CD14在LPS介导Kupffer细胞激活中的作用
作者：龚建平 韩本立
单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院肝胆外科中心 重庆市 400038
关键词：多器官损伤；CD14；脂多糖；Kupffer细胞
中国图书馆分类号 R362中国图书馆分类号 R362
Subject headings multiple organs damages; CD14；lipopolysaccharide; Kupffer cell
感染，特别是脓毒血症(sepsis)至今仍是造成临床患者发生多脏器损伤(multiple organs damages, MOD)甚至死亡的主要原因之一. 感染造成MOD的重要机制是内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)释放多种细胞因子如TNF-α，IL-1，IL-6，NO等产生的介质病. Kupffer细胞(KC)占整个MPS的80%～90%，是体内最大的固定巨噬细胞群；KC位于肝血窦内，与从肠道进入门静脉血的LPS密切接触；因此，它在机体防御及介导MOD两方面都起重要作用[1]. 近年来人们对LPS介导KC激活的机制进行了大量研究，特别是对脂多糖受体(LPS receptor)——CD14在LPS介导KC激活机制中的作用进行了深入细致的观察[2，3]，并取得了实质性进展，现综述如下.
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1 CD14的结构特征和分类
人类CD14的完整结构是从其基因克隆推测得知的[4]，它的基因位于包含有生长因子及其受体区域的第五对染色体上，而从cDNA推测出的兔和小鼠CD14的完整结构提示它们同人类的CD14的氨基酸序列具有高度的同源性. McGinley et al[5]采用内源性蛋白酶Asp-N溶解法，发现CD14的第57，59，65位点的天门冬氨基酸残基对Asp-N切开(cleavage)起反应，而Asp-N对CD14-LPS复合体的氨基酸残基则无此作用，说明CD14蛋白质分子的氨基酸序列中的57～64位点是LPS的结合点. Viriyakosol et al[6]用基因突变策略进一步证实CD14的N末端第65位氨基酸是与其结合及其信号传导的关键部位. CD14与已知的蛋白质无明显的序列同源，其最主要的可认识的结构特征是存在重复的富含亮氨酸结构的模体符(motifs)，这一序列的功能尚不清楚. 除了作为LPS受体外，CD14还有促使蛋白质与蛋白质相互作用的功能特征，如它能促使巨噬细胞粘附到激活的内皮细胞和T细胞上.
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CD14存在两种类型：在髓样细胞中，CD14以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白形式表达CD14(mCD14)，但在其他一些细胞如内皮细胞和上皮细胞上因缺乏GPI，CD14以可溶性形式(sCD14)存在于血浆内. CD14的羧基末端区域的GPI粘附位点尚不清楚. 阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)患者的髓样细胞缺乏mCD14，但他们血中仍能表达sCD14. PNH患者的sCD14与正常人血浆CD14是否一致仍需进一步研究. 没有一种生理机制能全面解释sCD14的产生和来源，但几种可能的机制是：①加磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C到CD14阳性的细胞中能释放CD14；②在蛋白酶作用下，CD14也能从原生质膜上释放；③虽然特异性的酶仍未被鉴别，一种细胞磷脂酶D也显示能释放GPI锚定的蛋白质；另外，一些sCD14可能直接从髓样细胞系中分泌而来. 还有资料显示髓样细胞外能合成CD14，这为sCD14的产生提供了另一潜在位点[4].
2 CD14作为LPS受体的功能
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LBP作为一种LPS调理素的功能包括促进G-菌或LPS包裹的RBC(E-LPS)粘附到髓样细胞上，当E-LPS与LBP混合时，这些颗粒与单核巨噬细胞(moncytes/macrosphages，MO)形成玫瑰花形，它们的数量能用显微镜定量，这一方法首先确定了CD14是LPS(或LPS-LBP)的受体[7]. 应用移动的受体下调方法(mobile receptor downmodulation)揭示用抗CD14单抗(而不是其他的MO表面蛋白单抗)覆盖MO的表面，显著减少了E-LPS-LBP和人类MO之间的玫瑰花形形成. 几个另外的证据也支持CD14是LPS或LPS-LBP复合体受体的观点，用抗CD14单抗或用磷酯酰肌醇特异性磷酯酶C预处理细胞，可阻止E-LPS-LBP玫瑰花形形成.
关于LPS结合到mCD14的亲合力及化学计量的测量，Kirkland et al[8]用稳定的转染CHO-K1细胞(能表达CD14)和单核细胞系THP-1进行了研究. LPS与CD14结合是快速的、相对独立于温度的. 通过磷酯酰肌醇特异性磷酯酶C处理后，95%以上的结合3H-LPS能被释放出来，一系列的抗CD14单抗能抑制LPS结合到CD14. CD14与LPS结合的恒定常数为3×10-8mol/L，LPS与CD14结合比例为1∶1以上. CD14是否有多个位点尚不清楚. 虽然LBP/LPS的研究对进一步帮助我们认识LPS激活细胞方面迈进了很大一步. 它也提出了很多重要而现在尚不能回答的问题，如mCD14这样一种不能与细胞内联系的GPI锚定蛋白怎样调节配体特异性细胞的结合信号怎样通过GPI锚定蛋白转导到胞内也困惑着我们. 在考虑到CD14怎样参与信号传递之前，首先研究其他GPI锚定蛋白是怎样转导信号是重要的. 在细胞激活中，有很多GPI锚定蛋白参与，虽然在绝大多数情况下，这些蛋白的特殊配体尚未被认识. 因此，细胞的激活通常是通过抗体诱导的交叉反应而开始的，很多模型已被用来解释这些蛋白是怎样转导信号的. 其中绝大多数模型中，一个重要的作用是涉及到GPI本身，即GPI锚定蛋白和Src样蛋白酪氨酸激酶相互连接，多数跨膜蛋白存在于这一联接中，特殊的脂质亚单位结构域(subdomain)可能也起作用. GPI锚定通过糖脂尾部水解释放的产物直接参与信号传导. 这些研究显示蛋白质的跨膜形式不能用GPI锚定或跨膜的CD73形式获得的结果相比较，而两种形式的CD73用抗体交联后均能激活细胞，有趣的是，后一研究证实附加的膜蛋白包括CD45、T细胞克隆性受体，Src家族酪氨酸激酶对CD73诱导的信号传导是必须的.
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有关CD14可以用生理配体LPS来研究信号传导. 为了解释mCD14作为LPS受体功能，目前提出了3种模型假说[4]：Model Ⅰ—单受体学说，当LPS或LPS-LBP复合体结合到mCD14后，信号传导开始，与细胞内的信息联系由一种能识别GPI锚定的跨膜蛋白质提供，相对而言，模型Ⅱ和Ⅲ则认为LPS受体是多聚体，mCD14是主要的配体结合亚单位，而附加的跨膜蛋白诱导信号传导. 多聚受体示范(paradigm)描述了许多细胞因子受体. Model Ⅱ认为与LPS结合后，mCD14经历了基本结构的变化，然后与跨膜信号分子相互作用，后者本身不与LPS结合. Model Ⅲ设想在缺乏CD14时，转导分子带着低的亲合力与LPS结合，这解释了非CD14途径在与LPS的结合中起重要作用，但另外的蛋白质在信号传导中也是必要的.
3 KC膜上CD14的表达
CD14是MO表面存在的LPS受体，在LPS的信息传递中起启动作用[3]. KC作为肝内固定的MO群，其细胞膜上CD14的表达存在特殊性. 用Western分析法显示重组mCD14的单抗能特异性地与小鼠巨噬细胞株J774发生反应，但不与髓瘤细胞株NS1反应. 荧光与免疫组化法提示rmC5-3能特异性地与KC结合；用rmc5-3免疫组化染色也显示在未受刺激小鼠的肝组织内，CD14染色阳性的KC数量少并且主要分布在中央区和门脉周围区，当其腹腔内注入内毒素(LPS)后，其数量逐渐增加，6h达高峰，20h后恢复正常. 而腹腔内MO膜上CD14的表达仅有轻度改变，提示LPS能上调KC膜上CD14的表达[9]. Tomita et al[10]通过对比正常人与慢性肝病患者的肝脏发现：正常肝组织内除肝窦内少数圆形细胞外，绝大多数KC不表达CD14，CD14染色阳性的KC多为圆形、多核，不同于典型的星形肝KC细胞. 但在AH和CAH，绝大多数KC CD14染色均为阳性. Tracy et al[11]通过结扎大鼠胆管造成瘀胆性肝损害，发现正常肝组织用免疫荧光染色无CD14阳性的KC细胞，Western法分析提示有低水平的CD14表达，而在病理性肝脏中，用间接荧光或用抗OX42或ED9的单抗行Western分析示KC表达CD14. 进一步用ED1和ED2染色发现胆管结扎3dED1与ED2阳性KC均增加，其中ED1>ED2. 两种抗体染色细胞数变化反应了两种来源的KC：ED-1 KC为外来细胞，而ED-2 KC为局部增生的KC，这表明CD14的功能与肝损害有密切联系，肝损害一开始，肝内固有的KC发生表型变化而表达CD14，同时血循环中MO聚集于肝内，共同形成肝内局部的免疫防御系统，通过释放细胞因子，应答LPS的刺激. 但是，有些细胞如70Z/3细胞不能表达CD14，仍能对LPS的刺激作出反应；仅表达少许CD14的KC细胞在缺乏血浆调理素情况下也能对LPS的刺激发生反应，且这类反应不被抗CD14单抗阻断，说明在KC内LPS信息传导的启动除CD14外，可能存在其他启动机制，如细胞膜上尚存一个辅助受体亚单位或第二受体[12]. 因此寻找出这些受体蛋白，不仅可丰富LPS受体激活KC的基本理论，也将为脓毒血症的治疗提供新靶位.
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4 CD14在LPS介导KC激活中的作用
目前认为，KC激活分四个阶段：①静止期(resident stage)，表现为KC数量少、形态小，多半位于肝窦内，CD14染色多为阴性；②反应期，表现为局部KC刺激性增生及全身MO肝内聚集；③准备期( primed stage)即KC表型发生转化，表现为CD14等细胞膜受体的出现和功能发生改变；④激活期，表现为核转录因子NF-kB的激活、分泌及表达各种细胞因子. 因此，CD14被认为是KC激活及其功能变化的特征性标志[11]. 有关CD14在LPS所致KC激活中的作用，目前尚存在争议. 主要表现在下列两个方面. 多数学者认为LPS介导KC的激活主要是通过CD14途径实现的. Matsuura et al[9]报道LPS可刺激KC CD14的上调；Tracy et al[11]也报道梗阻性黄疸时KC CD14的表达明显增强，高表达的CD14对LPS具有高敏性，这可能与血循环中MO肝内聚集有关；Gupta et al[13]用70Z/3型小鼠细胞转染人的CD14发现，当转染空载体时，70Z/3细胞对低浓度LPS无反应；但70Z/3 CD14细胞对低浓度LPS产生反应，表现为表面IgM的表达、NF-kB的激活和IkB的降解，而且LPS诱导的NF-kB能被抗CD14单抗抑制，CD14的N端156个氨基酸对LPS的反应是足够的，但CD14中N端65个氨基酸内的一个小片段发生缺失突变将显著减少对LPS的反应. 这一结果表明CD14是LPS的功能受体，它在LPS所致的KC内NF-kB激活和IgM的反应中起关键作用.
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但是，也有不少作者认为LPS介导KC激活不依赖CD14. Bellezzo et al[14]报道LPS刺激分离的KC NF-kB激活不依赖血浆的有无，提示CD14非依赖途径的存在；Lichtman et al[2]通过观测CD14在KC激活和TNF-A-α释放中的作用发现：①LPS刺激KC释放TNF-α的量与有无血浆无明显关系，但RAW264.7和腹腔巨噬细胞(利用CD14受体)在缺乏血浆时释放TNF-α的量明显减少；②用磷脂酰肌醇磷脂酶C处理CD14受体后，由于CD14被裂解，RAW264.7对LPS所致的TNF-α释放明显减少，但此酶对KC释放TNF-α无影响；③去酰基化的LPS(deacylated LPS, dLPS)与LPS按100∶1的比例竞争CD14受体，这种竞争可抑制RAW264.7中LPS刺激TNF-α的释放，但对KC无此作用；④Western分析和FACS(fluorescence-actived cell sorter)分析直接发现RAW264.7及腹腔MO上存在CD14，而KC上仅存在少量CD14，并且LPS刺激不增加小鼠KC上CD14的表达. 因此，他们认为分离的大、小鼠KC CD14的表达非常低，LPS刺激KC TNF-α的释放是不依赖CD14的.
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究竟CD14在LPS所致KC激活中起何作用呢近年来Perera et al[15]通过实验对此问题作了较为圆满的解释. 他们用正常或CD14基因敲除的小鼠实验发现，在低浓度LPS(<10ng/mL)刺激下，KC的激活是通过CD14实现的，因为正常KC在此条件下可诱导TNF-α，IL-2及干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10, IP-10)基因的表达. 但在高浓度LPS的条件下或在无血浆条件下，CD14在LPS介导KC激活中的作用就显得比较复杂，涉及CD14途径与非CD14途径，在反应初期，LPS首先与CD14受体结合，当CD14受体达到饱和后，LPS才与KC膜上其他LPS受体结合激活KC. Netea et al[16]也认为CD14依赖与非依赖途径可能涉及不同细胞因子的诱导，TNF-α的产生基本上是CD14依赖的，在有血浆时，LPS诱导IL-1的产生是CD14依赖的，但无血浆时，两条途径均被累及. 脂质A通过两条途径刺激KC合成和分泌细胞因子，但其作用明显低于LPS的刺激，说明LPS的多糖部分是LPS激活KC的关键部分.
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总之，有关LPS激活包括KC在内的MPS的机制及CD14在其中的作用已取得了突破性进展[17]，已证实LPS通过与KC膜上的mCD14结合而激活多级酶联反应将信号转导到细胞核内，再通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录，从而参与LPS诱导的KC反应. 然而，有关LPS激活KC的确切机制，仍有诸多问题有待进一步解决，例如，CD14跨膜信号分子的鉴定，膜内信号分子的传递，NF-kB等转录因子在LPS诱导蛋白基因表达中的调控作用等等. 因此，这方面的深入研究将对感染、脓毒血症、全身炎症反应综合征及MOD的理论和临床防治提供新的实验依据.
通讯作者：龚建平
参考文献
1 Ayala A, O'Neill P, Uebele SA, Herdon CD, Chaudry IH. Mechanism of splenic immunosuppression during sepsis: key role of Kupffer cell mediators. J Trauma: Injury, Infection, and Critical Care, 1997;42:882-888
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6 Viriyakosol S, Kirkland TN. A region of human CD14 required for lipopolysaccharide binding. J Biol Chem, 1995;270:361-368
7 Wright SD, Tobias PS, Ulevitch RJ, Ramos RA. Lipopolysaccharide (LPS) binding protein opsonizes LPS-bearing particles for recognition by a novel receptor on macrophages. J Exp Med, 1989;170:1231-1241
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8 Kirkland TN, Finley F, Leturcq D. Analysis of lipopolysaccharide binding by CD14. J Biol Chem, 1993;268:24818-24823
9 Matsuura BK, Ishida T, Setoguchi M, Higuchi Y, Akizuki S, Yamamoto S. Upregulation of mouse CD14 expression in Kupffer cells by lipopolysaccharide. J Exp Med, 1994;179:1671-1676
10 Tomita M, Yamamoto K, Kobashi H, Ohmoto M, Tsuji T. Immunohistochemical phenotyping of liver macrophages in normal and diseased human liver. Hepatology, 1994;20:317-325
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11 Tracy TF, Tox ES. CD14-lipopolysaccharide receptor activity in hepatic macrophages after cholestatic liver injury. Surgery, 1995;118:371-377
12 Viriyakosol S, Kirkland T. Knowledge of cellular receptors for bacterial endotoxin-1995. Clin Infect Dis, 1995;21(Suppl 2):S190-195
13 Gupta D, Kirkland TN, Viriyakosol S, Dziarski R. CD14 is a cell-activating receptor for bacterial peptidoglycan. J Biol Chem, 1996;271:23310-23316
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14 Bellezzo JM, Britton RS, Bacon BR, Fox ES. LPS-mediated NK-kB activation in rat Kupffer cells can be induced independently of CD14. Am J Physiol, 1996;270:G956-961
15 Perera PY, Vogel SN, Detore GR, Haziot A, Goyert SA. CD14-Dependent and CD14-independent signaling pathways in murine macrophages from normal and CD14 knockout mice stimulated with lipopolysaccharide or taxol. J Immunol, 1997;158:4422-4429
16 Netea MG, Kullberg BJ, Meer WM. Lipopolysaccharide-induced production of tumour necrosis factor and interleukin-1 is differentially regulated at the receptor level: the role of CD14-dependent and CD14-independent pathways. Immunology, 1998;94:340-344
17 姜勇，Ulevitch RJ. LPS介导细胞激活的信号转导：从CD14到p38MAPK通路的研究. 生理科学进展，1999；30：29-34
收稿日期 1999-04-15, http://www.100md.com
单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院肝胆外科中心 重庆市 400038
关键词：多器官损伤；CD14；脂多糖；Kupffer细胞
中国图书馆分类号 R362中国图书馆分类号 R362
Subject headings multiple organs damages; CD14；lipopolysaccharide; Kupffer cell
感染，特别是脓毒血症(sepsis)至今仍是造成临床患者发生多脏器损伤(multiple organs damages, MOD)甚至死亡的主要原因之一. 感染造成MOD的重要机制是内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)释放多种细胞因子如TNF-α，IL-1，IL-6，NO等产生的介质病. Kupffer细胞(KC)占整个MPS的80%～90%，是体内最大的固定巨噬细胞群；KC位于肝血窦内，与从肠道进入门静脉血的LPS密切接触；因此，它在机体防御及介导MOD两方面都起重要作用[1]. 近年来人们对LPS介导KC激活的机制进行了大量研究，特别是对脂多糖受体(LPS receptor)——CD14在LPS介导KC激活机制中的作用进行了深入细致的观察[2，3]，并取得了实质性进展，现综述如下.
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1 CD14的结构特征和分类
人类CD14的完整结构是从其基因克隆推测得知的[4]，它的基因位于包含有生长因子及其受体区域的第五对染色体上，而从cDNA推测出的兔和小鼠CD14的完整结构提示它们同人类的CD14的氨基酸序列具有高度的同源性. McGinley et al[5]采用内源性蛋白酶Asp-N溶解法，发现CD14的第57，59，65位点的天门冬氨基酸残基对Asp-N切开(cleavage)起反应，而Asp-N对CD14-LPS复合体的氨基酸残基则无此作用，说明CD14蛋白质分子的氨基酸序列中的57～64位点是LPS的结合点. Viriyakosol et al[6]用基因突变策略进一步证实CD14的N末端第65位氨基酸是与其结合及其信号传导的关键部位. CD14与已知的蛋白质无明显的序列同源，其最主要的可认识的结构特征是存在重复的富含亮氨酸结构的模体符(motifs)，这一序列的功能尚不清楚. 除了作为LPS受体外，CD14还有促使蛋白质与蛋白质相互作用的功能特征，如它能促使巨噬细胞粘附到激活的内皮细胞和T细胞上.
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CD14存在两种类型：在髓样细胞中，CD14以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白形式表达CD14(mCD14)，但在其他一些细胞如内皮细胞和上皮细胞上因缺乏GPI，CD14以可溶性形式(sCD14)存在于血浆内. CD14的羧基末端区域的GPI粘附位点尚不清楚. 阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)患者的髓样细胞缺乏mCD14，但他们血中仍能表达sCD14. PNH患者的sCD14与正常人血浆CD14是否一致仍需进一步研究. 没有一种生理机制能全面解释sCD14的产生和来源，但几种可能的机制是：①加磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C到CD14阳性的细胞中能释放CD14；②在蛋白酶作用下，CD14也能从原生质膜上释放；③虽然特异性的酶仍未被鉴别，一种细胞磷脂酶D也显示能释放GPI锚定的蛋白质；另外，一些sCD14可能直接从髓样细胞系中分泌而来. 还有资料显示髓样细胞外能合成CD14，这为sCD14的产生提供了另一潜在位点[4].
2 CD14作为LPS受体的功能
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LBP作为一种LPS调理素的功能包括促进G-菌或LPS包裹的RBC(E-LPS)粘附到髓样细胞上，当E-LPS与LBP混合时，这些颗粒与单核巨噬细胞(moncytes/macrosphages，MO)形成玫瑰花形，它们的数量能用显微镜定量，这一方法首先确定了CD14是LPS(或LPS-LBP)的受体[7]. 应用移动的受体下调方法(mobile receptor downmodulation)揭示用抗CD14单抗(而不是其他的MO表面蛋白单抗)覆盖MO的表面，显著减少了E-LPS-LBP和人类MO之间的玫瑰花形形成. 几个另外的证据也支持CD14是LPS或LPS-LBP复合体受体的观点，用抗CD14单抗或用磷酯酰肌醇特异性磷酯酶C预处理细胞，可阻止E-LPS-LBP玫瑰花形形成.
关于LPS结合到mCD14的亲合力及化学计量的测量，Kirkland et al[8]用稳定的转染CHO-K1细胞(能表达CD14)和单核细胞系THP-1进行了研究. LPS与CD14结合是快速的、相对独立于温度的. 通过磷酯酰肌醇特异性磷酯酶C处理后，95%以上的结合3H-LPS能被释放出来，一系列的抗CD14单抗能抑制LPS结合到CD14. CD14与LPS结合的恒定常数为3×10-8mol/L，LPS与CD14结合比例为1∶1以上. CD14是否有多个位点尚不清楚. 虽然LBP/LPS的研究对进一步帮助我们认识LPS激活细胞方面迈进了很大一步. 它也提出了很多重要而现在尚不能回答的问题，如mCD14这样一种不能与细胞内联系的GPI锚定蛋白怎样调节配体特异性细胞的结合信号怎样通过GPI锚定蛋白转导到胞内也困惑着我们. 在考虑到CD14怎样参与信号传递之前，首先研究其他GPI锚定蛋白是怎样转导信号是重要的. 在细胞激活中，有很多GPI锚定蛋白参与，虽然在绝大多数情况下，这些蛋白的特殊配体尚未被认识. 因此，细胞的激活通常是通过抗体诱导的交叉反应而开始的，很多模型已被用来解释这些蛋白是怎样转导信号的. 其中绝大多数模型中，一个重要的作用是涉及到GPI本身，即GPI锚定蛋白和Src样蛋白酪氨酸激酶相互连接，多数跨膜蛋白存在于这一联接中，特殊的脂质亚单位结构域(subdomain)可能也起作用. GPI锚定通过糖脂尾部水解释放的产物直接参与信号传导. 这些研究显示蛋白质的跨膜形式不能用GPI锚定或跨膜的CD73形式获得的结果相比较，而两种形式的CD73用抗体交联后均能激活细胞，有趣的是，后一研究证实附加的膜蛋白包括CD45、T细胞克隆性受体，Src家族酪氨酸激酶对CD73诱导的信号传导是必须的.
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有关CD14可以用生理配体LPS来研究信号传导. 为了解释mCD14作为LPS受体功能，目前提出了3种模型假说[4]：Model Ⅰ—单受体学说，当LPS或LPS-LBP复合体结合到mCD14后，信号传导开始，与细胞内的信息联系由一种能识别GPI锚定的跨膜蛋白质提供，相对而言，模型Ⅱ和Ⅲ则认为LPS受体是多聚体，mCD14是主要的配体结合亚单位，而附加的跨膜蛋白诱导信号传导. 多聚受体示范(paradigm)描述了许多细胞因子受体. Model Ⅱ认为与LPS结合后，mCD14经历了基本结构的变化，然后与跨膜信号分子相互作用，后者本身不与LPS结合. Model Ⅲ设想在缺乏CD14时，转导分子带着低的亲合力与LPS结合，这解释了非CD14途径在与LPS的结合中起重要作用，但另外的蛋白质在信号传导中也是必要的.
3 KC膜上CD14的表达
CD14是MO表面存在的LPS受体，在LPS的信息传递中起启动作用[3]. KC作为肝内固定的MO群，其细胞膜上CD14的表达存在特殊性. 用Western分析法显示重组mCD14的单抗能特异性地与小鼠巨噬细胞株J774发生反应，但不与髓瘤细胞株NS1反应. 荧光与免疫组化法提示rmC5-3能特异性地与KC结合；用rmc5-3免疫组化染色也显示在未受刺激小鼠的肝组织内，CD14染色阳性的KC数量少并且主要分布在中央区和门脉周围区，当其腹腔内注入内毒素(LPS)后，其数量逐渐增加，6h达高峰，20h后恢复正常. 而腹腔内MO膜上CD14的表达仅有轻度改变，提示LPS能上调KC膜上CD14的表达[9]. Tomita et al[10]通过对比正常人与慢性肝病患者的肝脏发现：正常肝组织内除肝窦内少数圆形细胞外，绝大多数KC不表达CD14，CD14染色阳性的KC多为圆形、多核，不同于典型的星形肝KC细胞. 但在AH和CAH，绝大多数KC CD14染色均为阳性. Tracy et al[11]通过结扎大鼠胆管造成瘀胆性肝损害，发现正常肝组织用免疫荧光染色无CD14阳性的KC细胞，Western法分析提示有低水平的CD14表达，而在病理性肝脏中，用间接荧光或用抗OX42或ED9的单抗行Western分析示KC表达CD14. 进一步用ED1和ED2染色发现胆管结扎3dED1与ED2阳性KC均增加，其中ED1>ED2. 两种抗体染色细胞数变化反应了两种来源的KC：ED-1 KC为外来细胞，而ED-2 KC为局部增生的KC，这表明CD14的功能与肝损害有密切联系，肝损害一开始，肝内固有的KC发生表型变化而表达CD14，同时血循环中MO聚集于肝内，共同形成肝内局部的免疫防御系统，通过释放细胞因子，应答LPS的刺激. 但是，有些细胞如70Z/3细胞不能表达CD14，仍能对LPS的刺激作出反应；仅表达少许CD14的KC细胞在缺乏血浆调理素情况下也能对LPS的刺激发生反应，且这类反应不被抗CD14单抗阻断，说明在KC内LPS信息传导的启动除CD14外，可能存在其他启动机制，如细胞膜上尚存一个辅助受体亚单位或第二受体[12]. 因此寻找出这些受体蛋白，不仅可丰富LPS受体激活KC的基本理论，也将为脓毒血症的治疗提供新靶位.
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4 CD14在LPS介导KC激活中的作用
目前认为，KC激活分四个阶段：①静止期(resident stage)，表现为KC数量少、形态小，多半位于肝窦内，CD14染色多为阴性；②反应期，表现为局部KC刺激性增生及全身MO肝内聚集；③准备期( primed stage)即KC表型发生转化，表现为CD14等细胞膜受体的出现和功能发生改变；④激活期，表现为核转录因子NF-kB的激活、分泌及表达各种细胞因子. 因此，CD14被认为是KC激活及其功能变化的特征性标志[11]. 有关CD14在LPS所致KC激活中的作用，目前尚存在争议. 主要表现在下列两个方面. 多数学者认为LPS介导KC的激活主要是通过CD14途径实现的. Matsuura et al[9]报道LPS可刺激KC CD14的上调；Tracy et al[11]也报道梗阻性黄疸时KC CD14的表达明显增强，高表达的CD14对LPS具有高敏性，这可能与血循环中MO肝内聚集有关；Gupta et al[13]用70Z/3型小鼠细胞转染人的CD14发现，当转染空载体时，70Z/3细胞对低浓度LPS无反应；但70Z/3 CD14细胞对低浓度LPS产生反应，表现为表面IgM的表达、NF-kB的激活和IkB的降解，而且LPS诱导的NF-kB能被抗CD14单抗抑制，CD14的N端156个氨基酸对LPS的反应是足够的，但CD14中N端65个氨基酸内的一个小片段发生缺失突变将显著减少对LPS的反应. 这一结果表明CD14是LPS的功能受体，它在LPS所致的KC内NF-kB激活和IgM的反应中起关键作用.
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但是，也有不少作者认为LPS介导KC激活不依赖CD14. Bellezzo et al[14]报道LPS刺激分离的KC NF-kB激活不依赖血浆的有无，提示CD14非依赖途径的存在；Lichtman et al[2]通过观测CD14在KC激活和TNF-A-α释放中的作用发现：①LPS刺激KC释放TNF-α的量与有无血浆无明显关系，但RAW264.7和腹腔巨噬细胞(利用CD14受体)在缺乏血浆时释放TNF-α的量明显减少；②用磷脂酰肌醇磷脂酶C处理CD14受体后，由于CD14被裂解，RAW264.7对LPS所致的TNF-α释放明显减少，但此酶对KC释放TNF-α无影响；③去酰基化的LPS(deacylated LPS, dLPS)与LPS按100∶1的比例竞争CD14受体，这种竞争可抑制RAW264.7中LPS刺激TNF-α的释放，但对KC无此作用；④Western分析和FACS(fluorescence-actived cell sorter)分析直接发现RAW264.7及腹腔MO上存在CD14，而KC上仅存在少量CD14，并且LPS刺激不增加小鼠KC上CD14的表达. 因此，他们认为分离的大、小鼠KC CD14的表达非常低，LPS刺激KC TNF-α的释放是不依赖CD14的.
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究竟CD14在LPS所致KC激活中起何作用呢近年来Perera et al[15]通过实验对此问题作了较为圆满的解释. 他们用正常或CD14基因敲除的小鼠实验发现，在低浓度LPS(<10ng/mL)刺激下，KC的激活是通过CD14实现的，因为正常KC在此条件下可诱导TNF-α，IL-2及干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10, IP-10)基因的表达. 但在高浓度LPS的条件下或在无血浆条件下，CD14在LPS介导KC激活中的作用就显得比较复杂，涉及CD14途径与非CD14途径，在反应初期，LPS首先与CD14受体结合，当CD14受体达到饱和后，LPS才与KC膜上其他LPS受体结合激活KC. Netea et al[16]也认为CD14依赖与非依赖途径可能涉及不同细胞因子的诱导，TNF-α的产生基本上是CD14依赖的，在有血浆时，LPS诱导IL-1的产生是CD14依赖的，但无血浆时，两条途径均被累及. 脂质A通过两条途径刺激KC合成和分泌细胞因子，但其作用明显低于LPS的刺激，说明LPS的多糖部分是LPS激活KC的关键部分.
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总之，有关LPS激活包括KC在内的MPS的机制及CD14在其中的作用已取得了突破性进展[17]，已证实LPS通过与KC膜上的mCD14结合而激活多级酶联反应将信号转导到细胞核内，再通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录，从而参与LPS诱导的KC反应. 然而，有关LPS激活KC的确切机制，仍有诸多问题有待进一步解决，例如，CD14跨膜信号分子的鉴定，膜内信号分子的传递，NF-kB等转录因子在LPS诱导蛋白基因表达中的调控作用等等. 因此，这方面的深入研究将对感染、脓毒血症、全身炎症反应综合征及MOD的理论和临床防治提供新的实验依据.
通讯作者：龚建平
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收稿日期 1999-04-15, http://www.100md.com