碱性成纤维细胞生长因子对庆大霉素所致豚鼠耳蜗损害的拮抗作用
作者：熊敏 姜泗长 顾瑞 杨伟炎 张素珍 翟所强
单位：熊敏 广州军区广州总医院耳鼻咽喉科(510010)；姜泗长 顾瑞 杨伟炎 张素珍 翟所强 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；耳蜗；庆大霉素
广东医学991003
【摘要】 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对庆大霉素所致活体豚鼠耳蜗损害的拮抗作用。方法 豚鼠皮下注射庆大霉素连续10 d，造成内耳损伤。实验组同时腹腔注射bFGF，对照组则注射生理盐水。检测两组豚鼠的听功能，耳蜗行扫描电镜观察。结果 扫描电镜观察所见对照组耳蜗损伤明显重于实验组，对照组ARB听阈较实验组高(P<0.05)。结论 bFGF对庆大霉素所致活体豚鼠耳蜗损伤有拮抗作用。
, 百拇医药
Antitoxic effect of basic fibroblast growth factor on guinea pig cochlea injury induced by gentamicin in vivo
Xiong Min, Jiang Shichang, Gu Rui
The Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To study the antitoxic effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on guinea pig cochlea injury induced by gentamicin in vivo.Methods Guinea pigs were treated with subcutaneous injection of gentamicin for 10 days suceesively. Inner ears were injured. At the same time, guinea pigs of the experimental group were treated with intraperitoneal injection of bFGF; The control group was treated with normal saline. Both groups of guinea pig′s auditory functions were tested, and cochleas were observed by scanning electronic microscopy.Results The scanning electronic microscopy showed that cochleas of the control group were hurt more severely than those of the experimental group. ABR threshold of the control group was about 6 dB above that of the experimental group.Conclusion bFGF has antitoxic effect on guinea pig cochlea injury induced by gentamicin in vivo.
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【Key words】 Basic fibroblast growth factor Cochlea Gentamicin Guinea pig
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对氨基糖甙类抗生素所致离体耳蜗毛细胞损害有保护作用[1]。本实验应用庆大霉素行豚鼠皮下注射，同时行bFGF腹腔注射，观察bFGF对活体豚鼠耳蜗损害的拮抗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 所有动物均采用体重为250 g左右的白色红目豚鼠，雌雄不限，耳郭反射灵敏，耳镜观察鼓膜正常。所有动物入选前均经听觉脑干诱发电位(ABR)检查，正常者入选。
1.2 实验设计及分组 实验共分3组，每组15只豚鼠。实验组：豚鼠皮下注射庆大霉素150 mg/(kg。d)，连续10 d，同时腹腔注射bFGF 1.3 μg/(kg。d)(将bFGF用生理盐水稀释，1 mL生理盐水含1 μg bFGF)，以观察bFGF对耳蜗损害的拮抗作用。对照组：豚鼠皮下注射庆大霉素150 mg/(kg。d)，连续10 d，同时腹腔注射1.3 mL(kg。d)生理盐水。空白对照组：未经任何药物处理。
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每组动物在用药前及最后一次用药后24 h行ARB检测，每组随机活杀三只豚鼠行耳蜗扫描电镜检查。
1.3 ARB测试 ARB阈值用Madson 2250听功能测试仪，短声刺激，TDH 49P耳机距动物测试耳2 cm声场记录。以第Ⅲ波为基准测反应阈，测定造模用药前后听阈值。
1.4 扫描电镜观察 最后一次给药后24 h检测ARB后，每组随机选取3只豚鼠活杀行耳蜗扫描电镜检查。断头活杀豚鼠，迅速取下双侧颞骨，置于4℃ 2.5%戊二醛液中。解剖显微镜下，取除镫骨，暴露前庭窗及圆窗，于蜗尖以细针挑一小孔，缓缓将固定液行耳蜗内灌流，在4℃条件下固定12 h后，10%EDTA液中脱钙三周。1%锇酸后固定1 h，剥除耳蜗骨壳，揭除前庭膜，暴露内外毛细胞。脱水、二氧化碳临界点干燥、粘托，真空喷金，扫描电镜观察。
1.5 统计学处理 数据采用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验。
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2 结果
2.1 三组动物用药前后听阈的变化 见表1(15只豚鼠，30只耳)。
2.2 扫描电镜观察结果 对照组：钩端及基底圈呈现多数区域性外毛细胞缺失(图1)，内毛细胞有少量缺失；二、三圈外毛细胞呈散在性缺失，内毛细胞缺失较少。实验组：一、二圈外毛细胞呈散在性缺失，钩端呈局限性片状缺失；个别耳蜗的基底圈呈正常结构(图2)。
表1 三组动物用药前后听阈(dBSPL)的变化 (
±s,dB)
n
用药前
用药后
空白对照组
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15
18.00±6.24
19.33±7.62
对照组
15
18.33±6.34
57.67±6.40△
实验组
15
18.67±7.65
51.83±6.76△
用药前三组听阈比较差异无显著性(P>0.05)；△：造模后空白对照与实验组、对照组听阈比较P<0.01;★：造模后实验组与对照组听阈比较P<0.05
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图1 对照组耳蜗扫描 图2 实验组耳蜗扫描
电镜(×1500) 电镜(×1500)
从ARB阈值及耳蜗扫描电镜观察所见，可以说明bFGF对庆大霉素所致活体豚鼠耳蜗损害有拮抗作用。
3 讨论
LOW等(1996)证实bFGF对新霉素所致离体耳蜗毛细胞损害有保护作用[1]。翟所强等(1997)观察到aFGF及bFGF活体耳蜗灌注对爆震性耳聋CAP听阈恢复有促进作用，有延缓和减轻或阻滞耳蜗毛细胞的进一步恶化[2]。本实验结果从耳蜗形态及听功能阈值上均证实腹腔注射bFGF对庆大霉素所致活体耳蜗损伤有拮抗作用，能减轻庆大霉素对活体耳蜗的毒性，对耳蜗损伤起一定程度的保护作用。
耳蜗毛细胞及支持细胞表面均存在成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)。在耳蜗受损伤后FGRF表达增高，提示成纤维细胞生长因子在耳蜗损伤后修复过程中着重要作用[3]。FGFR是能引起细胞内多种变化的酪氨酸激酶[4]。bFGF与毛细胞表面FGFR结合并使其激活，毛细胞内发生磷酸化，从而调制毛细胞功能，使毛细胞内钙离子水平下降，并抑制毛细胞凋亡基因的表达，最终抑制毛细胞凋亡，使毛细胞对氨基糖甙类抗生素耳毒性产生拮抗作用[1]。
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翟所强等[2]采用aFGF及bFGF耳蜗内灌注的方法观察其对爆震性耳蜗损伤的治疗作用，这种方法易于理解，因为aFGF及bFGF直接进入外淋巴中，由于神经元的轴突和突触与外淋巴液和外淋巴间隙相通，这一途径可为生长因子提供一种传递的方式。内耳由于骨壳的包围，除了通过内淋巴管、囊和耳蜗导管水管外，它是唯一的与机体其他腔隙隔离的器官。这样内耳就有可能在其自身微环境中得到治疗。正是由于内耳骨壳的包围，构成了血迷路屏障，bFGF分子量较大，难以通过血迷路屏障[5]。那么豚鼠腹腔给药，是通过什么机理起作用的呢其一，可能是bFGF进入机体后经过代谢降解，其有生物活性片段能通过血迷路屏障，进入内耳而起疗效。其二，可能是bFGF进入机体后刺激了神经内分泌系统，使内源性生长因子产生及分泌增加，从而达到治疗作用。这两点推测尚需实验进一步证实，或许还有其它机制参与。
本实验结果显示豚鼠腹腔注射bFGF后实验组和对照组ARB听阈差异有显著性，但实验组和空白对照组差异亦有显著性，表明腹腔注射bFGF对庆大霉毒所致活体耳蜗损伤有拮抗作用，但无治疗作用。究其原因可能是bFGF难以通过血迷路屏障及进入内耳微环境，不能直接作用于耳蜗毛细胞，从而影响bFGF疗效的发挥。如能将bFGF以无创伤的方法导入内耳也许作用更佳。将bFGF传递至迷路外淋巴液的方法可能包括将bFGF直接滴入中耳腔，通过圆窗膜扩散或透入或经开口直接灌入迷路本身。将bFGF结合于载体分子透过内皮细胞则是另一种可能的传递方式。可植入的多聚体，可植入的基因工程细胞(包在胶囊内)和携带有bFGF基因的病毒基因媒介物的引入，则是在长期条件下将bFGF传递至内耳的其它可能手段。相信随着技术的进步，bFGF导入内耳的方法会日渐成熟，为治疗因毛细胞损害而引起的听功能障碍提供一个新路子。
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4 参考文献
1 Low W, Dazert, S, Baind A. Basic fibroblast growth factor (FGF-2) protects rat cochlear hair cells in organotypical culture from aminoglycoside injury. J Cellular Physiology, 1996, 167: 443
2 翟所强，成晋川，王嘉陵.成纤维细胞生长因子耳蜗内灌注防治爆震性聋的实验研究.中华耳鼻咽喉科学杂志，1997，32(6)：354
3 Pirvola U, Cao Y, Oellig C. The site of action of neuronal acidic fibroblast growth factor is the organ of corti of rat ochlea. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:9269
4 Schlessinger J, Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron, 1992, 9:383
5 John SK, Pybak LP, Prado S. Nature of blood-labyrinth barrier in experimental condition. Ann Otol, 1981, 90:135, http://www.100md.com
单位：熊敏 广州军区广州总医院耳鼻咽喉科(510010)；姜泗长 顾瑞 杨伟炎 张素珍 翟所强 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；耳蜗；庆大霉素
广东医学991003
【摘要】 目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对庆大霉素所致活体豚鼠耳蜗损害的拮抗作用。方法 豚鼠皮下注射庆大霉素连续10 d，造成内耳损伤。实验组同时腹腔注射bFGF，对照组则注射生理盐水。检测两组豚鼠的听功能，耳蜗行扫描电镜观察。结果 扫描电镜观察所见对照组耳蜗损伤明显重于实验组，对照组ARB听阈较实验组高(P<0.05)。结论 bFGF对庆大霉素所致活体豚鼠耳蜗损伤有拮抗作用。
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Antitoxic effect of basic fibroblast growth factor on guinea pig cochlea injury induced by gentamicin in vivo
Xiong Min, Jiang Shichang, Gu Rui
The Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010
【Abstract】 Objective To study the antitoxic effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on guinea pig cochlea injury induced by gentamicin in vivo.Methods Guinea pigs were treated with subcutaneous injection of gentamicin for 10 days suceesively. Inner ears were injured. At the same time, guinea pigs of the experimental group were treated with intraperitoneal injection of bFGF; The control group was treated with normal saline. Both groups of guinea pig′s auditory functions were tested, and cochleas were observed by scanning electronic microscopy.Results The scanning electronic microscopy showed that cochleas of the control group were hurt more severely than those of the experimental group. ABR threshold of the control group was about 6 dB above that of the experimental group.Conclusion bFGF has antitoxic effect on guinea pig cochlea injury induced by gentamicin in vivo.
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【Key words】 Basic fibroblast growth factor Cochlea Gentamicin Guinea pig
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对氨基糖甙类抗生素所致离体耳蜗毛细胞损害有保护作用[1]。本实验应用庆大霉素行豚鼠皮下注射，同时行bFGF腹腔注射，观察bFGF对活体豚鼠耳蜗损害的拮抗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 所有动物均采用体重为250 g左右的白色红目豚鼠，雌雄不限，耳郭反射灵敏，耳镜观察鼓膜正常。所有动物入选前均经听觉脑干诱发电位(ABR)检查，正常者入选。
1.2 实验设计及分组 实验共分3组，每组15只豚鼠。实验组：豚鼠皮下注射庆大霉素150 mg/(kg。d)，连续10 d，同时腹腔注射bFGF 1.3 μg/(kg。d)(将bFGF用生理盐水稀释，1 mL生理盐水含1 μg bFGF)，以观察bFGF对耳蜗损害的拮抗作用。对照组：豚鼠皮下注射庆大霉素150 mg/(kg。d)，连续10 d，同时腹腔注射1.3 mL(kg。d)生理盐水。空白对照组：未经任何药物处理。
, http://www.100md.com
每组动物在用药前及最后一次用药后24 h行ARB检测，每组随机活杀三只豚鼠行耳蜗扫描电镜检查。
1.3 ARB测试 ARB阈值用Madson 2250听功能测试仪，短声刺激，TDH 49P耳机距动物测试耳2 cm声场记录。以第Ⅲ波为基准测反应阈，测定造模用药前后听阈值。
1.4 扫描电镜观察 最后一次给药后24 h检测ARB后，每组随机选取3只豚鼠活杀行耳蜗扫描电镜检查。断头活杀豚鼠，迅速取下双侧颞骨，置于4℃ 2.5%戊二醛液中。解剖显微镜下，取除镫骨，暴露前庭窗及圆窗，于蜗尖以细针挑一小孔，缓缓将固定液行耳蜗内灌流，在4℃条件下固定12 h后，10%EDTA液中脱钙三周。1%锇酸后固定1 h，剥除耳蜗骨壳，揭除前庭膜，暴露内外毛细胞。脱水、二氧化碳临界点干燥、粘托，真空喷金，扫描电镜观察。
1.5 统计学处理 数据采用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用t检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 三组动物用药前后听阈的变化 见表1(15只豚鼠，30只耳)。
2.2 扫描电镜观察结果 对照组：钩端及基底圈呈现多数区域性外毛细胞缺失(图1)，内毛细胞有少量缺失；二、三圈外毛细胞呈散在性缺失，内毛细胞缺失较少。实验组：一、二圈外毛细胞呈散在性缺失，钩端呈局限性片状缺失；个别耳蜗的基底圈呈正常结构(图2)。
表1 三组动物用药前后听阈(dBSPL)的变化 (
±s,dB)n
用药前
用药后
空白对照组
, 百拇医药
15
18.00±6.24
19.33±7.62
对照组
15
18.33±6.34
57.67±6.40△
实验组
15
18.67±7.65
51.83±6.76△
用药前三组听阈比较差异无显著性(P>0.05)；△：造模后空白对照与实验组、对照组听阈比较P<0.01;★：造模后实验组与对照组听阈比较P<0.05
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图1 对照组耳蜗扫描 图2 实验组耳蜗扫描
电镜(×1500) 电镜(×1500)
从ARB阈值及耳蜗扫描电镜观察所见，可以说明bFGF对庆大霉素所致活体豚鼠耳蜗损害有拮抗作用。
3 讨论
LOW等(1996)证实bFGF对新霉素所致离体耳蜗毛细胞损害有保护作用[1]。翟所强等(1997)观察到aFGF及bFGF活体耳蜗灌注对爆震性耳聋CAP听阈恢复有促进作用，有延缓和减轻或阻滞耳蜗毛细胞的进一步恶化[2]。本实验结果从耳蜗形态及听功能阈值上均证实腹腔注射bFGF对庆大霉素所致活体耳蜗损伤有拮抗作用，能减轻庆大霉素对活体耳蜗的毒性，对耳蜗损伤起一定程度的保护作用。
耳蜗毛细胞及支持细胞表面均存在成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)。在耳蜗受损伤后FGRF表达增高，提示成纤维细胞生长因子在耳蜗损伤后修复过程中着重要作用[3]。FGFR是能引起细胞内多种变化的酪氨酸激酶[4]。bFGF与毛细胞表面FGFR结合并使其激活，毛细胞内发生磷酸化，从而调制毛细胞功能，使毛细胞内钙离子水平下降，并抑制毛细胞凋亡基因的表达，最终抑制毛细胞凋亡，使毛细胞对氨基糖甙类抗生素耳毒性产生拮抗作用[1]。
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翟所强等[2]采用aFGF及bFGF耳蜗内灌注的方法观察其对爆震性耳蜗损伤的治疗作用，这种方法易于理解，因为aFGF及bFGF直接进入外淋巴中，由于神经元的轴突和突触与外淋巴液和外淋巴间隙相通，这一途径可为生长因子提供一种传递的方式。内耳由于骨壳的包围，除了通过内淋巴管、囊和耳蜗导管水管外，它是唯一的与机体其他腔隙隔离的器官。这样内耳就有可能在其自身微环境中得到治疗。正是由于内耳骨壳的包围，构成了血迷路屏障，bFGF分子量较大，难以通过血迷路屏障[5]。那么豚鼠腹腔给药，是通过什么机理起作用的呢其一，可能是bFGF进入机体后经过代谢降解，其有生物活性片段能通过血迷路屏障，进入内耳而起疗效。其二，可能是bFGF进入机体后刺激了神经内分泌系统，使内源性生长因子产生及分泌增加，从而达到治疗作用。这两点推测尚需实验进一步证实，或许还有其它机制参与。
本实验结果显示豚鼠腹腔注射bFGF后实验组和对照组ARB听阈差异有显著性，但实验组和空白对照组差异亦有显著性，表明腹腔注射bFGF对庆大霉毒所致活体耳蜗损伤有拮抗作用，但无治疗作用。究其原因可能是bFGF难以通过血迷路屏障及进入内耳微环境，不能直接作用于耳蜗毛细胞，从而影响bFGF疗效的发挥。如能将bFGF以无创伤的方法导入内耳也许作用更佳。将bFGF传递至迷路外淋巴液的方法可能包括将bFGF直接滴入中耳腔，通过圆窗膜扩散或透入或经开口直接灌入迷路本身。将bFGF结合于载体分子透过内皮细胞则是另一种可能的传递方式。可植入的多聚体，可植入的基因工程细胞(包在胶囊内)和携带有bFGF基因的病毒基因媒介物的引入，则是在长期条件下将bFGF传递至内耳的其它可能手段。相信随着技术的进步，bFGF导入内耳的方法会日渐成熟，为治疗因毛细胞损害而引起的听功能障碍提供一个新路子。
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4 参考文献
1 Low W, Dazert, S, Baind A. Basic fibroblast growth factor (FGF-2) protects rat cochlear hair cells in organotypical culture from aminoglycoside injury. J Cellular Physiology, 1996, 167: 443
2 翟所强，成晋川，王嘉陵.成纤维细胞生长因子耳蜗内灌注防治爆震性聋的实验研究.中华耳鼻咽喉科学杂志，1997，32(6)：354
3 Pirvola U, Cao Y, Oellig C. The site of action of neuronal acidic fibroblast growth factor is the organ of corti of rat ochlea. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:9269
4 Schlessinger J, Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron, 1992, 9:383
5 John SK, Pybak LP, Prado S. Nature of blood-labyrinth barrier in experimental condition. Ann Otol, 1981, 90:135, http://www.100md.com