骨形态发生蛋白和纤维蛋白复合物修复关节软骨全层缺损
作者：余升华 蔡道章 林淦松 胡汉生 郑秀玲 彭文明 刘水宝
单位：余升华 林淦松 胡汉生 广州市第二人民医院骨外科，郑秀玲 彭文明 病理科(510150)；蔡道章 中山医科大学附属第三医院骨外科(510630)；刘水宝 江西省遂川县大汾镇医院(343926)
关键词：骨形态发生蛋白；纤维蛋白；关节软骨 缺损；修复
广东医学991004
【摘要】 目的 探讨骨形态发生蛋白/纤维蛋白载体(BMP/FG)复合物修复关节软骨缺损的效果。方法 30只新西兰种成年兔随机分为A，B，C三组，每只兔子左膝股骨髁间凹做一大小为4 mm×5 mm×2.5 mm的全层关节软骨缺损。A、B组缺损内分别填充BMP/FG及FG，C组为空白。术后16周对缺损修复情况行大体形态和组织学观察。结果 BMP/FG组，植入物完全被吸收并被新生软骨替代，新生软骨特征与邻近正常软骨相似，而FG组和空白组大体形态和组织学特征基本相似，以纤维组织修复为主。结论 BMP/FG能在关节腔内诱导软骨再生，并能以透明软骨修复全层关节软骨缺损。
, 百拇医药
The effect of bone morphogenetic protein and fibrin glue on the healing of full-thickness defects of articular cartilage
Yu Shenghua, Chai Daozhang, Lin Ganshong
The Second People′s Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510150
【Abstract】 Objective To study the effects of bone morphogenetic protein and fibrin glue (BMP/FG) on the healing of full-thickness defects of articular cartilage.Methods Thirty adult New Zealand rabbits were divided into three groups, group A,B,C, with ten rabbits in each group. One full-thickness defects of articular cartilage, 4 mm×5 mm×2.5 mm in size, was made in the trochlear groove of the left femur of each rabbit. The defects of group A and B were filled with BMP/FG and FG respectively. The defects of group C were left empty. The healing of the defects was observed by gross and microscopic examination at 16 weeks after operation.Results In the BMP/FG grafted group the results showed complete absorption of BMP/FG and substitution by new cartilage tissue, the features of which were similar to that of the adjacent normal cartilage. The gross appearance and histological features of FG grafted group were similar to that of the empty group, which appeared predominantly fibrous repair.Conclusion BMP/FG can induce cartilage regeneration and repair the full-thickness defects of cartilage with hyaline cartilage.
, 百拇医药
【Key words】 Bone morphogenetic protein Fibrin glue Articular cartilage defect Repair
传统的修复关节软骨方法仍缺乏满意的疗效。骨形态发生蛋白(BMP)属于生长因子之一，可以诱导损伤组织间充质细胞增殖分化为成骨细胞及成软骨细胞，并可刺激成骨细胞的DNA合成、细胞增殖以及胶原合成。在临床应用研究中，BMP主要集中在骨缺损的修复及促进骨愈合，对于BMP在关节软骨缺损修复中的作用尚未引起重视。
1 材料与方法
1.1 骨形态发生蛋白/纤维蛋白(BMP/FG)复合物、FG的来源和制备 ①BMP由兰州军区总医院骨科研究所研制、提供。②FG由广州倍特生物技术有限公司研制提供。③BMP/FG的制备：BMP用环氧乙烷消毒，在凝血板的每个孔中放入BMP 10 mg，依次滴入配制好的FG的主体胶溶液和催化剂溶液，两部分用量均为0.05 mL(1滴)，搅成凝胶状的BMP/FG复合物。
, 百拇医药
1.2 动物分组方法 30只健康成年新西兰兔，体重2.5～3 kg,雌雄不限，随机分为A，B，C三组，每组10只。
1.3 手术方法 以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)从兔耳缘静脉麻醉。在无菌条件下，取左膝髌骨内侧纵形切口，打开关节囊，髌骨脱位，暴露股骨髁间凹。用鹅眉凿、小方形凿在其中央部分做大小4 mm×5mm,深约2.5 mm的全层软骨缺损。A，B组缺损分别填充BMP/FG及FG，C组为空白。然后彻底止血，髌骨复位，分层缝合伤口。
1.4 观察内容 术后16周空气栓塞处死动物，将缺损连同部分正常骨组织取出，放入10%中性福尔马林溶液中固定24 h，然后用15%甲酸脱钙1周。脱钙完全后脱水、透明，石蜡包埋，做4 μm连续切片，HE染色，光镜观察。
2 结果
2.1 大体标本的观察 A组关节新生软骨与周围软骨难以区分，界线不清，颜色、质地基本接近正常软骨，表面光滑。B组和C组外观相似，与周围正常软骨交界处多有裂隙，表面大部分欠光滑，部分未完全填满，有空洞。
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2.2 组织学观察 A组修复组织与正常软骨及正常软骨下骨非常相似。修复软骨显示类透明软骨修复，排列趋于正常，表层软骨细胞，长轴平行于软骨表面，中部软骨细胞呈“栅栏状”或垂直柱状排列，新生软骨组织与正常软骨交界不清，连接较佳，未见软骨退化和骨化现象，修复软骨的厚度相当于邻近正常软骨厚度的70%左右；B组新生组织主要以纤维为主，少部分为纤维软骨，但排列紊乱；而C组内基本未见新生软骨组织，完全为纤维组织。术后16周，3组动物关节软骨缺损修复组织的组织学特性见表1。
表1 术后16周关节软骨缺损修复组织的组织学特性 (只) 组织性质
A组
B组
C组
组织性质
A组
, 百拇医药
B组
C组
主要修复组织类型
软骨下“潮标”
纤维组织
0
8
10
完全形成
9
0
0
纤维软骨
, 百拇医药
1
2
0
部分形成
1
4
0
幼稚软骨
1
0
0
无
0
6
, 百拇医药
10
类透明软骨
8
0
0
与邻近组织连接
修复面情况
完全连接
6
2
2
平整光滑
8
, 百拇医药 3
0
部分连接
2
3
2
基本平整
2
2
3
不连接
2
5
6
, 百拇医药
不平整
0
5
7
3 讨论
骨软骨缺损的修复包括软骨下骨和表层软骨的再生与改建过程。本实验A组，大体表面光滑平整，大部分完全修复缺损。组织学形态象透明软骨排列，基质丰富。有9例标本有连续的“潮标”形成，1例部分“潮标”形成。而B和C组主要以纤维组织修复，没有连续完全的“潮标”形成，FG也只有部分“潮标”形成。由此可见BMP/FG复合物较好的完成关节软骨全层缺损的修复，而FG单独运用则不能有效修复关节软骨全层缺损。
体外实验表明，软骨细胞移植和软骨移植在加入BMP之后所产生的基质有所增多[1，2]。BMP的这种功能或许能够解释我们这个实验中为什么BMP组所修复的组织当中基质较丰富的原因。另外，BMP组修复组织中的软骨下骨生长较快，而软骨下骨又能提供生物学稳定性能，这或许是BMP组能够取得良好的软骨缺损修复的一个决定性因素。组织学和组织化学分析提示[3]：软骨下骨再生改建速度快同新生软骨再生改建较好有着持续的正相关，即软骨下骨再生与改建快速，新生软骨亦再生良好，我们认为这是因为软骨下骨的快速修复，给在其上面再生的软骨提供了一个良好的支撑，从而使得软骨基质分泌正常顺利，同时也由于软骨下骨的生物力学的稳定性，从而避免了再生软骨内部裂隙的发生。本实验A组基质丰富，裂隙较少，就证明了这一点。
, 百拇医药
本实验A组软骨再生厚度在4个月就已达相邻正常软骨厚度的70%左右，说明BMP并不会影响再生软骨的厚度。而修复软骨达不到正常软骨厚度，原因可能与修复的时间不够长(只有4个月)有关。B组修复组织主要为纤维组织，不能完成关节软骨缺损的修复，而BMP/FG则能较好地完成关节软骨缺损修复。说明关节软骨的生成与BMP有关。BMP/FG能较好地修复关节软骨缺损的机理比较复杂，我们推测：关节软骨全层缺损，其深部松质骨骨髓含有的未分化的间充质细胞随着骨髓的流动而向关节表面即BMP方向迁移。而这些细胞正是BMP的靶细胞，FG的天然网状结构为BMP的靶细胞粘附、增殖提供了一个良好的三维空间环境，增加了BMP和靶细胞的作用面积[4]；另一方面，FG的网状结构又限制了BMP的快速扩散，使BMP随着FG的逐渐降解缓慢地释放出来，从而使BMP从底物向靶细胞转移能够形成一个理想的浓度梯度。BMP诱导靶细胞向软骨转化，是受时间依赖性和剂量依赖性的。理想的浓度梯度即满足了时间依赖性，10 mg BMP填入4 mm×5 mm骨软骨缺损，满足了剂量依赖性，这样BMP/FG就能顺利诱导间充质细胞(靶细胞)转化为软骨细胞。软骨全层缺损深层有骨髓的血液供应，血管易长入，氧分压相对较高，这样BMP就能诱导新生软骨通过软骨内骨化的形式转化成软骨下骨。而缺损表层的软骨则不会进一步骨化，可能受表层新生软骨营养来源于关节液，关节运动，软骨来源的形态发生蛋白等影响所致。
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总之，BMP不仅能修复骨缺损，而且在适当的载体系统中还能以透明软骨的形式修复关节软骨缺损。而FG则是BMP良好的载体。
4 参考文献
1 Luytem FP. Cartilage-derived morphogenetic proteins. Key regulators in chondrocyte differentiation Acto Orthop, 1995, 266(suppl): 9951
2 Sailor LZ, Hewick RM. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 maintains the articular chondrocyte phenotype in long-term culture. J Othop Res, 1996, 14:937
3 Bylani S, Sellers. The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rh Bmp-2) on the healing of full-thickness defects of cartilage. J Bone Joint Surg, 1997, 79A(10):1452
4 陈克明，刘 兴，葛宝丰，等.纤维蛋白作BMP载体的研究.中华骨科杂志，1998， 4：234, http://www.100md.com
单位：余升华 林淦松 胡汉生 广州市第二人民医院骨外科，郑秀玲 彭文明 病理科(510150)；蔡道章 中山医科大学附属第三医院骨外科(510630)；刘水宝 江西省遂川县大汾镇医院(343926)
关键词：骨形态发生蛋白；纤维蛋白；关节软骨 缺损；修复
广东医学991004
【摘要】 目的 探讨骨形态发生蛋白/纤维蛋白载体(BMP/FG)复合物修复关节软骨缺损的效果。方法 30只新西兰种成年兔随机分为A，B，C三组，每只兔子左膝股骨髁间凹做一大小为4 mm×5 mm×2.5 mm的全层关节软骨缺损。A、B组缺损内分别填充BMP/FG及FG，C组为空白。术后16周对缺损修复情况行大体形态和组织学观察。结果 BMP/FG组，植入物完全被吸收并被新生软骨替代，新生软骨特征与邻近正常软骨相似，而FG组和空白组大体形态和组织学特征基本相似，以纤维组织修复为主。结论 BMP/FG能在关节腔内诱导软骨再生，并能以透明软骨修复全层关节软骨缺损。
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The effect of bone morphogenetic protein and fibrin glue on the healing of full-thickness defects of articular cartilage
Yu Shenghua, Chai Daozhang, Lin Ganshong
The Second People′s Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510150
【Abstract】 Objective To study the effects of bone morphogenetic protein and fibrin glue (BMP/FG) on the healing of full-thickness defects of articular cartilage.Methods Thirty adult New Zealand rabbits were divided into three groups, group A,B,C, with ten rabbits in each group. One full-thickness defects of articular cartilage, 4 mm×5 mm×2.5 mm in size, was made in the trochlear groove of the left femur of each rabbit. The defects of group A and B were filled with BMP/FG and FG respectively. The defects of group C were left empty. The healing of the defects was observed by gross and microscopic examination at 16 weeks after operation.Results In the BMP/FG grafted group the results showed complete absorption of BMP/FG and substitution by new cartilage tissue, the features of which were similar to that of the adjacent normal cartilage. The gross appearance and histological features of FG grafted group were similar to that of the empty group, which appeared predominantly fibrous repair.Conclusion BMP/FG can induce cartilage regeneration and repair the full-thickness defects of cartilage with hyaline cartilage.
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【Key words】 Bone morphogenetic protein Fibrin glue Articular cartilage defect Repair
传统的修复关节软骨方法仍缺乏满意的疗效。骨形态发生蛋白(BMP)属于生长因子之一，可以诱导损伤组织间充质细胞增殖分化为成骨细胞及成软骨细胞，并可刺激成骨细胞的DNA合成、细胞增殖以及胶原合成。在临床应用研究中，BMP主要集中在骨缺损的修复及促进骨愈合，对于BMP在关节软骨缺损修复中的作用尚未引起重视。
1 材料与方法
1.1 骨形态发生蛋白/纤维蛋白(BMP/FG)复合物、FG的来源和制备 ①BMP由兰州军区总医院骨科研究所研制、提供。②FG由广州倍特生物技术有限公司研制提供。③BMP/FG的制备：BMP用环氧乙烷消毒，在凝血板的每个孔中放入BMP 10 mg，依次滴入配制好的FG的主体胶溶液和催化剂溶液，两部分用量均为0.05 mL(1滴)，搅成凝胶状的BMP/FG复合物。
, 百拇医药
1.2 动物分组方法 30只健康成年新西兰兔，体重2.5～3 kg,雌雄不限，随机分为A，B，C三组，每组10只。
1.3 手术方法 以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)从兔耳缘静脉麻醉。在无菌条件下，取左膝髌骨内侧纵形切口，打开关节囊，髌骨脱位，暴露股骨髁间凹。用鹅眉凿、小方形凿在其中央部分做大小4 mm×5mm,深约2.5 mm的全层软骨缺损。A，B组缺损分别填充BMP/FG及FG，C组为空白。然后彻底止血，髌骨复位，分层缝合伤口。
1.4 观察内容 术后16周空气栓塞处死动物，将缺损连同部分正常骨组织取出，放入10%中性福尔马林溶液中固定24 h，然后用15%甲酸脱钙1周。脱钙完全后脱水、透明，石蜡包埋，做4 μm连续切片，HE染色，光镜观察。
2 结果
2.1 大体标本的观察 A组关节新生软骨与周围软骨难以区分，界线不清，颜色、质地基本接近正常软骨，表面光滑。B组和C组外观相似，与周围正常软骨交界处多有裂隙，表面大部分欠光滑，部分未完全填满，有空洞。
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2.2 组织学观察 A组修复组织与正常软骨及正常软骨下骨非常相似。修复软骨显示类透明软骨修复，排列趋于正常，表层软骨细胞，长轴平行于软骨表面，中部软骨细胞呈“栅栏状”或垂直柱状排列，新生软骨组织与正常软骨交界不清，连接较佳，未见软骨退化和骨化现象，修复软骨的厚度相当于邻近正常软骨厚度的70%左右；B组新生组织主要以纤维为主，少部分为纤维软骨，但排列紊乱；而C组内基本未见新生软骨组织，完全为纤维组织。术后16周，3组动物关节软骨缺损修复组织的组织学特性见表1。
表1 术后16周关节软骨缺损修复组织的组织学特性 (只) 组织性质
A组
B组
C组
组织性质
A组
, 百拇医药
B组
C组
主要修复组织类型
软骨下“潮标”
纤维组织
0
8
10
完全形成
9
0
0
纤维软骨
, 百拇医药
1
2
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部分形成
1
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幼稚软骨
1
0
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无
0
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, 百拇医药
10
类透明软骨
8
0
0
与邻近组织连接
修复面情况
完全连接
6
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平整光滑
8
, 百拇医药 3
0
部分连接
2
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基本平整
2
2
3
不连接
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6
, 百拇医药
不平整
0
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7
3 讨论
骨软骨缺损的修复包括软骨下骨和表层软骨的再生与改建过程。本实验A组，大体表面光滑平整，大部分完全修复缺损。组织学形态象透明软骨排列，基质丰富。有9例标本有连续的“潮标”形成，1例部分“潮标”形成。而B和C组主要以纤维组织修复，没有连续完全的“潮标”形成，FG也只有部分“潮标”形成。由此可见BMP/FG复合物较好的完成关节软骨全层缺损的修复，而FG单独运用则不能有效修复关节软骨全层缺损。
体外实验表明，软骨细胞移植和软骨移植在加入BMP之后所产生的基质有所增多[1，2]。BMP的这种功能或许能够解释我们这个实验中为什么BMP组所修复的组织当中基质较丰富的原因。另外，BMP组修复组织中的软骨下骨生长较快，而软骨下骨又能提供生物学稳定性能，这或许是BMP组能够取得良好的软骨缺损修复的一个决定性因素。组织学和组织化学分析提示[3]：软骨下骨再生改建速度快同新生软骨再生改建较好有着持续的正相关，即软骨下骨再生与改建快速，新生软骨亦再生良好，我们认为这是因为软骨下骨的快速修复，给在其上面再生的软骨提供了一个良好的支撑，从而使得软骨基质分泌正常顺利，同时也由于软骨下骨的生物力学的稳定性，从而避免了再生软骨内部裂隙的发生。本实验A组基质丰富，裂隙较少，就证明了这一点。
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本实验A组软骨再生厚度在4个月就已达相邻正常软骨厚度的70%左右，说明BMP并不会影响再生软骨的厚度。而修复软骨达不到正常软骨厚度，原因可能与修复的时间不够长(只有4个月)有关。B组修复组织主要为纤维组织，不能完成关节软骨缺损的修复，而BMP/FG则能较好地完成关节软骨缺损修复。说明关节软骨的生成与BMP有关。BMP/FG能较好地修复关节软骨缺损的机理比较复杂，我们推测：关节软骨全层缺损，其深部松质骨骨髓含有的未分化的间充质细胞随着骨髓的流动而向关节表面即BMP方向迁移。而这些细胞正是BMP的靶细胞，FG的天然网状结构为BMP的靶细胞粘附、增殖提供了一个良好的三维空间环境，增加了BMP和靶细胞的作用面积[4]；另一方面，FG的网状结构又限制了BMP的快速扩散，使BMP随着FG的逐渐降解缓慢地释放出来，从而使BMP从底物向靶细胞转移能够形成一个理想的浓度梯度。BMP诱导靶细胞向软骨转化，是受时间依赖性和剂量依赖性的。理想的浓度梯度即满足了时间依赖性，10 mg BMP填入4 mm×5 mm骨软骨缺损，满足了剂量依赖性，这样BMP/FG就能顺利诱导间充质细胞(靶细胞)转化为软骨细胞。软骨全层缺损深层有骨髓的血液供应，血管易长入，氧分压相对较高，这样BMP就能诱导新生软骨通过软骨内骨化的形式转化成软骨下骨。而缺损表层的软骨则不会进一步骨化，可能受表层新生软骨营养来源于关节液，关节运动，软骨来源的形态发生蛋白等影响所致。
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总之，BMP不仅能修复骨缺损，而且在适当的载体系统中还能以透明软骨的形式修复关节软骨缺损。而FG则是BMP良好的载体。
4 参考文献
1 Luytem FP. Cartilage-derived morphogenetic proteins. Key regulators in chondrocyte differentiation Acto Orthop, 1995, 266(suppl): 9951
2 Sailor LZ, Hewick RM. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 maintains the articular chondrocyte phenotype in long-term culture. J Othop Res, 1996, 14:937
3 Bylani S, Sellers. The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rh Bmp-2) on the healing of full-thickness defects of cartilage. J Bone Joint Surg, 1997, 79A(10):1452
4 陈克明，刘 兴，葛宝丰，等.纤维蛋白作BMP载体的研究.中华骨科杂志，1998， 4：234, http://www.100md.com