地甘口服液对辐射损伤小鼠胸腺和脾脏基质细胞集落形成的影响
作者：梁 毅 鲁新华 喻东姣 陈如泉
单位：梁 毅 鲁新华 陈如泉 湖北中医学院附属医院，湖北 武汉 430061；喻东姣 同济医科大学附属协和医院细胞培养室，湖北 武汉 430022
关键词：辐射损伤；基质细胞；胸腺；脾脏；地甘口服液
中国中西医结合急救杂志991001 摘要：目的：研究补肾益气养血复方中药地甘口服液对辐射损伤小鼠胸腺、脾脏基质细胞形成的影响。方法：小鼠接受60Coγ射线6 Gy照射后，立即给予地甘口服液灌服治疗，每日2次(每次0.5～0.6 ml)，连续7日，第8日无菌状态下取胸腺及脾脏制成单细胞悬液。取一定浓度细胞分别进行培养，定期观察生长情况，并于第14日计数其基质细胞集落形成单位。结果：辐射损伤组小鼠的胸腺、脾脏培养的基质细胞集落数(分别为7.619±1.340和3.450±0.915)均明显低于正常组(分别为17.320±1.875和8.000±0.966)，P均<0.01，地甘口服液组小鼠胸腺和脾脏的基质细胞集落数(14.740±1.013和6.361±0.819)虽较正常组低(P均<0.01)，但仍明显高于辐射损伤组(P均<0.01)。结论：地甘口服液能增强辐射损伤小鼠胸腺、脾脏基质细胞的形成。
, 百拇医药
中图分类号：Q249;R339.57 文献标识码：A 文章编号：1008-9691(1999)10-0435-03
Influences of Digan Oral Liquid (地甘口服液) on colony forming unit of thymus and spleen stroma cells in mice injuried by radiation
LIANG Yi,LU Xinhua,YU Dongjiao.1Affiliated Hospital of Hubei Traditional Chinese Medical College,Hubei Wuhan 430061
Abstract:Objective:To study the influences of compound Digan Oral Liquid 〔(DGOL,地甘口服液),Bushen Yiqi Yangxue herbs(补肾益气养血中药)〕,on colony forming unit of thymus and spleen stroma cells in mice injuried by radiation.Methods:Being irradiated by 6 Gy 60Coγray later,the mice were feed with DGOL immediately to treat two times a day (0.50.6 ml each time)for 7 days.On 8th day the thymus and spleen were taken aseptically to prepare the suspension of single cell then certain concentration of cells was cultured separately.The conditions of cell growth were observed and on 14th day the fibroblastic colony forming units (CFUF) were counted.Results:The numbers of thymus and spleen stroma cells cultured in mice injuried by radiation (7.619±1.340 and 3.450±0.915) were significantly lower than those in normal group (17.320±1.875 and 8.000±0.966，both P<0.01).Although the numbers of stroma cells in DGOL group (14.740±1.013 and 6.361±0.819)were lower than those in normal group (both P<0.01),they were significantly higher than those in healthy group recovering from radiation injury(both P<0.01).Conclusions:DGOL is able to enhance the formation of thymus and spleen stroma cells in mice injuried by radiation.
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Key words:radiation injury;stroma cell;thymus;spleen;Digan Oral Liquid
CLC number:Q249;R339.57 Document code:A Artical ID:1008-9691(1999)10-0435-03
胸腺和脾脏基质细胞构成了胸腺及脾脏的特异性微环境，担当着各种血细胞及免疫细胞增生和分化中的多功能成分，它们可能是复合细胞因子介导的网络中的活跃组分，是细胞成熟的基础环境〔1，2〕。关于辐射对小鼠胸腺、脾脏基质细胞损伤的研究已有过部分报道〔3，4〕，但至今尚未见益气养血复方中药在小鼠大剂量辐射免疫、造血损伤修复中发挥作用的报道。本研究观察了地甘口服液对急性辐射损伤小鼠胸腺和脾脏体外培养的基质细胞形成的影响，报告如下。
1 材料与方法
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1.1 动物：Balb/c小鼠27只，8～10周龄，体重16～18 g，雌雄各半，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。
1.2 药剂制备：地甘口服液由大剂量熟地黄、炙甘草、黄芪、当归(重量比为3∶3∶2∶1)为主组成，由湖北中医学院附属医院制剂室制备，经水煎、过滤、浓缩，配制成100%药液(即含生药1 g/ml)，分装成100 ml瓶备用。
1.3 动物分组与模型制备：小鼠27只随机分成3组，每组9只，分别为：①正常组；②辐射损伤组：用60Coγ射线6 Gy距离4 m全身照射，照射率1.27 Gy/min；③地甘口服液组，小鼠经放射照射后，立即给予地甘口服液灌服，每次0.5～0.6 ml，每日2次，连续7日。
1.4 主要试剂及仪器：60Coγ放射治疗机(FYC50 H型，上海医疗器械二厂)；CO2培养箱(Farma INC.USA)；超净工作台(Forma INC.USA)；倒置显微镜(TMT2型Olympus)；RPMI1640、20%小牛血清(Gibco.CO)；氢化可的松(Sigma Co.)。
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1.5 小鼠胸腺、脾脏细胞悬液制备〔5〕：小鼠经60Co照射后7日，颈椎脱臼处死，95%乙醇浸泡消毒5分钟，无菌取出胸腺及脾脏，分别加少许RPMI1640液清洗，除去表面血污及粘附的结缔组织；再次清洗后，用手术刀、剪刀反复剪切组织，直到成糊状，再轻轻碾碎用200目尼龙网过滤，使之成为单细胞悬液，计数后配成所需浓度，并经台盼蓝鉴定细胞活性应在95%以上。
1.6 培养体系制备〔6〕：每瓶总培养体系为10 ml，RPMI1640培养液加入20%小牛血清(V∶V)，氢化可的松10-6 mol/L，再加小鼠胸腺或脾脏单细胞悬液，细胞浓度为2×106/ml。
1.7 基质细胞集落(CFUF)的培养：收上述培养体系置37 ℃、5% CO2培养箱内孵育，第7日半量换液，培养14日。
, 百拇医药
1.8 染色及计数〔6〕：培养14日后，倒出培养液，用生理盐水将CFUF表面洗涤2次，加入甲醇溶液，固定20分钟弃去，用自来水冲洗CFUF表面，加姬姆萨染液，盖过全细胞，边染色边观察，直至能分辨细胞核和细胞浆，颜色适度即倒出染液，自来水冲洗，待其自然干燥后，于倒置显微镜下计数，由40个以上成纤维细胞组成的集落为1个CFUF。
1.9 统计学方法：数据均用均数±标准差(
±s)表示，采用t检验。
2 结 果
2.1 各实验组胸腺、脾脏基质细胞的生长况状：正常组胸腺、脾脏的单细胞悬液于培养的第2和第3日，即出现贴壁的圆形细胞及少量梭形细胞；第7日梭形细胞增多并组成一个个的小细胞丛；第10日后，基质细胞丛变大，细胞数增多而形成集落；第14日镜下观察，细胞分布均匀而浓密，贴壁层以梭形的基质细胞为主构成，伪足明显较长。辐射损伤组成纤维细胞的生长明显缓慢，大多于培养的第7日和第8日长出贴壁细胞，少数于培养的第5日长出，2周后形成的基质细胞零落、分散，贴壁层多为圆形细胞，仅少数成纤维细胞，且伪足不明显。地甘口服液组的基质细胞生长状况介于上两者之间，其CFUF集落数虽较正常组少，但较辐射损伤组CFUF分布明显增多，分布均匀，且以成纤维细胞为主，伪足已清晰可辨。
, 百拇医药
相对于胸腺、脾脏的单细胞悬液于相同培养体系中培养，脾脏基质细胞的分布、数量较少。
2.2 地甘口服液对辐射损伤小鼠胸腺和脾脏CFUF形成的影响见表1。
表1 各组胸腺和脾脏CFUF数量的变化(±s) 组别
动物数(只)
胸腺CFUF
脾脏CFUF
正常组
9
17.320±1.875
, 百拇医药
8.000±0.966
辐射损伤组
9
7.619±1.340△
3.450±0.915△
地甘口服液组
9
14.740±1.013△*
6.361±0.819△*
注：与正常组比较：△P<0.01；与辐射损伤组比较：*P<0.01
, 百拇医药
3 讨 论
免疫器官(胸腺、脾脏)基质细胞是确定免疫细胞生存、增殖和特异分化方面的微环境，对实质细胞起支持、营养与调控作用。胸腺、脾脏的特点是辐射敏感性都很高，经很小剂量的照射，其中的淋巴细胞就能发生形态和功能变化。在实验中观察到，只有具备生存能力的淋巴细胞才保留在与基质细胞接触的部位，可能是通过这种方式，淋巴细胞获得必需的新陈代谢产物及ATP形成的能量〔7〕。因此，基质细胞的培养及其生长状况在一定水平上反映出辐射对机体免疫器官、细胞的损伤程度。
地甘口服液用大量熟地为主药，以补肾滋阴化精填髓，配炙甘草、黄芪益气生血，加当归以养血活血，诸药合用共奏补肾益气养血之功。实验表明，其对辐射损伤小鼠的一般状况、外周血细胞计数、骨髓有核细胞计数均有明显改善。在相关的研究中，我们发现地甘口服液对辐射损伤小鼠的骨髓成纤维细胞集落形成同样有促进作用，提示补肾益气养血中药地甘口服液对辐射损伤小鼠各种血细胞的恢复和重建，具有良好的促进作用，从而表明其具有一定的抗辐射效果。
, 百拇医药
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(97J080)
作者简介：梁 毅(1963-)，男(汉族)，河南开封人，博士，讲师，主治医师。主要研究方向为中医、中西医结合治疗血液病的研究。先后设计、承担部级研究课题1项，省级课题6项；通过省级科技成果鉴定2项；获省级科技进步三等奖1项，省卫生厅科技进步二等奖1项。发表学术论文10余篇。
参考文献：
〔1〕Gimble J M,Pietrangeli C,Henley A,et al.Characterization of murine bone marrow and spleenderived stroma cell:analysis of leucocyte marker and growth factor mRNA transcript levels.Blood,1989,74(1):303305.
, http://www.100md.com
〔2〕陈文杰.血液分子细胞生物学.第1版.北京：中国医药科技出版社，1993.4452.
〔3〕张红梅，凌燕.小鼠胸腺基质细胞辐射损伤效应.辐射研究与辐射工艺学报，1995，13(4)：225228.
〔4〕于洪臣，凌燕.小鼠免疫器官(胸腺、脾脏和淋巴结)成克隆基质祖细胞辐射敏感性的研究.辐射研究与辐射工艺学报，1996，14(1)：5962.
〔5〕汪谦.现代医学实验方法.第1版.北京：人民卫生出版社，1997.129132.
〔6〕唐佩弦.造血细胞培养技术.第1版.西安：陕西科技出版社，1985.1196.
〔7〕刘及.辐射血液学.第1版.北京：原子能出版社，1991.171186.
(收稿日期：1999-04-14 修回日期：1999-09-17), 百拇医药
单位：梁 毅 鲁新华 陈如泉 湖北中医学院附属医院，湖北 武汉 430061；喻东姣 同济医科大学附属协和医院细胞培养室，湖北 武汉 430022
关键词：辐射损伤；基质细胞；胸腺；脾脏；地甘口服液
中国中西医结合急救杂志991001 摘要：目的：研究补肾益气养血复方中药地甘口服液对辐射损伤小鼠胸腺、脾脏基质细胞形成的影响。方法：小鼠接受60Coγ射线6 Gy照射后，立即给予地甘口服液灌服治疗，每日2次(每次0.5～0.6 ml)，连续7日，第8日无菌状态下取胸腺及脾脏制成单细胞悬液。取一定浓度细胞分别进行培养，定期观察生长情况，并于第14日计数其基质细胞集落形成单位。结果：辐射损伤组小鼠的胸腺、脾脏培养的基质细胞集落数(分别为7.619±1.340和3.450±0.915)均明显低于正常组(分别为17.320±1.875和8.000±0.966)，P均<0.01，地甘口服液组小鼠胸腺和脾脏的基质细胞集落数(14.740±1.013和6.361±0.819)虽较正常组低(P均<0.01)，但仍明显高于辐射损伤组(P均<0.01)。结论：地甘口服液能增强辐射损伤小鼠胸腺、脾脏基质细胞的形成。
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中图分类号：Q249;R339.57 文献标识码：A 文章编号：1008-9691(1999)10-0435-03
Influences of Digan Oral Liquid (地甘口服液) on colony forming unit of thymus and spleen stroma cells in mice injuried by radiation
LIANG Yi,LU Xinhua,YU Dongjiao.1Affiliated Hospital of Hubei Traditional Chinese Medical College,Hubei Wuhan 430061
Abstract:Objective:To study the influences of compound Digan Oral Liquid 〔(DGOL,地甘口服液),Bushen Yiqi Yangxue herbs(补肾益气养血中药)〕,on colony forming unit of thymus and spleen stroma cells in mice injuried by radiation.Methods:Being irradiated by 6 Gy 60Coγray later,the mice were feed with DGOL immediately to treat two times a day (0.50.6 ml each time)for 7 days.On 8th day the thymus and spleen were taken aseptically to prepare the suspension of single cell then certain concentration of cells was cultured separately.The conditions of cell growth were observed and on 14th day the fibroblastic colony forming units (CFUF) were counted.Results:The numbers of thymus and spleen stroma cells cultured in mice injuried by radiation (7.619±1.340 and 3.450±0.915) were significantly lower than those in normal group (17.320±1.875 and 8.000±0.966，both P<0.01).Although the numbers of stroma cells in DGOL group (14.740±1.013 and 6.361±0.819)were lower than those in normal group (both P<0.01),they were significantly higher than those in healthy group recovering from radiation injury(both P<0.01).Conclusions:DGOL is able to enhance the formation of thymus and spleen stroma cells in mice injuried by radiation.
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Key words:radiation injury;stroma cell;thymus;spleen;Digan Oral Liquid
CLC number:Q249;R339.57 Document code:A Artical ID:1008-9691(1999)10-0435-03
胸腺和脾脏基质细胞构成了胸腺及脾脏的特异性微环境，担当着各种血细胞及免疫细胞增生和分化中的多功能成分，它们可能是复合细胞因子介导的网络中的活跃组分，是细胞成熟的基础环境〔1，2〕。关于辐射对小鼠胸腺、脾脏基质细胞损伤的研究已有过部分报道〔3，4〕，但至今尚未见益气养血复方中药在小鼠大剂量辐射免疫、造血损伤修复中发挥作用的报道。本研究观察了地甘口服液对急性辐射损伤小鼠胸腺和脾脏体外培养的基质细胞形成的影响，报告如下。
1 材料与方法
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1.1 动物：Balb/c小鼠27只，8～10周龄，体重16～18 g，雌雄各半，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。
1.2 药剂制备：地甘口服液由大剂量熟地黄、炙甘草、黄芪、当归(重量比为3∶3∶2∶1)为主组成，由湖北中医学院附属医院制剂室制备，经水煎、过滤、浓缩，配制成100%药液(即含生药1 g/ml)，分装成100 ml瓶备用。
1.3 动物分组与模型制备：小鼠27只随机分成3组，每组9只，分别为：①正常组；②辐射损伤组：用60Coγ射线6 Gy距离4 m全身照射，照射率1.27 Gy/min；③地甘口服液组，小鼠经放射照射后，立即给予地甘口服液灌服，每次0.5～0.6 ml，每日2次，连续7日。
1.4 主要试剂及仪器：60Coγ放射治疗机(FYC50 H型，上海医疗器械二厂)；CO2培养箱(Farma INC.USA)；超净工作台(Forma INC.USA)；倒置显微镜(TMT2型Olympus)；RPMI1640、20%小牛血清(Gibco.CO)；氢化可的松(Sigma Co.)。
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1.5 小鼠胸腺、脾脏细胞悬液制备〔5〕：小鼠经60Co照射后7日，颈椎脱臼处死，95%乙醇浸泡消毒5分钟，无菌取出胸腺及脾脏，分别加少许RPMI1640液清洗，除去表面血污及粘附的结缔组织；再次清洗后，用手术刀、剪刀反复剪切组织，直到成糊状，再轻轻碾碎用200目尼龙网过滤，使之成为单细胞悬液，计数后配成所需浓度，并经台盼蓝鉴定细胞活性应在95%以上。
1.6 培养体系制备〔6〕：每瓶总培养体系为10 ml，RPMI1640培养液加入20%小牛血清(V∶V)，氢化可的松10-6 mol/L，再加小鼠胸腺或脾脏单细胞悬液，细胞浓度为2×106/ml。
1.7 基质细胞集落(CFUF)的培养：收上述培养体系置37 ℃、5% CO2培养箱内孵育，第7日半量换液，培养14日。
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1.8 染色及计数〔6〕：培养14日后，倒出培养液，用生理盐水将CFUF表面洗涤2次，加入甲醇溶液，固定20分钟弃去，用自来水冲洗CFUF表面，加姬姆萨染液，盖过全细胞，边染色边观察，直至能分辨细胞核和细胞浆，颜色适度即倒出染液，自来水冲洗，待其自然干燥后，于倒置显微镜下计数，由40个以上成纤维细胞组成的集落为1个CFUF。
1.9 统计学方法：数据均用均数±标准差(
±s)表示，采用t检验。2 结 果
2.1 各实验组胸腺、脾脏基质细胞的生长况状：正常组胸腺、脾脏的单细胞悬液于培养的第2和第3日，即出现贴壁的圆形细胞及少量梭形细胞；第7日梭形细胞增多并组成一个个的小细胞丛；第10日后，基质细胞丛变大，细胞数增多而形成集落；第14日镜下观察，细胞分布均匀而浓密，贴壁层以梭形的基质细胞为主构成，伪足明显较长。辐射损伤组成纤维细胞的生长明显缓慢，大多于培养的第7日和第8日长出贴壁细胞，少数于培养的第5日长出，2周后形成的基质细胞零落、分散，贴壁层多为圆形细胞，仅少数成纤维细胞，且伪足不明显。地甘口服液组的基质细胞生长状况介于上两者之间，其CFUF集落数虽较正常组少，但较辐射损伤组CFUF分布明显增多，分布均匀，且以成纤维细胞为主，伪足已清晰可辨。
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相对于胸腺、脾脏的单细胞悬液于相同培养体系中培养，脾脏基质细胞的分布、数量较少。
2.2 地甘口服液对辐射损伤小鼠胸腺和脾脏CFUF形成的影响见表1。
表1 各组胸腺和脾脏CFUF数量的变化(
±s) 组别动物数(只)
胸腺CFUF
脾脏CFUF
正常组
9
17.320±1.875
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8.000±0.966
辐射损伤组
9
7.619±1.340△
3.450±0.915△
地甘口服液组
9
14.740±1.013△*
6.361±0.819△*
注：与正常组比较：△P<0.01；与辐射损伤组比较：*P<0.01
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3 讨 论
免疫器官(胸腺、脾脏)基质细胞是确定免疫细胞生存、增殖和特异分化方面的微环境，对实质细胞起支持、营养与调控作用。胸腺、脾脏的特点是辐射敏感性都很高，经很小剂量的照射，其中的淋巴细胞就能发生形态和功能变化。在实验中观察到，只有具备生存能力的淋巴细胞才保留在与基质细胞接触的部位，可能是通过这种方式，淋巴细胞获得必需的新陈代谢产物及ATP形成的能量〔7〕。因此，基质细胞的培养及其生长状况在一定水平上反映出辐射对机体免疫器官、细胞的损伤程度。
地甘口服液用大量熟地为主药，以补肾滋阴化精填髓，配炙甘草、黄芪益气生血，加当归以养血活血，诸药合用共奏补肾益气养血之功。实验表明，其对辐射损伤小鼠的一般状况、外周血细胞计数、骨髓有核细胞计数均有明显改善。在相关的研究中，我们发现地甘口服液对辐射损伤小鼠的骨髓成纤维细胞集落形成同样有促进作用，提示补肾益气养血中药地甘口服液对辐射损伤小鼠各种血细胞的恢复和重建，具有良好的促进作用，从而表明其具有一定的抗辐射效果。
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基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(97J080)
作者简介：梁 毅(1963-)，男(汉族)，河南开封人，博士，讲师，主治医师。主要研究方向为中医、中西医结合治疗血液病的研究。先后设计、承担部级研究课题1项，省级课题6项；通过省级科技成果鉴定2项；获省级科技进步三等奖1项，省卫生厅科技进步二等奖1项。发表学术论文10余篇。
参考文献：
〔1〕Gimble J M,Pietrangeli C,Henley A,et al.Characterization of murine bone marrow and spleenderived stroma cell:analysis of leucocyte marker and growth factor mRNA transcript levels.Blood,1989,74(1):303305.
, http://www.100md.com
〔2〕陈文杰.血液分子细胞生物学.第1版.北京：中国医药科技出版社，1993.4452.
〔3〕张红梅，凌燕.小鼠胸腺基质细胞辐射损伤效应.辐射研究与辐射工艺学报，1995，13(4)：225228.
〔4〕于洪臣，凌燕.小鼠免疫器官(胸腺、脾脏和淋巴结)成克隆基质祖细胞辐射敏感性的研究.辐射研究与辐射工艺学报，1996，14(1)：5962.
〔5〕汪谦.现代医学实验方法.第1版.北京：人民卫生出版社，1997.129132.
〔6〕唐佩弦.造血细胞培养技术.第1版.西安：陕西科技出版社，1985.1196.
〔7〕刘及.辐射血液学.第1版.北京：原子能出版社，1991.171186.
(收稿日期：1999-04-14 修回日期：1999-09-17), 百拇医药