益气补肾中药对肾阳虚大鼠垂体超微结构的影响
作者：宋春风，尹桂山，李向印，孙素菊，刘贵生
单位：河北医科大学 河北 石家庄 050017
关键词：益气补肾；肾阳虚；大鼠；垂体；超微结构
中国中医基础医学杂志991009 摘 要：目的 探讨肾阳虚的本质及益气补肾中药的作用机理。方法 以大量醋酸可的松造成大鼠肾阳虚模型，取其垂体制成超薄切片，进行电镜观察。结果 1.肾阳虚大鼠垂体内分泌细胞存在着不同程度的粗面内质网、高尔基体扩张、线粒体空化、细胞变形、核固缩等超微结构的伤。2.益气补肾中药能够减轻肾阳虚大鼠超微结构的损伤。结论 肾阳虚大鼠垂体内分泌细胞超微结构存在着不同程度的破坏，提示肾阳虚证与垂体功能密切相关，益气补肾中药可能通过调节细胞的蛋白质和能量代谢，减轻垂体的超微结构损伤，达到纠正肾阳虚证的效应。
垂体是机体内最重要的内分泌腺之一，它分泌多种激素，调控其他许多内分泌腺和器官的功能，并以神经和血管与下丘脑相连，因此垂体在神经与内分泌两大整合系统的相互关系中居枢纽地位。
, 百拇医药
近年来，随着对中医肾本质研究的逐步深入初步认为，肾阳虚证与下丘脑-垂体-靶腺轴的功能改变密切相关[1]，但有关其形态学，特别是超微结构的研究却未能相应跟上。为此本研究以大剂量糖皮质激素造成肾阳虚大鼠模型，观察益气补肾中药对肾阳虚大鼠垂体超微结构的影响，以便为进一步研究肾阳虚证的本质以及益气补肾中药的作用机理及肾虚证的治疗提供一些依据。
材料与方法
1 药物
醋酸可的松注射液购自上海第九制药厂，规格125 mg/5 ml，批号970901。
益气补肾中药配方为：附子、山萸肉、熟地、山药、菟丝子、肉苁蓉、仙灵脾、人参。上述中药购自河北省医药公司，按传统方法将中药浸泡1 hr文火煎2次，去渣合并、过滤、浓缩成含生药1.7 g/ml的煎剂，4℃保存备用。
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2 动物分组
雄性SD大鼠12只，体重250 g～280 g，由河北省实验动物中心提供。随机分为3组：正常对照组(简称正常组)、肾阳虚模型组(简称肾阳虚组)、肾阳虚+益气补肾中药组(简称中药组)。每组4只，分组常规饲养。
3 实验方法
3.1 模型复制和给药方法
正常组：0.9%的NaCl 0.3 ml后肢肌肉注射，每天1次，连续31 d。在注射生理盐水的同时，从第8 d开始用双蒸水灌胃，2 ml/只，每日1只，到实验结束，共24 d。
肾阳虚组：醋酸可的松混悬液充分混匀，按2.5 mg/100 g后肢肌肉注射，连续31 d。在注射醋酸可的松的同时，从第8 d开始用双蒸水灌胃，2 ml/只，每日1次，到实验结束，共24 d。
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中药组：醋酸可的松注射方法和用量同肾阳虚组，第8 d开始用益气补肾煎剂灌胃，用药剂量相当于人剂量的10倍，1 g/100 g/日，连续24 d。
3.2 电镜样品的制备和观察
注射醋酸可的松后第32 d将所有大鼠断头，迅速取出垂体，用4%的戊二醛前固定，1%的锇酸后固定，常规脱水、包埋，包埋后的样品块先制成半薄切片，在光镜下定位，选取相同的部位制作电镜切片，最后上日立H-500电镜观察。
结果
1 正常对照组
低倍电镜下观察可见各种垂体分泌细胞，细胞形态完整，结构清晰，含有各种大小不等、形态不一的分泌颗粒(图1)。根据细胞的形状，以及细胞内分泌颗粒的大小、形态，腺垂体细胞分为五种内分泌细胞：
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1.1 生长激素细胞
数量较多，分泌颗粒为圆形，个较大，分布于整个细胞质内，粗面内质网较丰富，线粒体圆形或椭圆形(图2)。
1.2 催乳激素细胞
细胞椭圆形，核偏于一侧，椭圆形，染色质均匀分布。细胞的一侧为非常发达的粗面内质网。细胞内分泌颗粒较大，为五种细胞中最大的，形态为圆形或不规则形(图3)。
1.3 促肾上腺皮质激素细胞
细胞数量较少，形态不规则，胞质密度低，粗面内质网少，分泌颗粒较少，直径较小(图4)。
1.4 促性腺激素细胞
细胞内有丰富的线粒体及粗面内质网，分泌颗粒中等大小，球形，有大小两种，电子密度高(图5)。
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1.5 促甲状腺激素细胞 细胞形态不规则，分泌颗粒较小且少，多分布于细胞质的外周部分，是各种细胞中颗粒最小的(图1)。见封三
2 肾阳虚组
低倍电镜下可见许多细胞变形，界限不清，许多核的形态变得不规则，出现核固缩。粗面内质网多处高度扩张，连成网状，有的甚至扩张成一个大池，线粒体空化(图6)。
图1 正常对照组低倍电镜图像 A 促肾上腺皮质激素细胞 T 促甲状腺激素细胞 G 生长激素细胞
图2 正常对照组生长激素细胞高倍电镜图像 S 分泌颗粒 N 细胞核 M 线粒体
图3 正常对照组催乳激素细胞高倍电镜图像 R 粗面内质网
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图4 正常对照组促肾上腺皮质激素细胞高倍电镜图像
图5 正常对照组促性腺激素细胞高倍电镜图像
图6 肾阳虚组低倍电镜图像 Gn 促性腺激素细胞 Gh 生长激素细胞 A 促肾上腺皮质激素细胞
高倍镜下进一步观察，可见细胞结构变化最大的为促性腺细胞，细胞内粗面内质网核糖体脱颗粒，扩张连成网状使细胞高度膨胀，高尔基体增多、扩张，细胞形态变得很不规则，核固缩(图7)见封四；其次是生长激素细胞，亦出现类似的超微结构改变，只是不如促性腺激素细胞严重(图6、图15)。促甲状腺激素及促肾上腺皮质激素细胞的超微结构亦有类似的改变，但改变的程度比生长激素细胞轻(图6、8)。催乳激素细胞在雄性大鼠垂体中很少，未见明显的超微结构改变。
3 中药组
低倍电镜下可见细胞形态正常，细胞界限、结构清晰，核形态规则，染色质均匀一致(图9)。高倍镜下虽亦见有些生长激素细胞(图10)及促性腺激素细胞(图11)，内粗面内质网尚有些扩张，但超微结构基本上与正常组类似。促甲状腺激素及促肾上腺皮质激素细胞(图12)亦与正常对照组类似，细胞超微结构基本保持正常。
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图7 肾阳虚组促性腺激素细胞高倍电镜图像 R 高度扩张的粗面内质网 Gi 扩张的高尔基体 N 固缩的细胞核
图8 肾阳虚组促肾上腺皮质激素细胞高倍电镜图像 M 肿胀的线粒体
图9 中药组低倍电镜图像 G 生长激素细胞
图10 中药组生长激素细胞高倍电镜图像
图11 中药组促性腺激素细胞高倍电镜图像
图12 中药组促肾上腺皮质激素细胞高倍电镜图像
讨论
随着中医肾本质研究的不断深入，有关学者越来越重视肾与下丘脑-垂体-靶腺轴的研究，通过大量的临床和实验研究，认为肾阳虚证患者存在着下丘脑-垂体-靶腺轴不同环节、不同程度的功能紊乱[2、3]。一些实验已经证明肾阳虚大鼠的血浆激素水平的下降与垂体前叶功能受损有关[4]。我们的实验则从超微结构的角度，进一步证明肾阳虚大鼠垂体前叶五种内分泌细胞，除催乳激素细胞因雄性大鼠很少，未见明显变化以外(图13、图14)，其他四种内分泌细胞-生长激素细胞、促性腺激素细胞、促甲状腺激细胞、促肾上腺皮质激素细胞都有不同程度的粗面内质网扩张，线粒体肿胀、空化，细胞变形，核变形、固缩，而益气补肾中药能够改善这种超微结构的损伤。
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超微病理学认为，具有分泌功能或蛋白质合成旺盛的细胞粗面内质网较多，并多呈平行片层排列，粗面内质网池也多呈狭隙状。当细胞受到缺氧、中毒等各种损伤时，粗面内质网和滑面内质网的形态改变表现为池的非特异性扩张和裂解。在损伤较轻时，内质网较轻度扩张，粗面内质网膜上的核糖体常部分脱落于胞浆中；当细胞损伤较重时，内质网高度扩张并裂解为大泡状。与此同时，高尔基体和线粒体等其他细胞器也发生类似的扩张[5]。从细胞的结构与功能分析，出现这些形态变化的原因可能有两个：第一，缺氧等细胞损伤首先使敏感的细胞器线粒体肿胀、空化，使线粒体的氧化磷酸化作用受到影响，致使钠泵失效，Na+和水分进入细胞的内质网、高尔基体，使内质网扩张、脱颗粒，高尔基体扩张。第二，细胞合成或分泌蛋白质的过程受阻，排出困难而使分泌物堆积在这些细胞器中，引起其扩张或肿胀。但不管哪种原因，最终都将导致蛋白质的分泌减少，细胞功能的下降。因此，垂体内分泌细胞超微结构的改变，必然使其功能受到严重的影响，特别是各种多肽类促激素的合成，主要是通过粗面内质网完成的，这些细胞的粗面内质网扩张和脱颗粒，说明其蛋白质合成的精确性降低，酶的结构和活性发生种种改变，激素的合成减少。再加上线粒体的肿胀、核的固缩，影响了氧化磷酸化和DNA的转录复制，致使能量供应不足，DNA的转录复制功能降低，而导致整个细胞的功能低下。本研究的结果说明肾阳虚与垂体细胞超微结构的改变及其细胞功能下降有关，益气补肾中药对肾阳虚垂体超微结构的损伤有明显的改善作用，能够恢复其细胞功能，表明益气补肾中药能够通过影响垂体的形态结构，进而调整肾阳虚的种种表征，使机体恢复正常状态。实验中还发现，五种内分泌细胞超微结构损伤程度依次为促性腺激素细胞、生长激素细胞、促甲状腺激素和促肾上腺皮质激素细胞。这似乎与中医的肾藏精，主生殖，主生长发育的功能相吻合。由此认为，垂体的各种内分泌机能与中医肾的功能不无关系。
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图13 肾阳虚组催乳激素细胞高倍电镜图像
图14 中药组催乳激素细胞高倍电镜图像
图15 肾阳虚组生长激素细胞高倍电镜图像
作者简介：宋春风，女，35岁，副教授(在读博士)，河北医科大学中西医结合基础理论研究室。主要从事肾阳虚证的本质。
参考文献
[1] 沈自尹.肾阳虚证的定位研究.中国中西医结合杂志,1997,17(1)：50-52.
[2] 钟历勇，沈自尹，蔡定芳，等.补肾健脾活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及CRF基因表达的影响.中国中西医结合杂志,1997,17(1)：39-41.
[3] 李勇枝.中医肾虚证研究进展.中国中医基础医学杂志，1996,2(4)：56-60.
[4] 秦路平，张家庆，石汉平，等.蛇床子香豆素对肾阳虚模型大鼠腺垂体肾上腺皮质轴功能的影响.中国中西医结合杂志,1997,17(4)：227-229.
[5] 董郡主编.病理学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996,5-26.
(收稿日期 1999—03—06 修回日期 1999—04—03), 百拇医药
单位：河北医科大学 河北 石家庄 050017
关键词：益气补肾；肾阳虚；大鼠；垂体；超微结构
中国中医基础医学杂志991009 摘 要：目的 探讨肾阳虚的本质及益气补肾中药的作用机理。方法 以大量醋酸可的松造成大鼠肾阳虚模型，取其垂体制成超薄切片，进行电镜观察。结果 1.肾阳虚大鼠垂体内分泌细胞存在着不同程度的粗面内质网、高尔基体扩张、线粒体空化、细胞变形、核固缩等超微结构的伤。2.益气补肾中药能够减轻肾阳虚大鼠超微结构的损伤。结论 肾阳虚大鼠垂体内分泌细胞超微结构存在着不同程度的破坏，提示肾阳虚证与垂体功能密切相关，益气补肾中药可能通过调节细胞的蛋白质和能量代谢，减轻垂体的超微结构损伤，达到纠正肾阳虚证的效应。
垂体是机体内最重要的内分泌腺之一，它分泌多种激素，调控其他许多内分泌腺和器官的功能，并以神经和血管与下丘脑相连，因此垂体在神经与内分泌两大整合系统的相互关系中居枢纽地位。
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近年来，随着对中医肾本质研究的逐步深入初步认为，肾阳虚证与下丘脑-垂体-靶腺轴的功能改变密切相关[1]，但有关其形态学，特别是超微结构的研究却未能相应跟上。为此本研究以大剂量糖皮质激素造成肾阳虚大鼠模型，观察益气补肾中药对肾阳虚大鼠垂体超微结构的影响，以便为进一步研究肾阳虚证的本质以及益气补肾中药的作用机理及肾虚证的治疗提供一些依据。
材料与方法
1 药物
醋酸可的松注射液购自上海第九制药厂，规格125 mg/5 ml，批号970901。
益气补肾中药配方为：附子、山萸肉、熟地、山药、菟丝子、肉苁蓉、仙灵脾、人参。上述中药购自河北省医药公司，按传统方法将中药浸泡1 hr文火煎2次，去渣合并、过滤、浓缩成含生药1.7 g/ml的煎剂，4℃保存备用。
, 百拇医药
2 动物分组
雄性SD大鼠12只，体重250 g～280 g，由河北省实验动物中心提供。随机分为3组：正常对照组(简称正常组)、肾阳虚模型组(简称肾阳虚组)、肾阳虚+益气补肾中药组(简称中药组)。每组4只，分组常规饲养。
3 实验方法
3.1 模型复制和给药方法
正常组：0.9%的NaCl 0.3 ml后肢肌肉注射，每天1次，连续31 d。在注射生理盐水的同时，从第8 d开始用双蒸水灌胃，2 ml/只，每日1只，到实验结束，共24 d。
肾阳虚组：醋酸可的松混悬液充分混匀，按2.5 mg/100 g后肢肌肉注射，连续31 d。在注射醋酸可的松的同时，从第8 d开始用双蒸水灌胃，2 ml/只，每日1次，到实验结束，共24 d。
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中药组：醋酸可的松注射方法和用量同肾阳虚组，第8 d开始用益气补肾煎剂灌胃，用药剂量相当于人剂量的10倍，1 g/100 g/日，连续24 d。
3.2 电镜样品的制备和观察
注射醋酸可的松后第32 d将所有大鼠断头，迅速取出垂体，用4%的戊二醛前固定，1%的锇酸后固定，常规脱水、包埋，包埋后的样品块先制成半薄切片，在光镜下定位，选取相同的部位制作电镜切片，最后上日立H-500电镜观察。
结果
1 正常对照组
低倍电镜下观察可见各种垂体分泌细胞，细胞形态完整，结构清晰，含有各种大小不等、形态不一的分泌颗粒(图1)。根据细胞的形状，以及细胞内分泌颗粒的大小、形态，腺垂体细胞分为五种内分泌细胞：
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1.1 生长激素细胞
数量较多，分泌颗粒为圆形，个较大，分布于整个细胞质内，粗面内质网较丰富，线粒体圆形或椭圆形(图2)。
1.2 催乳激素细胞
细胞椭圆形，核偏于一侧，椭圆形，染色质均匀分布。细胞的一侧为非常发达的粗面内质网。细胞内分泌颗粒较大，为五种细胞中最大的，形态为圆形或不规则形(图3)。
1.3 促肾上腺皮质激素细胞
细胞数量较少，形态不规则，胞质密度低，粗面内质网少，分泌颗粒较少，直径较小(图4)。
1.4 促性腺激素细胞
细胞内有丰富的线粒体及粗面内质网，分泌颗粒中等大小，球形，有大小两种，电子密度高(图5)。
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1.5 促甲状腺激素细胞 细胞形态不规则，分泌颗粒较小且少，多分布于细胞质的外周部分，是各种细胞中颗粒最小的(图1)。见封三
2 肾阳虚组
低倍电镜下可见许多细胞变形，界限不清，许多核的形态变得不规则，出现核固缩。粗面内质网多处高度扩张，连成网状，有的甚至扩张成一个大池，线粒体空化(图6)。
图1 正常对照组低倍电镜图像 A 促肾上腺皮质激素细胞 T 促甲状腺激素细胞 G 生长激素细胞
图2 正常对照组生长激素细胞高倍电镜图像 S 分泌颗粒 N 细胞核 M 线粒体
图3 正常对照组催乳激素细胞高倍电镜图像 R 粗面内质网
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图4 正常对照组促肾上腺皮质激素细胞高倍电镜图像
图5 正常对照组促性腺激素细胞高倍电镜图像
图6 肾阳虚组低倍电镜图像 Gn 促性腺激素细胞 Gh 生长激素细胞 A 促肾上腺皮质激素细胞
高倍镜下进一步观察，可见细胞结构变化最大的为促性腺细胞，细胞内粗面内质网核糖体脱颗粒，扩张连成网状使细胞高度膨胀，高尔基体增多、扩张，细胞形态变得很不规则，核固缩(图7)见封四；其次是生长激素细胞，亦出现类似的超微结构改变，只是不如促性腺激素细胞严重(图6、图15)。促甲状腺激素及促肾上腺皮质激素细胞的超微结构亦有类似的改变，但改变的程度比生长激素细胞轻(图6、8)。催乳激素细胞在雄性大鼠垂体中很少，未见明显的超微结构改变。
3 中药组
低倍电镜下可见细胞形态正常，细胞界限、结构清晰，核形态规则，染色质均匀一致(图9)。高倍镜下虽亦见有些生长激素细胞(图10)及促性腺激素细胞(图11)，内粗面内质网尚有些扩张，但超微结构基本上与正常组类似。促甲状腺激素及促肾上腺皮质激素细胞(图12)亦与正常对照组类似，细胞超微结构基本保持正常。
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图7 肾阳虚组促性腺激素细胞高倍电镜图像 R 高度扩张的粗面内质网 Gi 扩张的高尔基体 N 固缩的细胞核
图8 肾阳虚组促肾上腺皮质激素细胞高倍电镜图像 M 肿胀的线粒体
图9 中药组低倍电镜图像 G 生长激素细胞
图10 中药组生长激素细胞高倍电镜图像
图11 中药组促性腺激素细胞高倍电镜图像
图12 中药组促肾上腺皮质激素细胞高倍电镜图像
讨论
随着中医肾本质研究的不断深入，有关学者越来越重视肾与下丘脑-垂体-靶腺轴的研究，通过大量的临床和实验研究，认为肾阳虚证患者存在着下丘脑-垂体-靶腺轴不同环节、不同程度的功能紊乱[2、3]。一些实验已经证明肾阳虚大鼠的血浆激素水平的下降与垂体前叶功能受损有关[4]。我们的实验则从超微结构的角度，进一步证明肾阳虚大鼠垂体前叶五种内分泌细胞，除催乳激素细胞因雄性大鼠很少，未见明显变化以外(图13、图14)，其他四种内分泌细胞-生长激素细胞、促性腺激素细胞、促甲状腺激细胞、促肾上腺皮质激素细胞都有不同程度的粗面内质网扩张，线粒体肿胀、空化，细胞变形，核变形、固缩，而益气补肾中药能够改善这种超微结构的损伤。
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超微病理学认为，具有分泌功能或蛋白质合成旺盛的细胞粗面内质网较多，并多呈平行片层排列，粗面内质网池也多呈狭隙状。当细胞受到缺氧、中毒等各种损伤时，粗面内质网和滑面内质网的形态改变表现为池的非特异性扩张和裂解。在损伤较轻时，内质网较轻度扩张，粗面内质网膜上的核糖体常部分脱落于胞浆中；当细胞损伤较重时，内质网高度扩张并裂解为大泡状。与此同时，高尔基体和线粒体等其他细胞器也发生类似的扩张[5]。从细胞的结构与功能分析，出现这些形态变化的原因可能有两个：第一，缺氧等细胞损伤首先使敏感的细胞器线粒体肿胀、空化，使线粒体的氧化磷酸化作用受到影响，致使钠泵失效，Na+和水分进入细胞的内质网、高尔基体，使内质网扩张、脱颗粒，高尔基体扩张。第二，细胞合成或分泌蛋白质的过程受阻，排出困难而使分泌物堆积在这些细胞器中，引起其扩张或肿胀。但不管哪种原因，最终都将导致蛋白质的分泌减少，细胞功能的下降。因此，垂体内分泌细胞超微结构的改变，必然使其功能受到严重的影响，特别是各种多肽类促激素的合成，主要是通过粗面内质网完成的，这些细胞的粗面内质网扩张和脱颗粒，说明其蛋白质合成的精确性降低，酶的结构和活性发生种种改变，激素的合成减少。再加上线粒体的肿胀、核的固缩，影响了氧化磷酸化和DNA的转录复制，致使能量供应不足，DNA的转录复制功能降低，而导致整个细胞的功能低下。本研究的结果说明肾阳虚与垂体细胞超微结构的改变及其细胞功能下降有关，益气补肾中药对肾阳虚垂体超微结构的损伤有明显的改善作用，能够恢复其细胞功能，表明益气补肾中药能够通过影响垂体的形态结构，进而调整肾阳虚的种种表征，使机体恢复正常状态。实验中还发现，五种内分泌细胞超微结构损伤程度依次为促性腺激素细胞、生长激素细胞、促甲状腺激素和促肾上腺皮质激素细胞。这似乎与中医的肾藏精，主生殖，主生长发育的功能相吻合。由此认为，垂体的各种内分泌机能与中医肾的功能不无关系。
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图13 肾阳虚组催乳激素细胞高倍电镜图像
图14 中药组催乳激素细胞高倍电镜图像
图15 肾阳虚组生长激素细胞高倍电镜图像
作者简介：宋春风，女，35岁，副教授(在读博士)，河北医科大学中西医结合基础理论研究室。主要从事肾阳虚证的本质。
参考文献
[1] 沈自尹.肾阳虚证的定位研究.中国中西医结合杂志,1997,17(1)：50-52.
[2] 钟历勇，沈自尹，蔡定芳，等.补肾健脾活血三类复方对下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴及CRF基因表达的影响.中国中西医结合杂志,1997,17(1)：39-41.
[3] 李勇枝.中医肾虚证研究进展.中国中医基础医学杂志，1996,2(4)：56-60.
[4] 秦路平，张家庆，石汉平，等.蛇床子香豆素对肾阳虚模型大鼠腺垂体肾上腺皮质轴功能的影响.中国中西医结合杂志,1997,17(4)：227-229.
[5] 董郡主编.病理学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996,5-26.
(收稿日期 1999—03—06 修回日期 1999—04—03), 百拇医药