心复康口服液对大鼠实验心衰模型心肌Ca2+定位及Ca2+-ATPase活性的影响
作者：胡元会，车维新，曹贵民，黄启福
单位：胡元会，黄启福(北京中医药大学 北京 100029)；车维新(昆明市官渡区中医院 云南 昆明 650000)；曹贵民(陕西中医学院 陕西 咸阳 712083)
关键词：心复康口服液；Ca2+定位；Ca2+-ATPase
中国中医基础医学杂志991011 摘 要：目的 探讨心复康口服液改善心功能的作用机制。方法 通过腹腔注射阿霉素复制大鼠心衰模型，以电镜细胞化学方法，研究中药心复康口服液对大鼠心衰模型心肌Ca2+定位及Ca2+-ATPase活性的影响。结果 阿霉素模型组心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒明显增多，高电子密度沉淀物大量沉着于肌膜内侧、线粒体膜及肌质中，肌浆网内以及肌丝周围沉淀颗粒较大，散在或聚集分布，有的连成丝团状。心复康组心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较正常对照组多，较ADR组显著减少，沉着颗粒主要见于线粒体和肌浆网内，密度较低。Ca2+-ATPase活性观察发现，ADR模型组心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物在肌膜和线粒体膜上较多。心复康治疗组心肌细胞Ca2+ATPase反应较正常对照组、ADR模型组增强，反应物广泛分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处，呈细小园颗粒状，几乎连成线状围绕上述生物膜分布。结论 提示心复康口服液具有一定的钙拮抗作用，其机制可能是通过提高Ca2+-ATPase活性促进Ca2+转运而发挥作用。
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中药心复康口服液是我们临床治疗扩张型心肌病充血性心衰的经验方。临床研究证实，本方具有改善临床症状和心功，提高病人生活质量的作用。为了探讨其可能的作用机制，我们研究了心复康口服液对大鼠阿霉素心衰模型心肌细胞Ca2+定位及Ca2+-ATPase活性的影响，现报道如下：
材料与方法
1 药品和试剂
1.1 中药心复康口复液的制备
系由人参、黄芪、丹参、附子、淫羊藿、灵芝等药物组成。每支10ml，每ml含生药1.5g。
1.2 盐酸阿霉素(ADR)10mg/支，浙江海门制药厂生产。
1.3 还原型辅酶Ⅱ，还原型谷胱甘肽，谷胱甘肽还原酶，黄嘌呤氧化霉和黄嘌呤均系Sigma产品。
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2 实验动物分组及给药
SD大鼠10只，体重180 g～200 g，雌雄各半，由第四军医大学实验动物中心供给。饲料为标准合成大鼠饲料，购于由第四军医大学实验动物中心。自由饮用自来水。动物分为三组：正常对照组(2只)，大鼠腹腔注射1ml生理盐水，每周1次，共注射6次；ADR模型组(4只)，大鼠腹腔注射ADR，按2 mg/kg剂量溶于生理盐水，每次1 ml，每周1次，共注射6次；中药心复康治疗组(4只)，大鼠ADR给法同阿霉素组，并用心复康口服液灌胃，2 ml/次，每天1次，共灌胃6周；于末次灌胃后24 h取材制作标本。
3 检测指标及方法
3.1 心肌细胞Ca2+定位用细胞化学PPA法观察[1]
在心尖处取小于1 mm3组织块，迅速投入3%戊二醛与0.09 mol/L草酸钾混合固定液(用1mol/L KOH调pH7.4)中低温(4℃)固定2 h，再用0.09mol/L KH2PO4(内加7.5%蔗糖)溶液洗涤15 min，然后切成75μ薄片，此薄片用1%OsO4和2%焦锑酸钾混合液固定2 h(室温)，再用pH10.0蒸馏水(用0.1 mol/L KOH调节)洗涤15 min,再用乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，LKB-4800超薄切片机切片，乙酸双氧铀及柠檬酸铅染色，JEM-2000EX透射电镜观察。
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3.2 心肌细胞Ca2+-ATPase活性用枸橼酸铅法观察[2]
在心尖处取小于1 mm3组织块，迅速投入2%多聚甲醛和0.25%戊二醛固定液内，低温下固定20 min，用含8%蔗糖的0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液洗涤数次，时间在60 min以上。用振荡切片机切出40μm的薄片在用1 mmol/L的EDTA溶液预浸渍30 min，用缓冲液洗净，置孵育液中37℃孵育20 min。孵育液组成：三磷酸腺苷18 mg，双蒸水25 ml，1.0 mol/L甘氨酸—氢氧化钾缓冲液2.5ml，1.0 mol/LCaCl2 1.0 ml，左旋咪唑6.0 mg，10 mmol/L枸橼酸铅4.0 ml，调pH为9.0～9.4。孵育后用缓冲液浸洗干净，在1%OsO4固定液中固定10 min。用双蒸水洗涤，乙醇系列脱水、浸透、包埋、超薄切片、铀染1min，铅染30s后在JEM-2000EX透射电镜下观察。
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实验结果
1 心复康口服液对大鼠心衰模型心肌细胞Ca2+定位的影响
正常对照组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较少，仅在肌膜、线粒体膜及基质中，肌浆网中有少量高电子密度沉淀物(图1)。ADR模型组：心肌细胞内各部Ca2+沉淀颗粒明显增多，高电子密度沉淀物大量沉着于肌膜内侧、线粒体膜及肌质中，肌浆网内以及肌丝周围沉淀颗粒较大，散在或聚集分布，有的连成丝团状(图2)。心复康治疗组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较正常对照组多，较ADR组显著减少。沉着颗粒主要见于线粒体和肌浆网内，密度较低(图3)。
2 心复康口服液对大鼠心衰模型心肌细胞Ca2+-ATPase活性的影响
正常对照组：未加入ATP-Na+盐孵育的阴性切片未见Ca2+-ATPase反应物沉淀(图4)，加入寡霉素孵育的抑制切片仅在肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜周围见到少量反应物(图5)。而阳性切片上可见肌膜、线粒体膜及肌浆网膜周围见到大量反应物沉结，以肌浆网膜最明显(图6)。ADR模型组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物在肌膜和线粒体膜上较多(图7)。心复康治疗组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应较ADR模型组增强，反应物分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处，呈细小园颗粒状，几乎连成线状围绕上述生物膜分布(图8)。
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图1 正常对照组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较少，仅在肌膜、线粒体膜及肌质中可见(20000倍)
图2 ADR模型照组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒明显增多散在或聚集分布，有的连成丝团状(20000倍)
图3 心复康治疗组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较正常对照组多，较ADR模型组显著减少，沉淀颗粒主要见于线粒体和肌浆网内(20000倍)
图4 正常对照组(阴性切片)：未见Ca2+-ATPase反应物沉淀(20000倍)
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图5 正常对照组(抑制切片)：仅在肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜周围见到少量Ca2+-ATPase反应物沉淀(20000倍)
图6 正常对照组(阳性切片)：肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜周围有大量
Ca2+-ATPase反应物沉淀(20000倍)
图7 ADR模型组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物在肌膜和线粒体膜较多(20000倍)
图8 心复康治疗组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应增强，沉淀物广泛分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处呈细小颗粒，连成线状(20000倍)
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讨论
心肌细胞Ca2+内流增加导致Ca2+超负荷是阿霉素性心衰的主要机制之一。Olson证实，兔子ADR心肌病的组织钙含量增加[3]。Chacon等证实，ADR引起的心肌损伤中，Ca2+可导致线粒体膜通透性增加[4]。提示ADR的心肌损伤作用与心肌细胞Ca2+慢通道的开放，钙离子大量内流，钙离子以羟磷灰石的形式在线粒体内沉淀，使线粒体功能障碍进而引起能量代谢异常和离子转运紊乱有关。本实验发现，ADR模型组心肌细胞内各部Ca2+沉淀颗粒明显增多，提示Ca2+超负荷参与了ADR心衰的发生。心复康治疗组心肌细胞内各部Ca2+沉淀颗粒明显少于ADR模型组，提示该药可防止过多的Ca2+进入细胞内引起细胞损伤，Ca2+-ATPase是调节细胞内Ca2+平衡的主要酶之一，可将Ca2+主动转出细胞外或转入细胞内Ca2+贮库，防止细胞Ca2+超载。本实验发现ADR模型组心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物多在肌膜和线粒体膜上，提示由于细胞生物膜上Ca-ATPase活性降低，以至进入细胞内过多的Ca2+不能被及时转运出细胞或转进Ca2+内贮库，从而使细胞内Ca2+超负荷，导致心肌细胞变性、坏死。而心复康治疗组心肌细胞Ca2+-ATPase反应较ADR模型组增强，反应物分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处，说明药物可通过增强细胞膜上Ca2+-ATPase活性，将进入细胞内的Ca2+移出，同时线粒体和肌浆网膜上Ca2+-ATPase活性增强，将部分Ca2+移入内贮存，防止Ca2+超负荷，心复康口服液是我们应用于临床治疗气阳不足，湿瘀阻滞型充血性心衰的有效中药口服液，主要由黄芪、丹参、附子、淫羊藿、灵芝等药物组成。具有益气温阳、活血化瘀的功能。近年来有研究表明，黄芪、丹参、附片、灵芝等单味中药均有Ca2+拮抗作用(5)。结合本文研究结果提示，心复康口服液可能通过提高Ca2+-ATPase活性，促进心肌细胞Ca2+转运，发挥其Ca2+拮抗作用。
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作者简介：胡元会，男，36岁，1998年从山东中医药大学毕业，获医学博士学位，现在北京中医药大学病理教研室从事博士后研究工作。主要从事中医药防治血管性痴呆的机理的研究。
参考文献
[1] Borgers M,Thone F,Vorheyen A,et al.Localization of Calcium in skeletal and cardiac muscle.Histochem J,1984,16:295-304.
[2] 陈明霞，杨少毅，郑海燕.Ca-ATPase活性的细胞化学法初探.西安医科大学学报，1992，13(1)：12-13.
[3] Olson HM,David M,Yong,et al.Eelectrolyte and morphologic alteration og myocardium in adriamycin-treated rabbits.American joumal of pathology,1974,77(3):439-450.
[4] Chacon E,Acosta D.Mitochondrial regulation of superoxide by Ca2+:An alternate mechanism for the cardiotoxicity of doxorubicin.Toxicology and applied pharmacology,1991,107:117-128.
[5] 赵东科.钙拮抗剂的药理与临床.西安：陕西人民教育出版社，1991.246., http://www.100md.com
单位：胡元会，黄启福(北京中医药大学 北京 100029)；车维新(昆明市官渡区中医院 云南 昆明 650000)；曹贵民(陕西中医学院 陕西 咸阳 712083)
关键词：心复康口服液；Ca2+定位；Ca2+-ATPase
中国中医基础医学杂志991011 摘 要：目的 探讨心复康口服液改善心功能的作用机制。方法 通过腹腔注射阿霉素复制大鼠心衰模型，以电镜细胞化学方法，研究中药心复康口服液对大鼠心衰模型心肌Ca2+定位及Ca2+-ATPase活性的影响。结果 阿霉素模型组心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒明显增多，高电子密度沉淀物大量沉着于肌膜内侧、线粒体膜及肌质中，肌浆网内以及肌丝周围沉淀颗粒较大，散在或聚集分布，有的连成丝团状。心复康组心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较正常对照组多，较ADR组显著减少，沉着颗粒主要见于线粒体和肌浆网内，密度较低。Ca2+-ATPase活性观察发现，ADR模型组心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物在肌膜和线粒体膜上较多。心复康治疗组心肌细胞Ca2+ATPase反应较正常对照组、ADR模型组增强，反应物广泛分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处，呈细小园颗粒状，几乎连成线状围绕上述生物膜分布。结论 提示心复康口服液具有一定的钙拮抗作用，其机制可能是通过提高Ca2+-ATPase活性促进Ca2+转运而发挥作用。
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中药心复康口服液是我们临床治疗扩张型心肌病充血性心衰的经验方。临床研究证实，本方具有改善临床症状和心功，提高病人生活质量的作用。为了探讨其可能的作用机制，我们研究了心复康口服液对大鼠阿霉素心衰模型心肌细胞Ca2+定位及Ca2+-ATPase活性的影响，现报道如下：
材料与方法
1 药品和试剂
1.1 中药心复康口复液的制备
系由人参、黄芪、丹参、附子、淫羊藿、灵芝等药物组成。每支10ml，每ml含生药1.5g。
1.2 盐酸阿霉素(ADR)10mg/支，浙江海门制药厂生产。
1.3 还原型辅酶Ⅱ，还原型谷胱甘肽，谷胱甘肽还原酶，黄嘌呤氧化霉和黄嘌呤均系Sigma产品。
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2 实验动物分组及给药
SD大鼠10只，体重180 g～200 g，雌雄各半，由第四军医大学实验动物中心供给。饲料为标准合成大鼠饲料，购于由第四军医大学实验动物中心。自由饮用自来水。动物分为三组：正常对照组(2只)，大鼠腹腔注射1ml生理盐水，每周1次，共注射6次；ADR模型组(4只)，大鼠腹腔注射ADR，按2 mg/kg剂量溶于生理盐水，每次1 ml，每周1次，共注射6次；中药心复康治疗组(4只)，大鼠ADR给法同阿霉素组，并用心复康口服液灌胃，2 ml/次，每天1次，共灌胃6周；于末次灌胃后24 h取材制作标本。
3 检测指标及方法
3.1 心肌细胞Ca2+定位用细胞化学PPA法观察[1]
在心尖处取小于1 mm3组织块，迅速投入3%戊二醛与0.09 mol/L草酸钾混合固定液(用1mol/L KOH调pH7.4)中低温(4℃)固定2 h，再用0.09mol/L KH2PO4(内加7.5%蔗糖)溶液洗涤15 min，然后切成75μ薄片，此薄片用1%OsO4和2%焦锑酸钾混合液固定2 h(室温)，再用pH10.0蒸馏水(用0.1 mol/L KOH调节)洗涤15 min,再用乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，LKB-4800超薄切片机切片，乙酸双氧铀及柠檬酸铅染色，JEM-2000EX透射电镜观察。
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3.2 心肌细胞Ca2+-ATPase活性用枸橼酸铅法观察[2]
在心尖处取小于1 mm3组织块，迅速投入2%多聚甲醛和0.25%戊二醛固定液内，低温下固定20 min，用含8%蔗糖的0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液洗涤数次，时间在60 min以上。用振荡切片机切出40μm的薄片在用1 mmol/L的EDTA溶液预浸渍30 min，用缓冲液洗净，置孵育液中37℃孵育20 min。孵育液组成：三磷酸腺苷18 mg，双蒸水25 ml，1.0 mol/L甘氨酸—氢氧化钾缓冲液2.5ml，1.0 mol/LCaCl2 1.0 ml，左旋咪唑6.0 mg，10 mmol/L枸橼酸铅4.0 ml，调pH为9.0～9.4。孵育后用缓冲液浸洗干净，在1%OsO4固定液中固定10 min。用双蒸水洗涤，乙醇系列脱水、浸透、包埋、超薄切片、铀染1min，铅染30s后在JEM-2000EX透射电镜下观察。
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实验结果
1 心复康口服液对大鼠心衰模型心肌细胞Ca2+定位的影响
正常对照组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较少，仅在肌膜、线粒体膜及基质中，肌浆网中有少量高电子密度沉淀物(图1)。ADR模型组：心肌细胞内各部Ca2+沉淀颗粒明显增多，高电子密度沉淀物大量沉着于肌膜内侧、线粒体膜及肌质中，肌浆网内以及肌丝周围沉淀颗粒较大，散在或聚集分布，有的连成丝团状(图2)。心复康治疗组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较正常对照组多，较ADR组显著减少。沉着颗粒主要见于线粒体和肌浆网内，密度较低(图3)。
2 心复康口服液对大鼠心衰模型心肌细胞Ca2+-ATPase活性的影响
正常对照组：未加入ATP-Na+盐孵育的阴性切片未见Ca2+-ATPase反应物沉淀(图4)，加入寡霉素孵育的抑制切片仅在肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜周围见到少量反应物(图5)。而阳性切片上可见肌膜、线粒体膜及肌浆网膜周围见到大量反应物沉结，以肌浆网膜最明显(图6)。ADR模型组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物在肌膜和线粒体膜上较多(图7)。心复康治疗组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应较ADR模型组增强，反应物分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处，呈细小园颗粒状，几乎连成线状围绕上述生物膜分布(图8)。
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图1 正常对照组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较少，仅在肌膜、线粒体膜及肌质中可见(20000倍)
图2 ADR模型照组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒明显增多散在或聚集分布，有的连成丝团状(20000倍)
图3 心复康治疗组：心肌细胞内Ca2+沉淀颗粒较正常对照组多，较ADR模型组显著减少，沉淀颗粒主要见于线粒体和肌浆网内(20000倍)
图4 正常对照组(阴性切片)：未见Ca2+-ATPase反应物沉淀(20000倍)
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图5 正常对照组(抑制切片)：仅在肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜周围见到少量Ca2+-ATPase反应物沉淀(20000倍)
图6 正常对照组(阳性切片)：肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜周围有大量
Ca2+-ATPase反应物沉淀(20000倍)
图7 ADR模型组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物在肌膜和线粒体膜较多(20000倍)
图8 心复康治疗组：心肌细胞Ca2+-ATPase反应增强，沉淀物广泛分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处呈细小颗粒，连成线状(20000倍)
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讨论
心肌细胞Ca2+内流增加导致Ca2+超负荷是阿霉素性心衰的主要机制之一。Olson证实，兔子ADR心肌病的组织钙含量增加[3]。Chacon等证实，ADR引起的心肌损伤中，Ca2+可导致线粒体膜通透性增加[4]。提示ADR的心肌损伤作用与心肌细胞Ca2+慢通道的开放，钙离子大量内流，钙离子以羟磷灰石的形式在线粒体内沉淀，使线粒体功能障碍进而引起能量代谢异常和离子转运紊乱有关。本实验发现，ADR模型组心肌细胞内各部Ca2+沉淀颗粒明显增多，提示Ca2+超负荷参与了ADR心衰的发生。心复康治疗组心肌细胞内各部Ca2+沉淀颗粒明显少于ADR模型组，提示该药可防止过多的Ca2+进入细胞内引起细胞损伤，Ca2+-ATPase是调节细胞内Ca2+平衡的主要酶之一，可将Ca2+主动转出细胞外或转入细胞内Ca2+贮库，防止细胞Ca2+超载。本实验发现ADR模型组心肌细胞Ca2+-ATPase反应较弱，沉淀物多在肌膜和线粒体膜上，提示由于细胞生物膜上Ca-ATPase活性降低，以至进入细胞内过多的Ca2+不能被及时转运出细胞或转进Ca2+内贮库，从而使细胞内Ca2+超负荷，导致心肌细胞变性、坏死。而心复康治疗组心肌细胞Ca2+-ATPase反应较ADR模型组增强，反应物分布于肌纤维膜、线粒体膜及肌浆网膜各处，说明药物可通过增强细胞膜上Ca2+-ATPase活性，将进入细胞内的Ca2+移出，同时线粒体和肌浆网膜上Ca2+-ATPase活性增强，将部分Ca2+移入内贮存，防止Ca2+超负荷，心复康口服液是我们应用于临床治疗气阳不足，湿瘀阻滞型充血性心衰的有效中药口服液，主要由黄芪、丹参、附子、淫羊藿、灵芝等药物组成。具有益气温阳、活血化瘀的功能。近年来有研究表明，黄芪、丹参、附片、灵芝等单味中药均有Ca2+拮抗作用(5)。结合本文研究结果提示，心复康口服液可能通过提高Ca2+-ATPase活性，促进心肌细胞Ca2+转运，发挥其Ca2+拮抗作用。
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作者简介：胡元会，男，36岁，1998年从山东中医药大学毕业，获医学博士学位，现在北京中医药大学病理教研室从事博士后研究工作。主要从事中医药防治血管性痴呆的机理的研究。
参考文献
[1] Borgers M,Thone F,Vorheyen A,et al.Localization of Calcium in skeletal and cardiac muscle.Histochem J,1984,16:295-304.
[2] 陈明霞，杨少毅，郑海燕.Ca-ATPase活性的细胞化学法初探.西安医科大学学报，1992，13(1)：12-13.
[3] Olson HM,David M,Yong,et al.Eelectrolyte and morphologic alteration og myocardium in adriamycin-treated rabbits.American joumal of pathology,1974,77(3):439-450.
[4] Chacon E,Acosta D.Mitochondrial regulation of superoxide by Ca2+:An alternate mechanism for the cardiotoxicity of doxorubicin.Toxicology and applied pharmacology,1991,107:117-128.
[5] 赵东科.钙拮抗剂的药理与临床.西安：陕西人民教育出版社，1991.246., http://www.100md.com