根据本文前面所述，用Deff(1+
)对作图，可得一直线关系，如图7所示：从图显示了较好的直线关系，其中紫杉醇的精度较差，可能是因为选择的溶质浓度较大，吸附等温线的线性关系较差的原因。由直线的斜率和截距可以求得孔和表面扩散系数，结果为：, 百拇医药
taxol：Dp=4.61×10-11m2/s, Ds=0 m2/s
ceph：Dp=1.36×10-9，Ds=0.47×10-12
图7 按方程(8)计算的Deff和1/α关系曲线
前面已经述及，紫杉醇在硅胶内的扩散较弱，表面扩散可以忽略，而三尖杉磷碱的有效扩散系数较大，因此有表面扩散现象存在，但仍然很小，比孔扩散低三个数量级，这一点和Wang[4]的结论是相符的。可以推测，在增加强溶剂的组成时，由于吸附量大大下降，紫杉醇和三尖杉磷碱的扩散系数也会相应减小。在二氯甲烷-乙酸乙酯为9∶1的溶剂配比中紫杉醇的扩散结果为Dp=1.03×10-11，Ds=0证实了这一点。
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4 结论
在整个浓度范围内紫杉醇和三尖杉磷碱的吸附等温线不遵从Langmuir单分子层吸附理论描述，但在溶质浓度较低时，溶剂调整型Langmuir模型可以很好地进行拟合。紫杉醇在硅胶中的扩散要弱于三尖杉磷碱，两者在硅胶中表现扩散系数均可以忽略。紫杉醇相比于三尖杉磷碱在硅胶上的吸附受强溶剂的影响较大，强溶剂组成的增加会造成紫杉醇吸附量的显著下降，这和在正相系统中采用二氯甲烷和乙酸乙酯作洗脱剂进行洗脱时紫杉醇先于三尖杉磷碱流出色谱柱的事实是相符合的。
参考文献
1 俞天骥.国外医学-药学分册，1993，(20)：27
2 Wu D J.AIChE Journal,1997,43:232
3 Synder L R. J Chromatog,1979,165:3
4 Ma Z, et al. AIChE Journal,1996，42：1244
收稿日期：1998-12-14, 百拇医药(杨 军* 郝雅琳 元英进**)